Abstract
De Bacillus-arter innehåller grenad kedja och omättade fettsyror (FA) med olika lägen för metylförgrening (iso eller Anteiso) och av dubbelbindningen. Förändringar i FA sammansättning spelar en avgörande roll i anpassningen av bakterier till sin omgivning. Dessa ändringar innebär en förändring i förhållandet iso kontra Anteiso grenade FA, och andelen omättade FAs relativt mättad FA, med dubbelbindningar som skapas vid specifika positioner. Exakt identifiering av FA profil är nödvändigt att förstå anpassningsmekanismer Bacillus arter.
Många av FAs från Bacillus inte är kommersiellt tillgängliga. Den föreslagna strategin häri identifierar FA genom att kombinera information om uppehållstiden (genom beräkning av motsvarande kedjelängd (ECL)) med masspektra av tre typer av FA-derivat: fettsyrametylestrar (FAME), 4,4-dimetyl oxazolin derivat (DMOX), och3-pyridylcarbinyl ester (pikolinyl). Denna metod kan identifiera de FA utan behovet att rena det okända FAs.
Jämföra kromatografiska profiler av FAME framställs från Bacillus cereus med en kommersiell blandning av standarder gör det möjligt att identifiera rak mättad FA, beräkningen av ECL, och hypoteser om identiteten på den andra FA. FAMEs av grenade mättade FAs, iso- eller Anteiso, visa ett konstant negativt förskjutning i ECL, jämfört med linjära mättade FAs med samma antal kolatomer. FAMEs av omättade FAs kan detekteras genom massan av deras molekylära joner, och resulterar i en positiv förändring i ECL jämfört med de motsvarande mättade FAs.
Förgrenings position FA och den dubbelbindningspositionen för omättade FAs kan identifieras genom den elektron jonisering masspektra för pikolinyl och DMOX derivat. Detta tillvägagångssätt identifierar alla okända mättade grenenEd FA, omättad rak FA och omättade grenade FA från B. cereus extraktet.
Introduction
Fettsyrametylester (FAME) gaskromatografi (GC) är en viktig metod för lipid karakterisering. Den separerar snabbt och kvantifierar de olika fettsyrorna (FAS) hos ett prov efter en kort extraktionssteget. Derivat av metylestrar är mycket volatil, stabil och inert mot den kromatografiska kolonnen, varigenom man undviker tailing toppar. Deras identifiering är ganska enkelt när provet består av välkända FA eftersom kromatografiska profiler antingen publiceras eller jämfört med standard. Dessutom är den upprepad injicering av kalibreringsstandarder för kvantifiering av olika FAs krävs inte, med tanke på deras nästan konstant svar på flamjoniseringsdetektion (FID) 1.
Förutom FID ger masspektrometri (MS) upptäckt en kompletterande mängd information för att bekräfta FAME. Men när FAME laddas med elektron jonisering (EI), de resulterande spektra det inte alltid möjligt för the identifiering av FA fin struktur. Till exempel, förgrening ställning (dvs. en förgrenad metylgrupp) är svår att förutsäga eftersom de diagnostiska jonerna är svåra att upptäcka en och den karakteristiska förändringen i måljonens överflöd är maskinberoende, vilket förhindrar användningen av biblioteken 2 masspektra. En annan utmaning ligger i att identifiera dubbelbindningen ståndpunkt eftersom EI orsakar dubbelbindning migration. Således kan FA isomerer med varierande dubbelbindning positioner inte särskiljas genom deras masspektra. Lyckligtvis har andra verktyg utvecklats för FA identifiering. Till exempel kan närvaron och läget av förgrening eller av dubbelbindningar i FA vara conjectured genom att beräkna den ekvivalenta kedjelängden (ECL) 3.
Andra derivatiseringsreaktioner metoder resultera i olika masspektra, beroende på placeringen av en dubbelbindning eller en grenad metylgrupp. 4,4-dimetyl oxazolin-derivat (DMOX) 4 tillåter EASy identifiering av positionen för monoomättade fettsyradubbelbindningar. 3-pyridylcarbinyl ester (pikolinyl ester) derivat möjliggöra entydig identifiering av platsen för metylförgrenade FA 5. Kombinera kromatografiska retention (ECL) och mass-spektra (DMOX och pikolinyl) uppgifter gör det möjligt att identifiera de flesta FA utan att behöva använda komplicerade metoder för rening, som krävs för kärnmagnetisk resonans (NMR) spektrum, den uncontestable metod för strukturell karakterisering en .
Bakterier av släktet Bacillus, vilket inkluderar vissa människor och djur patogener, kan kolonisera vitt skilda nischer och därför stor spridning i miljön 6. Bland Bacillus genus, är FA sammansättning påverkas av den ekologiska nisch av arterna med modulationer i FA mönster för att anpassa sig till ett brett spektrum av miljöförändringar (t.ex. tillväxtmedium, temperatur,pH, etc.) 7-9. På grund av den relativa homogenitet FA mönster över arter av släktet Bacillus under tillväxt i standardiserade förhållanden, är bestämning av FA sammansättning en av de viktigaste kriterierna för att definiera de Bacillus-arter. En unik egenskap hos Bacillus släktet är det överflöd av grenade FA innehåller 12-17 kolatomer 10-12 med förhållandet mellan iso och Anteiso isomerer vara en avgörande faktor för anpassning till miljöförhållanden. Bacillus-arter anpassa sig även till miljöfluktuationer genom att förändra proportionen av omättade fettsyror. I vissa arter, såsom Bacillus cereus, två fettsyradesaturaser skapar dubbelbindningar i olika positioner i alkylkedjan 13 med olika roller i anpassningen 9. Exemplet med Bacillus släktet illustrerar vikten av exakt identifiera dubbelbindningen position och FA förgrening. Samlativt, har identifieringen av Bacillus FA mönster flera användbara applikationer. Häri föreslår vi en ny GC-MS metod för Bacillus FA mönster identifiering som övervinner de inneboende begränsningarna hos en klassisk GC-MS-analys.
kan användas detta nytänkande direkt på rå biologiskt material, och består av en kombination av befintliga tekniker: information om retentionstider (ECL) och mass-spektra av olika FAs derivat (FAME, DMOX och pikolinyl-ester).
Vi använder följande FA nomenklaturen. i, a, och n anger iso, grenad Anteiso metyl och rakkedjig fettsyra, respektive. Omättade FAs namngavs av C: d där C är antalet kolatomer i fettsyra och d är antalet dubbelbindningar. Δ x indikerar positionen för dubbelbindningen, där dubbelbindningen är belägen på x: te kol-kol-bindning, räknat från karboxylsyran änden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bakteriekulturer
- Förbereda en matta av bakterier (Bacillus cereus-stam ATCC 14579) genom att sprida 100 | il av en övernattskultur av stammen inkuberades vid 30 ° C i LB (Luria-Bertani-medium), över ytan av en platta av LB-agarmedium. Inkubera plattan över natten vid 30 ° C.
2. ECL: Motsvarar Kedjelängd
- Beräkna ECL enligt följande:
med:
Jag, det lösta ämnet av intresse;
n, antalet kolatomer i rakkedjig mättad fettsyrametylester eluering innan löst ämne I;
n + 1, antalet kolatomer i rakkedjig mättad fettsyrametylester eluering efter löst ämne I;
RTI, Rtn, Rt (n + 1) retentionstiderna ryktet toppar som beskrivits ovan.
OBS: Erhåll retentionstiderna för rakkedjiga mättade fettsyror metylestrar genom injektion av en blandning av standarder (BAME).
med: 3. FAME Beredning och analys
- I syfte att erhålla lipid fettsyror, skörd bakterieceller genom att skrapa kolonier från agarplattan och överföra 40 mg (färsk vikt, motsvarande 10 9 livsdugliga celler) av bakterier in i ett 10 ml provrör med skruvlock och PTFE-tätningar.
- Utför transesterifiering via esterlänkmetoden 14,15 nedan.
- Tillsätt 5 ml 0,2 M KOH i metanol till de färska bakterieceller och inkubera vid 37 ° C under 1 timme. Denna reaktion består av alkalisk metanolys, bryta esterlänk i lipiden och producera fettsyrametylestrar.
- Tillsätt 1 ml 1 M ättiksyra för att sänka pH till 7,0. Kontrollera pH med pH-testremsor.
- Tillsätt 3 ml hexan för att extrahera FAME.
- Överför supernatanten (organisk fas) till rena rör och koncentrera genom förångning vid rumstemperatur under ett kontinuerligt flöde av kväve för erhållande av cirka 200 | j, lextrakt. Överför provet till en GC flaskan med insatsen.
- Injicera extrakt i en gaskromatografi-masspektrometri (GC-MS) -system.
4. GC / MS Villkor
- Injicera FAME prov till en GC-MS instrument utrustat med en kapillärkolonn ZB-vax (längd, 30 m, diameter, 0,25 mm, filmtjocklek, 0,25 um).
- Ställa in insprutningsöppningen (i splitless mode) temperaturen till 250 ° C. Använda helium som bärargas, med en linjär hastighet på 37 cm / sek. Hålla ugnstemperaturen vid 50 ° C under 1 min, öka till 190 ° C med en hastighet av 20 ° C / min, och öka ytterligare till en slutlig temperatur av 230 ° C med en hastighet av 2 ° C / min.
- För MS, spela in masspektra med elektron jonisering (EI) vid 70 eV, och ställa förvärvet av den totala jonströmmen mellan 50 och 400 atommassenheter (amu) (2 skanningar / sek).
- Vid behov injicera DMOX och pikolinyl derivat under samma villkor utomt ugnen temperaturprogram enligt följande:
DMOX: 50 ° C (1 min), 20 ° C / min tills 210 ° C och 2 ° C / min tills 240 ° C (5 min);
Pikolinyl: 6 ° C (1 min), 20 ° C / min tills 220 ° C och 2 ° C / min tills 250 ° C (20 min).
5. pikolinyl Ester Beredning av FAME 16
- Indunsta FAME extraktet från avsnitt 3 med ett flöde av kväve (minst 10 mg torrt material) och lös i 1 ml torr diklormetan.
- Bered en 1,0 M lösning av kalium-ter t-butoxid i tetrahydrofuran.
- Tillsätt FAME extrakt och 0,2 ml 3-pyridinmetanol till 0,1 ml lösning som gjorts i steg 5,2.
- Värm lösningen vid 40 ° C under 30 min i en sluten ampull.
- Efter kylning till rumstemperatur, tillsätt renat avjoniserat vatten (2 ml, se Material tabell) och hexan (4 ml). Blanda med en virvel, tillåter fas för att separera och samla in den organiska fasen.
- dry den genom att lägga vattenfritt natriumsulfat tills den organiska fasen är helt klart. Överföra den till ett rent rör. Indunsta därefter till 200 | j, l. Överför provet till en GC flaskan med insatsen.
6. DMOX Beredning av FAME 17
- Indunsta FAME extraktet från avsnitt 3 med ett flöde av kväve (åtminstone 10 mg torrt material).
- Till FAME torrextrakt, tillsätt 250 mg av 2-amino-2-metyl-1-propanol. Spola kärlet med kvävgas, tillsätt en propp, och placera den i ett värmeblock under natten vid 190 ° C.
- Efter kylning till rumstemperatur, tillsätt 3 ml diklormetan till röret, och 5 ml renat avjoniserat vatten (Se Material tabell).
- Skaka för fasseparation och sedan ta bort vattenfasen.
- Tvätta den organiska fasen med 5 ml vatten. Skaka för fasseparation och sedan ta bort vattenfasen.
- Torka genom att tillsätta vattenfritt natriumsulfat tills den organiska fasen är helt klart ochöverföra den till ett rent rör. Indunsta under en ström av kväve tills de når en volym av 200 | il. Överför provet till en GC flaskan med insatsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Strategin att FA identifiering från bakterieceller presenteras i Figur 1. Varje steg ger kompletterande spektral information eller information om kromatografisk retention. Steg 1 består av preliminär FA identifiering med hjälp av en standardlösning. Steg 2 möjliggör för tolkning av FAME EI spektra och deras ECL, i syfte att preliminärt identifiera produkterna. Steg 3 identifierar exakt förgrenings läge i grenkedjig-FA. Slutligen steg 4 identifierar den exakta positionen för dubbelbindningar i omättade FAs.
FAME och ECL
Den BAME blandning tillät oss att identifiera en rad rakkedjiga mättade fettsyror (N12 på n17) och vissa metylförgrenade fettsyra (I15, A15, I16, I17). Men var mycket få FA specifik för B. cereus upptäckts i vårt urval, motiverar development av identifieringsmetoden som beskrivs nedan.
Oavsett kedjelängd, grenade mättade FA (iso eller Anteiso) av en homolog serie (dvs en serie av föreningar med samma allmänna formel) uppvisar en konstant förskjutning i ECL jämfört med den raka mättade FA har samma antal kol i sin kol-kedjan. Denna förskjutning, som kallas fraktionerad kedjelängd (FCL), tillåter identifiering av FAs i en homolog serie. Till exempel, iso-FA (betecknas med prefixet "I") har en FCL värde på -0,48, medan Anteiso FA (betecknade med prefixet "A") har en FCL av -0,33. Det är då lätt att identifiera en I14 och I13 med en ECL av 13,52 och 12,52, respektive, och en A13 och A15 med en ECL av 12,67 och 14,66, respektive.
Tabell 1 visar ECLS för var och en av FA detekterats i vårt urval. Retentionstider förutsägaed för iso och Anteiso serien, tillsammans med MS-spektra erhölls med FAME, tillät oss att identifiera alla de grenade kedje-FA från vårt urval. Sådan identifiering i detta steg var trevande, men bekräftades senare av EI spektra som erhållits från pikolinyl FAs derivat.
FAMEs med ECLS som inte motsvarar den iso eller Anteiso skift omättad, rak eller grenad kedja FA, såsom indikeras genom massan av deras molekylära jonen. Omättade FA visar en positiv förändring i ECL jämfört med motsvarande mättade FA. Spectra från DMOX derivat i kombination med spektra från pikolinyl derivat för grenade FA, möjliggöra identifiering av dubbelbindning läge.
Sådana derivatisering metoder är lämpliga för FA identifiering endast när Elueringsordningen behålls, som visas för de tre derivatblandningar (dvs FAME, DMOX och pikolinyl) i figur2 under flera 16: 1 FAs. Detta tillvägagångssätt medger insamling av kompletterande spektral information av en topp med hjälp av 3 derivatisering metoder som kan kombineras för att identifiera FA struktur. Inga skillnader i elueringsordningen observerades mellan de 3-derivat, även om retentionstiderna och ugnstemperaturer var olika.
Pikolinyl estrar av iso och Anteiso metyl grenkedjig mättad fettsyra
Spektra erhålls genom EI bekräfta närvaron av metyl- grenkedjiga FAs. Faktum är de molekylära jonerna har m / z som motsvarar mättade FAs. Vi observerade en jon serie med ett gap av 14 massenheter (amu) som motsvarar en förlust av en metylengrupp, utom i området för förgreningspunkten där jon motsvarande den substituerade kolatomen saknas. Vi observerar då en lucka på 28 amu mellan de två joner som motsvarar fragment som skapats före ochefter den grenade kol. Figur 3 visar spektrumet för I16 med de diagnostiska joner (304 och 332) som visar den gren plats.
DMOX av rakkedjiga omättade fettsyror
Figur 2 visar fem olika toppar i samband med 16: 1 fettsyra. De två första topparna har ECL-värden <16. Vi drar slutsatsen att deras struktur är verkligen grenad. Identifieringen av dessa föreningar kräver tolkning av masspektra som produceras av DMOX och pikolinyl esterderivat. Tre toppar som har ECL> 16 match monounsaturated rakkedjiga fettsyror. DMOX derivat masspektra visar diagnostiska joner som identifierar positionen för dubbelbindningen av dessa föreningar. I figur 4 kan vi se en lucka på 12 amu jon mellan 196 och 208 indikerar närvaron av dubbelbindningen med kol 8 i N16: 1 Δ
DMOX och pikolinyl masspektra av metyl grenkedjig monounsatured fettsyror
Figur 6 visar spektra av DMOX och pikolinyl esterderivat, som används för att bestämma strukturen av I16: 1 Δ 9 FA. Positionen förförgrening indikeras av ett mellanrum på 28 amu för båda derivaten. Ett gap av 12 amu för DMOX och 26 för pikolinyl ester identifierar dubbelbindningen läget, såsom visas i figur 6.
Identifiering av fettsyrorna och diagnostiska joner
Tabell 1 visar de olika fettsyror som identifierats med motsvarande diagnostiska jonerna, i Bacillus cereus ATCC 14579 odlas vid 30 ° C. Dessa diagnostiska joner identifiera positionerna av metyl-förgrening och dubbelbindningar på kolkedjan för DMOX och pikolinyl esterderivat, som ger kompletterande strukturell information. De två metoderna är verkligen kompletterar varandra, som diagnostiska joner är ibland lättare att observera med DMOX derivat, och vid andra tillfällen lättare att observera med pikolinyl derivat.
src = "/ filer / ftp_upload / 54960 / 54960fig1.jpg" />
Figur 1: Strategi för identifiering av fettsyror i Bacillus cereus.
De successiva steg genererar information om retentionstider (ECL), på masspektra FAME av DMOX och av pikolinyl ester visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Jämförelse av kromatografiska profiler för olika 16: 1-fettsyror som detekterats i Bacillus cereus.
(A) FAME derivat (molekyljon extraherades vid m / z 268); (B) DMOX derivat (molekyljon extraherades vid m / z 307); (C) pikolinyl derivat (molekylär jon extraheras vid m / z 345).iles / ftp_upload / 54960 / 54960fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: I16 pikolinyl derivat masspektrum som alstras av elektron jonisering.
Joner vid m / z 151 och m / z 164 indikera närvaron en pikolinyl derivat av fettsyra. Molekyljonen vid m / z 347 identifieras som en isomer av palmitinsyra. Närvaron av en lucka på 28 amu mellan jonen vid m / z 304 och m / z 332 är indikativ för I16. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: N16: en Δ 8 DMOX derivat masspektrum som alstras av elektronjonisering.
Jonen vid m / z 126 indikerar en DMOX derivat, är m / z 307 molekyljonen av 16: 1 DMOX och närvaron av en lucka på 12 amu mellan joner vid m / z 196 och m / z 208 identifierar platsen av dubbelbindning på kol 8. klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: N16: en Δ 5 DMOX derivat masspektrum som alstras av elektron jonisering.
Jon vid m / z 126 indikerar en DMOX derivat och m / z 307 är den molekylära jonen av 16: 1 DMOX. Den intensiva m / z 153 jon är kännetecknande för en dubbelbindning belägen på kol 5. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: DMOX (överst) och pikolinyl (botten) jämförelse av I16: 1Δ 9 spektra.
I båda fallen gapet på 28 amu indikerar positionen av metyl förgrening. Dubbelbindningen plats kan härledas genom en lucka på 12 amu och 26 amu för DMOX och pikolinyl derivat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| förmodade föreningar | Molekylär jon (m / z) FAME; DMOX; pikolinyl | RT | ECL | bekräftad identifiering | Diagnostiska jonerna DMOX | Diagnostiska jonerna pikolinyl |
| i12 | 214, 253; 291 | 7,93 | ingen hänvisning | i12 | [276 (15); 262 (0); 248 (15)] mb | |
| n12 | 214, 253; 291 | 8,21 | 12,00 | n12 | [276 (10), 262 (20); 248 (20)] mb | |
| I13 | 228; 267; 305 | 8,53 | 12,5 | I13 | [290 (15); 276 (0); 262 (48)] mb | |
| a13 | 228; 267; 305 | 8,64 | 12,67 | a13 | [276 (48); 262 (0); 248 (65)] mb | |
| I14 | 242; 281; 319 | 9,24 | 13,52 | I14 | [304 (20); 276 (45) 290 (0)] mb | |
| N14 | 242; 281; 319 | 9,60 | 14,00 | N14 | [304 (7); 290 (17); 276 (17)] mb | |
| i15 | 256; 295; 333 | 10,06 | 14,51 | i15 | [318 (20); 314 (0); 290 (50)] mb | |
| a15 | 256; 295; 333 | 10,19 | 14,66 | a15 | [304 (30); 290 (tr); 276 (62)] mb | |
| N15 | 256; 295; 333 | 10,49 | 15,00 | N15 | [318 (5); 304 (13); 290 (18)] mb | |
| I16 | 270; 309; 347 | 11,04 | 15,5 | I16 | [332 (18); 318 (tr); 304 (42)] mb | |
| metylförgrenade 16: 1 | 268; 307; 345 | 11,19 | 15,64 | I16: 1Δ 5 | [152 (2); 153 (10)] db [292 (3); 278 (tr); 264 (2)] mb | |
| metylförgrenade 16: 1 | 268; 307; 345 | 11,40 | 15,83 | I16: 1 Δ 9 | [210 (3); 222 (3)] db [292 (12); 278 (tr); 264 (40)] mb | |
| N16 | 270; 309; 347 | 11,59 | 16,00 | N16 | [332 (5); 318 (15); 304 (15)] mb | |
| 16: 1 | 268; 307; 345 | 11,78 | 16,14 | N16: en Δ 5 | [152 (2), 153 (10)] db | |
| 16: 1 | 268; 307; 345 | 11,94 | 16,24 | N16: en Δ 8 | [196 (5); 208 (3)] db | |
| 16: 1 | 268; 307; 345 | 12,00 | 16,31 | N16: 1Δ 9 | [210 (3); 222 (3)] Db | |
| 16: 2 | 266; 305; 343 | 12,18 | 16,44 | N16: 2 Δ 5, Δ 9 | [152 (2), 153 (12)] db [208 (1), 220 (2)] db | |
| i17 | 284; 323; 361 | 12,25 | 16,5 | i17 | [346 (20); 332 (tr); 318 (35)] mb | |
| metylförgrenade 17: 1 | 282, 321; 359 | 12,43 | 16,64 | i17: 1Δ 5 | [152 (2), 153 (10)] db | [344 (10), 316 (5)] mb |
| a17 | 284; 323; 361 | 12,47 | 16,66 | a17 | [332 (30); 318 (0); 304 (52)] mb | |
| metylförgrenade 17: 1 | 282, 321; 359 | 12,57 | 16,74 | i17: 1Δ 8 | [196 (2); 208 (2)] db | [344 (10), 316 (5)] mb |
| metylförgrenade 17: 1 | 282, 321; 359 | 12,64 | 16,79 | i17: 1Δ 9 | [210 (3); 222 (3)] db | |
| metylförgrenade 17: 1 | 282, 321; 359 | 12,70 | 16,84 | i17: 1Δ 10 | [224 (1), 236 (1)] db | |
| metylförgrenade 17: 1 | 282, 321; 359 | 12,84 | 16,94 | A17: 1Δ 9 | [210 (3); 222 (4)] db | [330 (10); 316 (0); (90)] mb |
Tabell 1: Identifiering av fettsyror från Bacillus cereus ATCC 14579.
Retentionstider motsvarande kedjelängd (ECL) värden och molekylära joner för fettsyrametylestrar (FAME) visas, tillsammans med molekylära joner och diagnostiska joner för DMOX och pikolinyl derivat.
[] Mb diagnostisk jonpar indikerar en förlust av 28 amu motsvarande fragment före och efter kol förgrening.
[] Db diagnostisk jonpar som indikerar en förlust av 12 amu som motsvarar spjälkningen av en dubbelbindning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
FAS kromatogram profiler som visas i tabell 1 motsvarar B. cereus ATCC 14579 odlas på en agarplatta yta. Liknande profiler erhölls när bakterien odlades i luftade flytande medier vid samma temperatur 8. I fallet med bakterier som odlats i flytande medium, är den bakteriella biomassan uppsamlades genom centrifugering av tillväxtmediet och kan tvättas enligt tidigare beskrivna protokoll beroende på tillväxtbetingelser 8,19. Identifieringen av de olika FA produceras av B. cereus tillåten fina förändringar i den del av FA som skall detekteras i stammar muterade på vissa gener som är nödvändiga för tillväxt på 7,9 låg temperatur.
Vanligtvis är ECL beräknas med hjälp av loggvärden för den justerade uppehållstid bestäms vid en fast temperatur (med hjälp av en ugn med kontroll isotermisk temperatur) 20. Här, på grund av användningen av en icke-isotermisk ugn till permit en optimerad separation av FAME av intresse, den beräkningsmetod som användes var som tidigare beskrivits för linjär lagring index 3,21.
Syftet med detta arbete var inte att jämföra de beräknade ECL värden med dem som beskrivs i litteraturen, men att förutsäga FA struktur inom samma kromatogram profil utifrån dessa retentionsdata och spektra information. Faktum är att för mättade FAs, en given förgrening (iso- eller Anteiso) alltid orsakar samma skift i ECL, jämfört med den ekvivalenta rakkedjiga FA. Dessutom ECL beräknas i föreliggande studie matchas med värden som uppmätts av Stransky 22 på en kolonn med motsvarande polaritet. Denna samstämmighet med tidigare rapporterade värden indikerar att ECL värden är således mycket användbara för en snabb identifiering av topparna från FAS kromatogram profiler av B. cereus som odlas i andra tillstånd, eller i andra stammar (eg., Mutanter) av B. cereus.
Pikolinyl derivat ger mer karakteristiska joner som indikerar förgrenings plats än joner som genereras av DMOX derivat, medan läget för dubbelbindningen lättare delas med DMOX derivat. Föreliggande studie visar användbarheten av att kombinera information från båda derivat för att identifiera den metyl grenkedjiga omättade FAs från B. cereus, som fram till nu har varit dåligt beskrivits i litteraturen.
jove_content "> Den föreslagna metoden kan slutföras inom 2 dagar. Som jämförelse, för NMR-spektroskopi, bör varje FA renas, som representerar flera veckors arbete och en stor mängd biologiskt material. Men den metoden inte differentiera geometri ( cis, träns) av dubbelbindningar. när varje FA har identifierats, kan de rutinmässigt kvantifieras genom sin berömmelse derivat, t.ex. att jämföra bakteriestammar och mutanter eller att undersöka effekterna av odlingsbetingelser. i våra händer, så lite som 8 mg av färska bakterieceller var tillräckliga för kvantifiering av FA, vilket gör metoden är tillämplig på svårt att odla bakterier. kvantifieringen gränsen för var och en av den identifierade FAs är 1 ng / | j, l av lösningen injiceras i GC / MS.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Författarna är tacksamma för Thomas Mison för sin tekniska support, och Rachel Kopec för att revidera manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GC/MS | Shimadzu | QP2010 | |
| capillary column ZB WAX | Phenomenex | 7HG-G007-11 | 30 m x 0.25 mm x 0.25 µm |
| Methanol Lichrosolv | VWR | 1.06018.2500 | |
| potassium hydroxide | Aldrich | P1767 | |
| THF | Hipersolv Chromanorm | 28559.320 | |
| Dichloromethane | Hipersolv Chromanorm | 23373.320 | |
| Hexane | Hipersolv Chromanorm | 24575.320 | |
| 3-pyridinemethanol | Aldrich | P6-680-7 | |
| potassium tertiobutoxide | Aldrich | 156671 | |
| 2-amino-2-methyl-1-propanol | A-9879 | ||
| MilliQ Academic | Millipore | ZMQS50001 | |
| Bacterial Acid Methyl Ester (BAME) Mix | Sigma-Aldrich | 47080-U Supelco |
References
- Christie, W. W., Han, X. Lipid Analysis 4th Edition. , Oily press. (2010).
- HÜbschmann, H. -J. Handbook of GC-MS: fundamental and application. Third edition. , Wiley-vch. (2015).
- Sasser, M. Identification of Bacteria by Gas Chromatography of Cellular Fatty Acids. MIDI Technical note. 101, 1-6 (1990).
- Spitzer, V. Structure analysis of fatty acids by gas chromatography - Low resolution electron impact mass spectrometry of their 4,4-dimethyloxazoline derivatives - A review. Prog Lipid Res. 35 (4), 387-408 (1996).
- Harvey, D. J. Advances in lipid methodology. Volume 1. Christie, W. W. , Oily press. Dundee. 19-80 (1992).
- Diomande, S. E., Nguyen-The, C., Guinebretière, M. -H., Broussolle, V., Brillard, J. Role of fatty acids in Bacillus environmental adaptation. Front Microbiol. 6, (2015).
- Brillard, J., et al. Identification of Bacillus cereus Genes Specifically Expressed during Growth at Low Temperatures. Appl Environ Microbiol. 76 (8), 2562-2573 (2010).
- de Sarrau, B., et al. Influence of Anaerobiosis and Low Temperature on Bacillus cereus Growth, Metabolism, and Membrane Properties. Appl Environ Microbiol. 78 (6), 1715-1723 (2012).
- Diomandé, S. E., et al. Involvement of the CasK/R two-component system in optimal unsaturation of the Bacillus cereus fatty acids during low-temperature growth. Int J Food Microbiol. 213, 110-117 (2015).
- Berkeley, R. C. W., Heyndrickx, M., Logan, N., De Vos, P. Applications and Systematics of Bacillus and Relatives. Berkeley, R. C. W. , Blackwell Science Publ. 1-7 (2002).
- Kämpfer, P. Limits and Possibilities of Total Fatty Acid Analysis for Classification and Identification of Bacillus Species. System. Appl. Microbiol. 17 (1), 86-98 (1994).
- Kaneda, T. Fatty-acids of genus bacillus - example of branched-chain preference. Bacteriol Rev. 41 (2), 391-418 (1977).
- Chazarreta Cifre, L., Alemany, M., de Mendoza, D., Altabe, S. Exploring the Biosynthesis of Unsaturated Fatty Acids in Bacillus cereus ATCC 14579 and Functional Characterization of Novel Acyl-Lipid Desaturases. Appl Environ Microbiol. 79 (20), 6271-6279 (2013).
- Sasser, M., et al. Identification of Bacillus anthracis from culture using gas chromatographic analysis of fatty acid methyl esters. J AOAC Int. 88 (1), 178-181 (2005).
- Schutter, M. E., Dick, R. P. Comparison of fatty acid methyl ester (FAME) methods for characterizing microbial communities. Soil Sci Soc Am J. 64 (5), 1659-1668 (2000).
- Destaillats, F., Angers, P. One-step methodology for the synthesis of FA picolinyl esters from intact lipids. J Am Oil Chem Soc. 79 (3), 253-256 (2002).
- Fay, L., Richli, U. Location of double-bonds in polyunsaturated fatty-acids by gas-chromatography mass-spectrometry after 4,4-dimethyloxazoline derivatization. J Chromatogr. 541 (1-2), 89-98 (1991).
- Zhang, J. Y., Yu, Q. T., Liu, B. N., Huang, Z. H. Chemical modification in mass spectrometry IV-2-alkenyl-4,4-dimethyloxazolines as derivatives for the double bond location of long-chain olefinic acids. Biol Mass Spect. 15 (1), 33-44 (1988).
- de Sarrau, B., et al. Unsaturated fatty acids from food and in the growth medium improve growth of Bacillus cereus under cold and anaerobic conditions. Food Microbiol. 36 (2), 113-122 (2013).
- Miwa, T. K., Mikolajczak, K. L., Earle, F. R., Wolff, I. A. Gas chromatographic characterization of fatty acids.Identification constants for mono- and dicarboxylic methyl esters. Anal Chem. 32 (13), 1739-1742 (1960).
- van Den Dool, H., Kratz, P. A generalization of the retention index system including linear temperature programmed gas-liquid partition chromatography. J Chromatogr A. 11, 463-471 (1963).
- Stransky, K., Jursik, T., Vitek, A. Standard equivalent chain length values of monoenic and polyenic (methylene interrupted) fatty acids. J High Res Chromatogr. 20 (3), 143-158 (1997).
