Summary
이 프로토콜은 대기 입자상 물질로 치료 한 후 마우스 RAW264.7 대 식세포 관내에서 정량 및 염색체 이상 특성화를위한 기술을 설명한다.
Abstract
입자상 물질 (PM)에 노출되면 핵의 유전 물질을 포함하는 다양한 세포 성분을 손상시킬 수 있습니다 세계 주요 건강 문제이다. 핵 유전자의 무결성에 대한 PM의 영향을 평가하기 위해, 구조 염색체 이상은 마우스 RAW264.7 대식 세포의 중기 스프레드로 획득된다. PM은 높은 볼륨의 총 부유 입자 샘플러와 주변 공기에서 수집됩니다. 회수 된 물질은 용해 및 수용성 미세한 부분을 유지하기 위해 여과 하였다. 입자를 핵 자기 공명 (NMR) 분광법 화학 조성을 특징으로한다. 입자 현탁액의 상이한 농도는 미처리 대조군 세포와 함께 72 시간의 총 노출 시간 동안 RAW264.7 마우스 대식 세포의 시험 관내 배양에 첨가된다. 노광 끝에서 배양 중기 세포 체포 colcemid로 처리된다. 세포를 수확, acetomethanol에 고정 저장성 용액, D로 치료유리 슬라이드 상 ropped 최종적 김사 용액으로 염색. 슬라이드는 명 시야 현미경을 사용하여 1000 배의 배율에서 중기 스프레드 구조 염색체 수차 (CAS)에서 평가하기 위해 조사된다. 50 ~ 100 중기 확산은 각 치료 그룹습니다된다. 이 기술은 이러한 염색 분체 형 나누기, 염색 분체 형 교류, acentric 조각, dicentric 및 링 염색체, 두 분, endoreduplication, 그리고 오후에 노출 된 후 체외에서 로버트슨 전좌 등의 구조적 염색체 이상 (CAS)의 검출에 적합하다. 후생 유전 학적 변화에 잘 확립 된 세포 유전 학적 엔드 포인트를 연결하는 강력한 방법이다.
Introduction
입자상 물질 (PM)에 대한 노출은 주로 심폐 질환과 폐암 1에서 매년 3 백만 초과 사망, 원인 것으로 추정되고있다. 오후에 노출 수준을 증가 폐암의 위험이 증가 2에 도시 된 바와 같이 실제로, 오후, 암 연구를위한 국제기구 (그룹 1)에 의해 인간에게 발암 물질로 인식되었다. 흥미롭게도, 거의 모든 암세포 수치 및 / 또는 구조 염색체 이상 항구. 미립자 유기 탄소는 조성 및 크기 분포 배출뿐만 아니라 물리적, 화학적 변형에 따라 변형, 복잡한 이기종 혼합물이다. 그것은 35-55 (크기 PM 2.5 μm의 작은) 도시 PM 2.5 질량 %와 농촌 대륙 배경 PM 2.5 질량 3, 4의 60 % 이상에서 차지하고있다. 수용성 분획은 유기 에어로졸의 30-90%를 차지한다. 유기 화합물의 대다수지방족 탄화수소, 다환 방향족 탄화수소, 및 산소 및 니트로 유도체, 지방족 알데히드 및 알콜, 유리 지방산 및 그 염, 디 - 카르 복실 산, 다작 용성 화합물, 단백질, 및 부식과 같은 거대 분자 (HULIS) 사용을 포함하여 식별 된 질량 분석 기술 5-8 결합 크로마토 그래피 방법. 따라서 이들 화합물은 유기 탄소의 대부분은 9 불명 미립자 유기 탄소 미만 ~ 20 %를 나타낸다.
실험적 증거는 세포 독성, 산화 스트레스, 염증이 PM 관련된 병적 상태의 발전에 관여하는 것을 시사한다. 또한 최근 그러나, PM 해당 노출 시험 관내 시스템에서 인간 피험자 10-12 모두 실험에서, 반복 요소의 DNA 메틸화의 변화를 포함 후성 변경하는 다수의 결과 밝혀졌다. 특히 관심의 효과가있다메이저와 마이너 위성 - - 염색체의 센트로 주변의 염색질 지역에서 발견되는 위성 DNA에 오후. 그것은 그들이 노출 (12) 후 최소 72 시간 동안 감지 할 수있는 이러한 효과는 자연에 의해 지속 할 수 있음을 보였다. 특히 중심절 주위 DNA 메틸화의 변화는 세포 분열 동안 위성 DNA의 mRNA의 성적 증명서, 타협 염색체 무결성의 축적으로 이어질하고, 그 후, 병리학 적 상태 (13)의 다양한 개발 될 수 있습니다.
PM에 의한 후생 유전 학적 변화의 단부 점과 CA의 유전 학적 분석 방법의 적응하므로 높은 중요하다. 여기서, 우리는 뮤린 대 식세포 RAW264.7 모델 시스템을 사용하여 시험 관내의 CA 노광 분석 주위 PM 수집 및 제조를위한 방법을보고한다. 대 식세포는 t 따라서, 흡입 된 이물질을 우선적으로 보호를 포함하고,그의 세포주 확립 입자 독성학 11, 12, 14, 15에서 가장 자주 사용하는 모델로서 기능한다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 입자 수집 및 준비
- 높은 볼륨의 총 부유 입자 샘플러의 교정
- 질량 유량 제어기에서 샘플러 모터를 분리하고 안정적인 AC 전원 (그림 1)에 모터를 연결합니다.
참고 : 필터는이 절차를 수행하는 동안 사용되지 않습니다. - 샘플러에 교정기 오리피스와 상단 로딩 어댑터 플레이트를 탑재합니다. 공기 누출이 존재하지 않도록 안전하게 가기 로딩 어댑터 홀드 다운 너트를 조입니다. 샘플러 모터가 정상 작동 온도 (약 10 ~ 15 분)을 따뜻하게 할 수 있습니다.
- 손으로 구멍에 오리피스와 압력 탭의 상단에 구멍을 덮어 누출 검사를 실시한다. 공기를 탈출 만든 고음 ㅎ ㅎ 사운드를들을 수 있습니다. 이 소리가 들리는 경우 누수가 존재로, 상단로드 어댑터 홀드 다운 너트를 다시 조입니다. 소리가 작 으면 누설은 SYS의 다른 가스켓 중 하나 근처TEM.
- 고무 진공 튜브 오리피스의 측면에 압력 탭에 물 압력계의 한 쪽을 연결합니다. 대기 개방 압력계의 반대쪽을 둡니다. 정확한 판독을 보장하기 위해 수직으로 압력계를 잡으십시오. 연속 흐름 레코더의 뒷면을 탭하면 펜의 중심과 정확한 판독을 제공하는 데 도움이 될 것입니다.
- 단계를 반복 / 분 (약 매 5~6피트 3 / 분) 30 내지 60 피트의 작동 유량을 나타내는 다섯 유량을 사용 1.1.2. 다섯 가지 위치로 가변 오리피스에 손잡이를 조정하고 다섯 가지 측정 값을.
- 인증 최종 날짜, 날짜, 사이트 위치, 교정 판에 오퍼레이터의 이니셜 대기 온도, 주위 대기압, 샘플러 일련 번호, 일련 번호 오리피스, 오리피스의 기울기와 절편을 기록한다.
- 질량 유량 제어기에서 샘플러 모터를 분리하고 안정적인 AC 전원 (그림 1)에 모터를 연결합니다.
- 총 부유 입자 샘플 수집 및 중량 측정 분석
- 랩알루미늄 호일의 두 개의 층에있는 8 "× 10"석영 섬유 필터. 노에 싸여 필터를 놓고 550 ° C의 온도를 설정합니다. 적어도 4 시간 동안 필터를 굽는다. 노 멋진하자 필터를 검색 할 수 있습니다. CaCO3를 함께 데시 케이 터에서 필터를 놓습니다.
- 10 μg의 정밀도와 마이크로 저울에 필터를 달아. 하루 동안 측정을 세 번 반복합니다. 개별 측정은 25 μg의이어야한다. 이것이 실현되지 않으면, 데시 케이 터에 싸서 필터를 리턴하고, 처리를 다음과 같은 일을 반복한다.
- 대피소 덮개 (그림 2)를 엽니 다. 네 개의 날개 너트를 풀어 황동 볼트와 와셔가 길에서 다운 스윙을 할 수 있도록하여 필터 홀더 프레임을 제거합니다. 지원 화면에서 거친면이 위로, 알루미늄 호일에서 필터를 전개하고 신중하게 중심을 청소 집게를 사용합니다. 제대로 화면에 필터를 맞 춥니 다.
- 화면의 프레임을 놓고 함께 고정충분한 압력을가하면서 황동 볼트와 와셔 가장자리에 공기 누출을 방지 할 수 있습니다. 깨끗한 천으로 필터 홀더 주위에서 먼지 축적을 닦습니다. 닫기 쉼터 뚜껑을 조심스럽게 고정합니다.
- 확인 모든 코드는 해당 콘센트 소켓에 연결되어 있고 송풍기 모터 압력 탭과 연속적인 흐름 레코더 사이의 배관이 연결되어 있습니다.
- 흐름 레코더를 준비합니다. 펜 포인트를 올리고 새 차트를 삽입 펜 암 리프터를 우울. 레코더의 드라이브 허브 차트의 탭을 맞추고 허브에 차트 센터를 낮추기 위해 엄지 손가락으로 누르십시오. 차트에서 올바른 시간이 시간 인덱스 포인터와 정렬 될 때까지 드라이브 허브를 시계 방향으로 회전하여 시간을 설정합니다.
- 수동 샘플러에 전환 컬렉션을 시작합니다. 제대로 잉킹하고 경과 시간 표시가 올바르게 작동 확실하게 확인하기 위해 레코더를 모니터링합니다.
- 샘플링주기의 끝에서, 샘플러, 레코드를 끄시간이 경과 차트를 검색 할 수 있습니다. 필터를 노출 할 수있는 프레임을 제거합니다. 포셉과 끝에서 부드럽게 잡고지지 화면에서 노출 된 필터를 제거합니다. 그 샘플이 두 번 샘플에 닿을 수 있도록 길이 필터를 접어 원래의 알루미늄 호일에 포장.
- 이전 무게에 최소 24 시간 동안의 CaCO3와 데시 케이 터에서 필터를 저장합니다. 단계를 반복 1.2.2 샘플링 후 필터의 무게를 측정합니다. 지퍼 비닐 봉투에 필터를 놓고 분석 할 때까지 -80 ° C에 보관하십시오.
- 수집 된 총 부유 입자 샘플 분석
- 저장된 검색 필터를 알루미늄 포일을 전개하고 깨끗한 표면에 테플론 필터를 옮긴다. 집게와 메스를 사용하여 필터의 외부 (흰색) 부분을 잘라 폐기하십시오.
- 이어서, 100 mL의 플라스크에서, 0.5 "X 0.5"조각 조각 장소에서 필터를 잘라. 초순수 50 ㎖를 추가합니다. 초음파에 플라스크를 배치욕조와 33 ± 3 kHz에서 60 분 동안 초음파 처리.
- 100㎖의 환저 플라스크에 0.45 ㎛의 폴리 프로필렌 시린지 필터를 통해 여과 추출물. 추출물의 대략 5 ㎖까지 50 ℃에서 감압하에 로타 뱁 기기를 이용하여 물을 증발 플라스크에 남아있다.
- 공지 된 중량의 15 mL의 배 모양 플라스크에 잔여 물을 증발시켰다. 건조 추출물 플라스크의 무게를 측정하고 건조 추출물의 질량을 기록한다.
- 15 분 동안 초음파 처리에 의해 D 2 O의 400 μL와 건조 시료를 용해하고 5mm 표준 NMR 튜브에 전송할 수 있습니다. 어떤 용해되지 않은 물질을 제거 실온에서 12,000 XG에서 5 분 동안 원심 분리기.
- O.이 NaN 3 1.4 %의 10 μL (최종 진한 : w 0.02 % / V)를 NMR 튜브에 추가 D 2의 300 μL로 반복합니다. NMR 튜브 D 2 O (최종 농도 0.258 밀리미터)로 총 부유 입자 (TSP) -d4 (3.2 ㎎ / ㎖)의 10 μL (32 μg의)를 추가합니다.
- 600.17 MHz에서 작동하는 NMR 분광계를 사용하여 1 H NMR 스펙트럼을 획득.
- 트리플 공명 저온 탐침에 NMR 튜브를 삽입합니다. 다음 순서에 따라 악기를 보정 : 자물쇠, 조정, 심, 90 ° 펄스 길이 보정 및 수신기 이득을 조정한다.
- 디지털 쿼드 검출 모드에서 180 물 선택적 펄스, 8192 스캔, 4 더미 스캔, 8012.57 Hz에서의 스윕 폭을 사용하여 1 D 여기 조각 시퀀스와 25 ° C에서 스펙트럼을 측정, 주파수는 4.70 ppm으로 설정 물 신호 억제, 1.70 오프셋 (offset) 초의 획득 시간, 32,768 시간 영역 데이터 포인트 (TD), 1 밀리 초 시간 구배 (P16) 구배 (D16) 100 마이크로 초 후 복귀 지연.
- 공정 1이 (65, 536 데이터 포인트)의 계수를 1 Hz에서 제로 충진 라인 넓어짐을인가하여 H NMR 스펙트럼. 수동 위상과 기준을 수정하고 통합 할 수 있습니다. 0.0 ppm으로 TSP-D4 피크를 설정합니다.
- 저장된 검색 필터를 알루미늄 포일을 전개하고 깨끗한 표면에 테플론 필터를 옮긴다. 집게와 메스를 사용하여 필터의 외부 (흰색) 부분을 잘라 폐기하십시오.
2. 입자 노출
- 문화 설정
- (37 ℃), 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 페니실린 - 스트렙토 마이신 용액 (100 U / ㎖) 0.25 % 트립신 용액 및 칼슘 마그네슘없는 인산 완충 식염수 수욕 (PBS)를 함유 따뜻한 완전한 성장 매체 문화 개시하기 전에 적어도 30 분.
- 배양 된 RAW264.7 세포를 포함하는 5 % CO 2 배양기에서 T75 플라스크를 꺼내 미리 예열 PBS 두 번 2 ㎖로 세포를 씻어.
- 스크래핑이어서 예열 트립신 용액 1 ㎖를 사용하여 조직 배양 용기의 바닥으로부터 점착 RAW264.7 세포시키다.
- 조직 배양 용기로부터 세포를 수집하고 피펫 팅을 반복하여 단일 세포 현탁액을 만든다. 예열이 완료 매체를 100mm 조직 배양 접시에 8000 / cm 2 (총 50 세포)의 밀도로 트리 판 블루 플레이트 세포의 수를 계산. 50,000 세포의 최종 농도가 10 mL의 미디어 볼륨을 조절ml의 당.
주 : DNA 메틸화 분석도 수행되는 경우 플레이트의 수를 두배. - 37 ℃에서 다시 5 % CO2 인큐베이터에서 새로 도금 RAW264.7 세포를 넣고 24 시간 동안 부착 할 수있다.
- 또한 바이오 캐비닛 여과 입자를 재현 탁. 예를 들어, 5 μg의 / ㎖ 처리 용량 멸균 PBS에서 0.5 ㎎ / ㎖의 농도로 희석 입자 5 밀리그램 / A를 50㎍ / ㎖의 치료 투여 용 용액에. 희석 미리 개월까지 준비하고 -80 ℃에서 저장 될 수있다.
- 입자상 물질로 처리하고
- 5 % CO 2 배양기에서 세포를 가지고 세포 성장, 세포 형태, 배양 조건 및 오염 거꾸로 현미경을 사용하여 10 배 배율에서 확인합니다. 하나는이 단계에서 적어도 30 % 융합 세포를 가질 것으로 기대한다.
- 무균는 멸균 피펫을 사용하여 미디어를 흡인하고 2 ml의 37 ° C PBS로 배양 용기를 씻고두 배는 완전히 미디어 및 부동 또는 죽은 세포를 제거합니다.
- 배양 용기에 신선한 매체와 입자상 물질의 미리 결정된 투여 량을 첨가하고 5 % CO2 인큐베이터에서 37 ℃에서 소정 시간 동안 배양한다. 본 연구에서는 동시 유전 독성 및 epigenotoxic 분석에 사용되는 노광 병렬 72 시간 동안 PM에 RAW264.7 세포를 처리한다.
주 : 세포 독성 부정적인 염색체 분석의 질에 영향을 미칠 수있다. 따라서, 세포 독성, DNA 메틸화, 웨스턴 블 롯팅 또는 유전자 발현 분석과 같은 추가의 분석은 일반적으로 처리 된 세포에서 수행된다. 설명 된 바와 같이 세포를 노출하고 원하는 특정 분석을 진행합니다. 경험이없는 사용자는 CA를 감지 할 수있는 능력을 테스트하는 메틸 메테 인설 등의 긍정적 인 컨트롤을 포함 할 수있다.
3. 세포 유전 학적 분석
- 치료는 중기에서 세포를 체포하기
- 그래서 colcemid을 따뜻하게lution 30 분 동안 37 ° C의 물을 욕조 (10 μg의 / ㎖). 오염의 위험을 최소화하기 위해 바이오 캐비닛하에 70 % 알코올로 뚜껑을 닦아
- 완전 무균 미디어를 제거하고 2 ml의 사전 예열 PBS 2 회 문화 혈관을 씻는다.
- 미리 예열 신선한 매체를 추가 (2 ml의 미디어 / 10 6 세포) 배양 용기에 colcemid 용액 (5 μL / ㎖)를 포함하고 2 시간 동안 품어.
- 셀 수확
- 수욕에서 따뜻한 트립신 PBS 용액을 30 분 동안 37 ℃에서 유지 하였다. 이후,이 단계에서 무균 상태를 유지할 필요가 없다.
- 완전히 두 번 2 ml를 37 ° C PBS와 문화 용기를 씻어 미디어를 제거 미리 예열 트립신 용액 필요한 볼륨을 추가 (보통 60mm 배양 접시 또는 T25 플라스크 2 mL 및 100mm 접시 또는 T75 플라스크 4 ml의 ) 1 분 동안 37 ℃에서 다시 5 % CO2 인큐베이터에서 배양 용기를 배치했다.
- 탁E 밖으로 배양 용기, 스크레이퍼를 사용하여 세포를 분리하고, 트립신 동작을 중지하는 PBS 10 ㎖를 추가한다.
- 피펫은 위아래로 적어도 10 시간은 15 ML 원뿔 바닥 원심 분리기 튜브 단일 세포 현탁액 및 전송 세포를 확인합니다.
- 실온에서 아웃 스윙 원심 분리기에서 5 분 400 XG에 원심 분리기 세포 현탁액.
- , 상층 액을 제거 부드러운 터치하여 세포 펠렛을 휴식, PBS 10 ㎖를 추가하고, 다시 다섯 분 동안 원심 분리.
- 저장성 처리 및 고정
- 적어도 30 분 동안 37 ° C의 물을 수 욕에서 예열 따뜻한 0.075 M 염화칼륨 용액.
- 세포 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 제거하고 PBS의 약 0.5 ml를 둡니다.
- 조심스럽게 세포 펠렛을 중단하고, P200 피펫을 사용하여 단일 세포 현탁액을합니다.
- 부드러운 흔들림과 드롭에 의해 미리 예열 염화칼륨 용액 방울의 4 ML을 추가합니다.
- 저장성 페이지에서 세포를 품어20 분 동안 37 ° C를 물을 욕조에 otassium 염화 솔루션입니다.
- 1 액형 빙초산 3 부를 메탄올을 첨가하여 신선한 acetomethanol 용액을 만든다. 실온에서이 갓 준비 정착액을 유지합니다.
- 저장성 처리 후, 튜브에 정착 동량 (4 ml)에 추가로 조심스럽게 튜브를 반전시켜 용액을 혼합한다.
- 실온에서 5 분 동안 400 × g으로 원심 분리하고 상층 액을 제거한다. 이 단계의 세포 펠렛의 크기가 증가에서 희끄무레 더 볼 수있게.
- 상층 액을 제거를 4 ml의 신선한 고정액을 추가하고, 실온에서 30 분 동안 유지한다.
- 5 분 400 XG에 원심 분리기, 뜨는을 제거하고, 4 ml의 정착액 두 더 세척을 제공합니다.
- 슬라이드 청소 및 중기 확산 준비
- 30 분 동안 완전히 10 % 액체 세제 유리 슬라이드를 담가.
- 30 분 동안 차가운 흐르는 수돗물에 철저하게 슬라이드를 씻어.
- 린SE는 완전히 제거 세제를 증류수에 담가 및 나중에 사용하기 위해 냉장 보관 증류수로 3 회 슬라이드.
참고 : 사용 확산의 균일 성을 용이하게하고 중기 품질을 향상하기 전에 슬라이드를 청소합니다. - 냉장 젖은 슬라이드에 10 ㎕의 세포 현탁액을 드롭하고 실온에서 건조 하룻밤을 방송 할 수 있습니다.
- 염색 및 설치
- PBS의 한 부분으로 김사 얼룩 솔루션의 한 부분을 혼합하여 50 ㎖ 김사 염색 액을 준비하고 코 플린 항아리에 붓는다.
- 20 분 동안 염색 액에 담가 슬라이드.
- 헤어 드라이어를 사용하여 슬라이드를 초과 얼룩을 제거하고 즉시 건조 증류수에 슬라이드를 씻어.
- 하룻밤 실온에서 슬라이드를 둡니다.
- 슬라이드에 매체를 장착 한 방울을 적용, 부드럽게, 설치 매체에 커버 슬립을 배치 매체가 천천히 슬라이드에 걸쳐 수 있도록, 제거종이 수건을 초과 매체. 마운트 된 슬라이드 전에 이동하거나 커버 슬립의 이동을 방지하기 위해 현미경으로 볼 적어도 1 시간 동안 건조하도록 허용합니다.
주의 :이 단계에서 모든 거품을 형성하지 않고 신중하게 커버 슬립을 배치하는 것이 중요하다. 거품을 제거하는 과도한 열을 사용하지 않는 것이 좋습니다.
- 현미경 관찰과 수차 유형
- 중기 좋은 품질의 밝은 필드 현미경을 이용하여 100 배의 배율로 확산의 구조 CA를 검사합니다.
- (100) 중기가있는 CA의 큰 숫자를 유도 치료에 대한 각 치료 그룹에 확산 적어도 50 점수. 작은 효과 크기의 경우, 최대 300 중기 스프레드의 분석 좋습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
큰 관심은 TSP 샘플러의 위치뿐만 아니라, 모음이 수행되는 년의 시간을 선택하는데주의해야한다. 화학 성분뿐만 아니라 입자의 크기가 실질적 결과에 영향을 미칠 수있다. 수집 된 자료는 흰색 필터에 대해 볼 수 있어야합니다. 정상 마우스 중기 스프레드는 40 acentric 염색체를해야합니다. 이 기술의 목적은 대조군에 비해 처리 된 세포의 비정상 염색체의 비율의 변화 (또는 그의 결핍)을 보여주는 것이다. 그 변화는 다음 (비정상적인 염색체의 수)과 자격을 갖춘 (이상 유형)를 정량화 할 수있다.
일반 마우스 중기 스프레드는 40 acentric 염색체 (그림 3A)를해야합니다. 입자상 물질과 치료는 염색 분체 휴식 같은 그림 3과 같이 다양한있는 CA (3B), acentric 조각 (유도
그림 1. 많은 양의 총 부유 입자 (TSP) 샘플러. 사진은 주위 입자를 수집하기 위해 도시 지역에서 지붕에 설치된 TSP 샘플러를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
높은 체적 TSP의 S를 사용하여도 2로드 석영 섬유 필터 다음 컬렉션ampler. 사용 후 TSP 샘플러에 설치된 필터에 근접. 필터의 색이 회색으로 흰색으로 변경합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
미립자 물질의 다양한 농도로 처리 한 후 RAW264.7 세포에서 유도 된 구조적 수차의 다른 유형의 대표적인 예를 나타내는도 3 현미경 사진. 수차는 화살표로 표시됩니다. (A) 40 acrocentric 염색체와 일반 중기 확산, (B) 염색 분체 형 브레이크 (CTB), (C) acentric 조각 (acentrics), (D) 링 염색체, (E) dicentric 염색체 (딕), (F) 더블 분 (Dimn), (
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
세포 유전 학적 연구 또는 번호 또는 주로 중기 스프레드 염색체의 구조의 현미경 분석, 각종 질병에 대한 예후, 위험 평가, 치료에 대한 중요한 정보를 제공합니다. 지금 세포 유전 학적 이상이 암 등 여러 질병의 진행 및 개발과 연결되어 있음을 잘 설정됩니다. 현재까지, CA는 모든 주요 종양 유형에서 발견되었다. 유전 학적 변화 (16)의 다양한 형태를 유도 할 수있는 주요 외부의 위험 인자 중 하나 - CA는 자발적으로 또는 방사 (IR)를 이온화 같은 하나의 외부 또는 내부 자극에 의해 일어날 수있다. 흡수 된 방사선 량의 평가에서 CA를 보조의 분석 (세포 유전 학적 방사선 biodosimetry라고도 함). 또한, 특정 주파수 및 수차 형태의 분석은 방사선의 품질을 결정하는 중요한 정보 (17), (18)에 흡수되는 것을 제공한다. 세포 유전 학적 연구는 난의 직접적인 이미지를 제공합니다DNA에 손상 에이전트 MPACT. 이것은 혜성 분석법으로 간접 기술들에 대조적이다. 방사선 이외의 분야에서 활용에서 - 그러나, 세포 유전 학적 연구는 부분적으로 인해 다수의 손에 관여 단계로,왔다.
PM을 유기 탄소 현재에 노출이 부정적인 우리의 건강에 영향을 미치는 것으로 알려져 있지만, 생물학적 효과를보고 몇몇 연구들은 조성물 (9)을 포함한다. 그들은 단지 화합물의 매우 특정한 타입마다의 작은 서브 세트에 대한 통찰력을 제공하지만 이는 노동 집약적 추출, 처리 농도 및 유도체 프로토콜을 필요로하는 비용 및 불편 크로마토 그래피 방법에 기인한다. 또한, 프로토콜은 상당한 조작 또는 원래 시료의 파괴, 따라서 추가 테스트를 수행 할 수없는 결과. 핵 자기 공명 (NMR) 분석의 장점 NMR은 비파괴 방법 것을 포함한다; 그것은 인트 아주 제한된 수 있어야PS (추출, 농도) 사전 분석 및 고주파 NMR 장비는 (900 MHz에서 400 MHz의에서), 핵심 시설 내 대학 전부는 아니더라도 대부분에서 사용할 수 있습니다. 대기 에어로졸 NMR 연구의 종합적인 검토는 최근 19 게시되었습니다. 마지막으로, 구조 정보 및 그룹 간의 결합을 제공 할 수있는 능력 때문에 NMR에만 관능기의 종류에 데이터를 제공하는 등의 FT-IR, UV-비스 및 라만 분광 분석법 등의 다른 방법보다 우수하다. 필요한 경우, PM의 형태 적 특성을 전자 주사 현미경을 이용하여 NMR 스펙트럼을 추가로 수행 할 수있다.
심지어 단일 위치에서의 PM의 조성은 연중 시간에 따라 달라질 수 모았다. 물질의 충분한 양의 처리를 반복 실험 또는 보완적인 분석을 위해 -80 ° C에서 보관해야합니다. 3.1.3 통해 2.1.1은 바이오스에서 무균 적으로 수행해야하는 단계afety 캐비닛. 오염이나 손상 세포 형태가 관찰되는 경우, 프로토콜의 나머지를 진행하지 않는다. 트립신 처리 시간은 세포 유형에 따라 조정되어야한다. 여기에, 대 식세포는 매우 부착하고 우리는 1 분 트립신과 스크래핑의 조합이 가장 적합한 것을 발견하지만, 대부분의 세포 유형에 대한 5 분 작품 혼자 트립신있다. 저장성 처리 시간은 세포 종류에 따라 다르며 표준화되어야한다. colcemid의 투여 량과 치료 시간은 염색체 제조를위한 가장 중요한 변수이다; 과잉 량의 세포를 죽이거나 세포주기를 멈출 수있다. 우리 RAW264.7 세포를 여기 상태를 설명하고, 최적은 다른 세포 유형에 필요하다. 실패는 결과에 영향을 미치는 악영향 이상적 분열 지수에 영향을 미칠 수있는이 공정의 조건뿐만 아니라 염색체 형태학을 발견한다. 또한 이전의 세포 유전 학적 분석에 PM의 세포 독성의 수준을 평가하고 그에 따라 용량을 선택하는 것이 좋습니다.
관내 독성 평가가 사용될 세포 노광 크기 및 입자 농도의 형태에 의해 제한된다. 더욱이, 본 연구에서, 우리는 따라서 염색체 수차를 일으킬 수 불용성 종의 전위가 차지되지 않을 수 있고, PM의 수용성 추출물을 이용하고. 다른 제한 사항은 "다형 변형"의 존재와 관련된 - 센트로 미어 지역 및 염색체 짧은 팔의 변화; 몇 초 현미경 또는 잘못 해석 될 수있다 비밀 재 배열하고 복잡한 핵형의 존재.
여기서는 염색체 분석의 도입은 DNA에 PM-의한 손상의 식별에 도움이 될 수 잠재적 주위 PM 노출로 인한 건강 영향 평가의 예측 포인트로 작용할 수 있음을 입증한다. 우리의 연구는 우리의 지식, PM에 대한 응답으로 CA를 표시하는 최초의 하나입니다. 이러한 결과의 복제는우리의 연구 결과를 확인하는 것이 바람직하다. 이 프로토콜은 또한 의심 DNA 손상 제의 거의 모든 종류를 평가하도록 구성 될 수있다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
이 연구는 생물학 연구 우수성 [허가 번호 1P20GM109005, 국립 항공 우주국 [부여 번호 NNX15AK32A]를 통해 아칸소 공간 부여 컨소시엄의 건강 센터의 국립 연구소 및 산업 안전에 대한 국립 연구소에 의해 부분적으로 지원 건강 (NIOSH) 인증 번호 2T420H008436]. 저자는 교정이 원고를 편집 크리스토퍼 Fettes에게 감사의 말씀을 전합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Total suspended particulate sampler | Tisch Environmental | TE-5170 | |
| Bruker Avance III NMR spectrometer | Bruker | NA | |
| TopSpin 3.5/pl2 software | Bruker | NA | |
| ACD/NMR Processor Academic Edition | ACD/Labs | NA | |
| RAW264.7 murine macrophages | ATCC | ATCC TIB-71 | |
| High glucose DMEM GlutaMAX media | ThermoFisher | 10569010 | Warm in a 37 °C waterbath before use |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000044 | Warm in a 37 °C waterbath before use |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | ThermoFisher | 15140163 | Warm in a 37 °C waterbath before use |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher | 25200056 | Warm in a 37 °C waterbath before use |
| PBS, pH 7.4 | ThermoFisher | 10010049 | Warm in a 37 °C waterbath before use |
| KaryoMAX Colcemid Solution in PBS | ThermoFisher | 15212012 | Warm in a 37 °C waterbath before use |
| KaryoMAX Potassium Chloride Solution | ThermoFisher | 10575090 | Warm in a 37 °C waterbath before use |
| Methanol (HPLC) | Fisher Scientific | A452N1-19 | |
| Acetic Acid, Glacial | Fisher Scientific | BP1185-500 | |
| Decon Contrad 70 Liquid Detergent | Fisher Scientific | 04-355-1 | |
| Wright and Wright-Giemsa Stain Solutions | Fisher Scientific | 23-200733 | |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| Axio Imager 2 | Zeiss | NA |
References
- Lim, S. S., et al. A comparative risk assessment of burden of disease and injury attributable to 67 risk factors and risk factor clusters in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380, 2224-2260 (2012).
- IARC: Outdoor air pollution a leading environmental cause of cancer deaths. , IARC. Press Release 10-17-2013 (2013).
- Putaud, J., et al. A European aerosol phenomenology-2: chemical characteristics of particulate matter at kerbside, urban, rural and background sites in Europe. Atmos. Environ. 38 (16), 2579-2595 (2004).
- Hand, J., Schichtel, B., Pitchford, M., Malm, W., Frank, N. Seasonal composition of remote and urban fine particulate matter in the United States. J Geophys Res-Atmos. 117 (5), (2012).
- Schauer, J. J., et al. Source apportionment of airborne particulate matter using organic compounds as tracers. Atmos. Environ. 30 (22), 3837-3855 (1996).
- Simoneit, B. R. A review of biomarker compounds as source indicators and tracers for air pollution. Environ. Sci. Pollut. Res. 6 (3), 159-169 (1999).
- Kavouras, I. G., Stephanou, E. G. Particle size distribution of organic primary and secondary aerosol constituents in urban, background marine, and forest atmosphere. J Geophys Res-Atmos. 107 (8), (2002).
- Graber, E., Rudich, Y. Atmospheric HULIS: How humic-like are they? A comprehensive and critical review. Atmos. Chem. Phys. 6 (3), 729-753 (2006).
- Pöschl, U., et al. Atmospheric aerosols: composition, transformation, climate and health effects. Angew. Chem. Int. 44 (46), 7520-7540 (2005).
- Hou, L., et al. Altered methylation in tandem repeat element and elemental component levels in inhalable air particles. Environ. Mol. Mutagen. 55 (3), 256-265 (2014).
- Miousse, I. R., et al. Epigenetic alterations induced by ambient particulate matter in mouse macrophages. Environ. Mol. Mutagen. 55 (5), 428-435 (2014).
- Miousse, I. R., et al. In Vitro Toxicity and Epigenotoxicity of Different Types of Ambient Particulate Matter. Toxicol. Sci. 148 (2), 473-487 (2015).
- Ehrlich, M. Genomic instability in cancer development. Genome Instability in Cancer Development. , Springer. 363-392 (2005).
- Michael, S., Montag, M., Dott, W. Pro-inflammatory effects and oxidative stress in lung macrophages and epithelial cells induced by ambient particulate matter. Environ Pollut. 183, 19-29 (2013).
- Li, N., et al. Induction of heme oxygenase-1 expression in macrophages by diesel exhaust particle chemicals and quinones via the antioxidant-responsive element. J Immunol. 165 (6), 3393-3401 (2000).
- Pathak, R., Ramakumar, A., Subramanian, U., Prasanna, P. G. Differential radio-sensitivities of human chromosomes 1 and 2 in one donor in interphase- and metaphase-spreads after 60Co gamma-irradiation. BMC Med. Phys. 9, 6649 (2009).
- Pathak, R., Dey, S. K., Sarma, A., Khuda-Bukhsh, A. R. Genotoxic effects in M5 cells and Chinese hamster V79 cells after exposure to 7 Li-beam (LET= 60keV/µm) and correlation of their survival dynamics to nuclear damages and cell death. Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 628 (1), 56-66 (2007).
- Pathak, R., Dey, S. K., Sarma, A., Khuda-Bukhsh, A. R. Cell killing, nuclear damage and apoptosis in Chinese hamster V79 cells after irradiation with heavy-ion beams of 16 O, 12 C and 7 Li. Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 632 (1), 58-68 (2007).
- Chalbot, M. C., Kavouras, I. G. Nuclear magnetic resonance spectroscopy for determining the functional content of organic aerosols: a review. Environ. Pollut. 191, 232-249 (2014).
