Summary
Este protocolo descreve técnicas para a quantificação e caracterização de aberrações cromossómicas in vitro em macrófagos de camundongos RAW264.7 após o tratamento com partículas do ar ambiente.
Abstract
A exposição a partículas (PM) é um importante problema de saúde mundial, que pode danificar vários componentes celulares, incluindo o material genético nuclear. Para avaliar o impacto da PM na integridade genética nuclear, aberrações cromossómicas estruturais são marcados nos spreads metáfase de macrófagos do rato RAW264.7. PM é recolhida a partir do ar ambiente com um amostrador de partículas totais alto volume suspenso. O material recolhido é solubilizado e filtrou-se para reter a porção fina solúvel em água. As partículas são caracterizadas por composição química por espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN). Diferentes concentrações de suspensões de partículas são adicionados para uma cultura in vitro de macrófagos de ratinho RAW264.7 para um tempo total de exposição de 72 horas, juntamente com as células de controlo não tratadas. No final da exposição, a cultura é tratada com colcemida para prender células em metafase. As células são então recolhidas, tratou-se com uma solução hipotónica, fixo em acetomethanol, dropped em lâminas de vidro e, finalmente, corados com solução de Giemsa. Slides são examinados para avaliar as aberrações estruturais cromossómicas (CAs) em metáfase se espalha de 1000X ampliação usando um microscópio de campo brilhante. 50 a 100 metafase são marcados para cada grupo de tratamento. Esta técnica é adaptado para a detecção de aberrações estruturais cromossómicas (CAs), como quebras de tipo chromatid, trocas do tipo chromatid, fragmentos acêntricos, cromossomas dicêntricos e anel, minutos duplos, endorreduplicação, e translocações Robertsonianas in vitro após exposição a PM. É um método poderoso para associar um ponto de extremidade citogenética bem estabelecida a alterações epigenética.
Introduction
Estima-se que a exposição ao material particulado (PM) faz com que mais de 3 milhões de mortes em excesso por ano, principalmente por doenças cardiopulmonares e cancro do pulmão 1. Na verdade, PM foi reconhecido como carcinogênico para humanos pela Agência Internacional para Pesquisa sobre Câncer (Grupo 1), com um risco aumentado de câncer de pulmão com o aumento dos níveis de exposição a PM foi mostrado 2. Curiosamente, quase todas as células cancerosas abrigar anormalidades cromossômicas numéricas e / ou estruturais. carbono orgânico particulado é uma variante, complexo e mistura heterogénea, cuja composição e tamanho de distribuição depende das emissões, bem como as transformações físicas e químicas. É responsável 35-55% da massa urbana PM 2,5 (PM 2,5 mm de tamanho e menores) e mais de 60% do fundo rural e continental PM 2,5 em massa 3, 4. A fração solúvel em água é responsável por 30-90% dos aerossóis orgânicos. Um grande número de compostos orgânicosForam identificados, incluindo os hidrocarbonetos alifáticos, hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, e seus derivados oxigenados e nitrados, aldeídos alifáticos e álcoois, ácidos gordos livres e os seus sais, ácidos di-carboxílicos, compostos multifuncionais, proteínas e macromoléculas húmicos-like (HULIS) usando métodos cromatográficos acoplados com técnicas de espectrometria de massa 5-8. Estes compostos representam menos de 10-20% do carbono orgânico particulado, assim, a maioria de carbono orgânico é desconhecida 9.
A evidência experimental sugere que a citotoxicidade, o stress oxidativo, e a inflamação estão envolvidos no desenvolvimento de estados patológicos PM-associados. Recentemente, foi mostrado, no entanto, que a exposição a PM também resulta num certo número de alterações epigenética, incluindo alterações na metilação do ADN de elementos repetitivos, tanto experimental em sistemas in vitro e em indivíduos humanos 10-12. De particular interesse são os efeitos dePM em DNA satélite - maiores e menores satélites - que são encontrados na região heterocromática em torno do centrômero dos cromossomos. Mostrou-se que estes efeitos podem ser persistente, por natureza, uma vez que pode ser detectado durante pelo menos 72 horas após a exposição 12. Alterações na metilação do ADN, em particular ao redor de centrómeros, pode levar a uma acumulação de transcritos de ARNm de ADN cromossómico por satélite, integridade compromisso durante a divisão celular e, subsequentemente, resultam no desenvolvimento de uma variedade de estados patológicos 13.
Adaptação de abordagem citogenética para a análise de CAs como um ponto final de alterações epigenética causadas por PM, portanto, é de grande importância. Aqui, nós relatamos a abordagem para a recolha PM ambiente e preparação, a exposição in vitro e análise de CAs usando o murino sistema de macrófagos modelo RAW264.7. Os macrófagos compreendem a primeira linha de defesa contra os objectos estranhos inaladas e, por conseguinte, tsua linha celular serve como um modelo mais utilizado em toxicologia partícula 11, 12, 14, 15 e estabelecido.
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Protocol
1. Recolha de partículas e Preparação
- Calibração do dispositivo de amostragem partículas total de alto volume suspensa
- Desligar o motor amostrador a partir do controlador de fluxo de massa e ligar o motor a uma fonte de alimentação de CA estável (Figura 1).
NOTA: Um filtro não é usado durante este procedimento. - Monte o orifício calibrador e superior placa adaptadora de carregamento para o amostrador. Aperte os principais adaptador de carga porcas de fixação da segurança para garantir que não há vazamentos de ar estão presentes. Permitir que o motor amostrador aquecer até à sua temperatura de funcionamento normal (aproximadamente 10-15 min).
- Realizar um teste de vazamento, cobrindo os furos na parte superior do orifício e da pressão da torneira no orifício com as mãos. Ouvir um som agudo estridente feito por escapar ar. Se este som é ouvido, volte a apertar os principais adaptador de carga porcas de sujeição como um vazamento está presente. Se o som é mais baixo, o vazamento é perto de uma das outras juntas nas sysTEM.
- Conectar um lado de um manómetro de água da torneira à pressão no lado do orifício com um tubo de vácuo de borracha. Deixar o lado oposto do manómetro aberto para a atmosfera. Segure um manómetro verticalmente para garantir leituras precisas. Tocar na parte traseira do gravador de fluxo contínuo vai ajudar a centrar a caneta e fornecer leituras precisas.
- Repita o passo 1.1.2, usando cinco vazões que representam as taxas de fluxo que operam a partir de 30 a 60 pés / min (aproximadamente a cada 5-6 pés 3 / min). Ajuste o botão no orifício variável em cinco posições diferentes e ter cinco leituras diferentes.
- Grave a temperatura ambiente do ar, pressão ambiente, número de série amostrador, número de série orifício, inclinação orifício e intercepção com data do último certificado, a data, local do site, e as iniciais do operador sobre a folha de calibragem.
- Desligar o motor amostrador a partir do controlador de fluxo de massa e ligar o motor a uma fonte de alimentação de CA estável (Figura 1).
- Coleta de amostra total de partículas suspensas e análise gravimétrica
- enrole uma8 "x 10" filtro de fibra de quartzo em duas camadas de folha de alumínio. Colocar o filtro envolvido na fornalha e ajustar a temperatura a 550 ° C. Coza no filtro durante pelo menos 4 h. Deixe o fresco do forno e recuperar o filtro. Colocar o filtro no exsicador com CaCO3.
- Pesa-se o filtro numa microbalança com precisão de 10 ug. Repetir a medição três vezes durante um dia. medições individuais deverão estar dentro de 25 ug. Se isto não for conseguido, devolver o filtro enrolado para o exsicador e repetir o processo no dia seguinte.
- Abrir a tampa do abrigo (Figura 2). Retire o filtro chassis de suporte soltando os quatro porcas de asa, permitindo que os parafusos de latão e arruelas para oscilar para baixo fora do caminho. Desdobrar o filtro da folha de alumínio, e utilize uma pinça limpas para centralizá-lo cuidadosamente, lado mais áspero para cima, na tela de apoio. Alinhe corretamente o filtro na tela.
- Coloque a moldura na tela e prenda-o comos parafusos e anilhas de metal enquanto aplica pressão suficiente para evitar fugas de ar nas extremidades. Limpe qualquer acúmulo de poeira de todo o suporte do filtro com um pano limpo. Feche a tampa abrigo com cuidado e prendê-lo.
- Certifique-se de todos os cabos estão conectados a suas bases receptáculo apropriado e a tubulação entre a torneira de pressão do motor do ventilador e o gravador de fluxo contínuo está ligado.
- Prepara-se o gravador de fluxo. Deprimir a pena braço levantador para levantar ponto caneta e inserir um novo gráfico. Alinhe a guia do gráfico para o cubo de acionamento do gravador e pressione com o polegar para abaixar o centro de gráfico no cubo. tempo definido pela rotação do cubo de acionamento dos ponteiros do relógio até a hora correta no gráfico é alinhada com o ponteiro índice de tempo.
- alternar manualmente no amostrador e iniciar a coleta. Monitorar o gravador para ter certeza de que está cobrindo corretamente e o indicador de tempo decorrido para ter certeza de que está funcionando corretamente.
- No final do período de recolha de amostras, desligar o amostrador, fichao tempo decorrido e recuperar o gráfico. Remover o quadro para expor o filtro. Retire o filtro exposta a partir da tela de suporte, segurando-o delicadamente nas extremidades com a pinça. Dobre o filtro de comprimento de modo que a amostra toca amostra duas vezes e envolvê-la na folha de alumínio original.
- Armazenar o filtro em um exsicador com CaCO3 para, pelo menos, 24 h antes da pesagem. Repita o passo 1.2.2 para medir o peso dos filtros após a amostragem. Coloque o filtro em um saco plástico zip e guarde-a -80 ° C até análise.
- Análise de amostra de partículas totais em suspensão recolhidas
- Recuperar o filtro armazenados, abra a folha de alumínio e transferir o filtro sobre uma superfície de Teflon limpa. Utilizando uma pinça e bisturi, cortar a parte exterior (branco) do filtro e descarte.
- Em seguida, cortou o filtro em 0,5 "x 0,5" pedaços e peças para um balão de 100 ml. Adicionar 50 ml de água ultrapura. Colocar o recipiente em um ultra-sombanheira e sonicate durante 60 minutos a 33 ± 3 kHz.
- extrato de filtro através de um filtro de seringa em polipropileno de 0,45 um a um frasco de 100 ml de fundo redondo. Evapora-se a água usando um aparelho evaporador rotativo sob pressão a 50 ° C até cerca de 5 ml de extracto permanece no frasco.
- Evapora-se a água restante em um frasco de 15 ml em forma de pêra de peso conhecido. Pesa-se o balão com o extracto seco e registar a massa do extracto seco.
- Dissolve-se a amostra seca com 400 ul de D 2 O por sonicação durante 15 minutos e transferir para um tubo de RMN de 5 mm padrão. Centrifugar durante 5 min a 12.000 xg, à temperatura ambiente para remover qualquer matéria não dissolvida.
- Repetir com 300 ul de D 2 O. Adicionar 10 ul de NaN3 1,4% (concentração final .: 0,02% w / v) no tubo de RMN. Adicionam-se 10 ul (32 ug) de partículas totais em suspensão (TSP) D4 (3,2 mg / ml) em D 2 O (concentração final de 0,258 mM) no tubo de RMN.
- Adquirir espectros de 1 H RMN utilizando um espectrómetro de RMN operando a 600,17 MHz.
- Inserir o tubo de RMN em crio-sonda de ressonância tripla. Calibrar o aparelho na seguinte ordem: fechamento, melodia, calço, calibragem de comprimento de 90 ° de pulso e ajuste de ganho do receptor.
- Medir espectros a 25 ° C com um 1 D sequência de excitação esculpir usando 180 pulsos seletiva de água em modo de detecção de Quad Digital, 8.192 exames, 4 scans manequim, largura de varredura de 8012,57 Hz, freqüência de offset para a supressão do sinal de água fixado em 4,70 ppm, 1,70 seg tempo de aquisição, pontos de dados de domínio 32.768 tempo (DT), 1 gradiente de duração ms (p16), 100 ms de atraso recuperação após gradiente (d16).
- Processo 1 H RMN Os espectros através da aplicação de um alargamento de linha de 1 Hz e de enchimento de zero por um factor de 2 (65.536 pontos de dados). Corrigir a fase e de linha de base manualmente e integrar. Definir pico TSP-d4 em 0,0 ppm.
- Recuperar o filtro armazenados, abra a folha de alumínio e transferir o filtro sobre uma superfície de Teflon limpa. Utilizando uma pinça e bisturi, cortar a parte exterior (branco) do filtro e descarte.
Exposição 2. Partícula
- Cultura configurado
- meios de crescimento completo quente contendo 10% de soro fetal de bovino (FBS) e solução de penicilina-estreptomicina (100 U / ml), solução de tripsina a 0,25% e de magnésio de fosfato de cálcio livre tampão salino (PBS) num banho de água (a 37 ° C) durante pelo menos 30 min antes do início da cultura.
- Retire um frasco T75 a partir de 5% de CO 2 incubadora contendo células cultivadas RAW264.7 e lavar as células com 2 ml de PBS pré-aquecido duas vezes.
- Desalojar as células aderentes RAW264.7 a partir do fundo do recipiente de cultura de tecido usando 1 ml de solução de tripsina pré-aquecida, seguido por raspagem.
- Recolher as células a partir do vaso de cultura de tecidos e fazer uma suspensão de células individuais por pipetagem repetida. Contar o número de células com azul de tripano e a placa a uma densidade de 8000 / cm2 (500.000 células totais) em uma placa de cultura de tecidos de 100 mm, com meio completo pré-aquecido. Ajustar o volume de suporte de 10 ml para uma concentração final de 50000 célulaspor ml.
NOTA: dobrar o número de placas se a análise de metilação do DNA também é realizada. - Colocar as células plaqueadas RAW264.7 recém volta em 5% de CO2 a 37 ° C e deixa-se aderir durante 24 h.
- Também em uma cabine de segurança biológica, ressuspender as partículas filtradas. Por exemplo, dilui-se as partículas a uma concentração de 0,5 mg / ml em PBS estéril para uma dose de tratamento de 5 ug / ml e de 5 mg / mL para uma dose de tratamento de 50 ug / ml. As diluições podem ser preparados até meses de antecedência e guardadas a -80 ° C.
- O tratamento com material particulado
- Retire as células de 5% de CO 2 incubadora e verificar em 10x utilizando um microscópio invertido para o crescimento celular, morfologia celular, condição de cultura e contaminação. Deve-se esperar ter, pelo menos, 30% de células confluentes na presente fase.
- Assepticamente, aspirar a mídia que usa a pipeta esterilizada e lavar o recipiente de cultura com 2 ml 37 ° C PBSduas vezes para remover completamente os meios de comunicação e células flutuantes ou mortas.
- Adicionar dose pré-determinada de material particulado por meio fresco nos vasos de cultura e incuba-se durante o tempo desejado a 37 ° C em 5% de CO2. Neste estudo, o tratamento de células com RAW264.7 PM durante 72 horas para paralelo a exposição utilizada para a análise e genotóxica epigenotoxic concomitante.
NOTA: A citotoxicidade pode afetar negativamente a qualidade da análise citogenética. Assim, ensaios adicionais, tais como citotoxicidade, a metilação do DNA, Western blotting, ou análise da expressão do gene são tipicamente realizadas em células tratadas. Expor as células como descrito e prosseguir com o ensaio específico desejado. usuários inexperientes também pode querer incluir um controlo positivo, tais como metanossulfonato de metilo para testar a sua capacidade de detectar CAs.
3. Ensaio citogenética
- Tratamento para prender células em metáfase
- Aqueça o colcemid assimlução (10 ug / ml) num banho de água a 37 ° C durante 30 min. Limpe a tampa com álcool a 70% no âmbito de um gabinete de biossegurança para minimizar o risco de contaminação
- Remover completamente os meios de comunicação de forma asséptica e lavar os recipientes de cultura com 2 ml de pré-aquecido PBS duas vezes.
- Adicionar meio fresco pré-aquecido (2 ml de meio / 10 6 células) contendo solução colcemida (5 ul / ml) no recipiente de cultura e incuba-se durante 2 h.
- colheita celular
- solução de tripsina quente e PBS num banho de água mantido a 37 ° C durante 30 min. A partir deste passo em diante, não há necessidade de manter a condição asséptica.
- Remover completamente meios, lavar os recipientes de cultura com 2 ml de 37 ° C de PBS por duas vezes, adicionar o volume necessário de uma solução de tripsina pré-aquecido (em geral, de 2 ml para placa de cultura de 60 mm ou frasco T25 e 4 ml de placa de 100 mm ou frasco T75 ), e colocar o recipiente de cultura de volta em 5% de CO2 a 37 ° C durante 1 min.
- Take o recipiente de cultura, retire as células usando um raspador, e adicione 10 ml de PBS para parar a ação de tripsina.
- Pipeta cima e para baixo, pelo menos, dez vezes para fazer a suspensão única célula e as células de transferência em um tubo de 15 ml de fundo cónico de centrífuga.
- suspensão de células Centrifugar a 400 xg durante 5 minutos em um balanço para fora centrifugadora à temperatura ambiente.
- Remover o sobrenadante, quebrar o sedimento celular batendo suavemente, adicionar 10 ml de PBS e, novamente, centrifugar durante cinco minutos.
- Tratamento hipotónico e fixação
- Pré-aquecido solução de cloreto de potássio 0,075 M em um banho de água 37 ° C pelo menos durante 30 min.
- Remover o sobrenadante sem perturbar o pelete de células e deixar cerca de 0,5 ml de PBS.
- Suavemente quebrar o sedimento de células e fazer a suspensão de células isoladas usando uma pipeta P200.
- Adicionar gota 4 ml de solução pré-aquecida de cloreto de potássio a gota, com agitação suave.
- Incubar as células em p hipotónicasolução de cloreto de otassium em um banho de água a 37 ° C durante 20 min.
- Faça solução acetomethanol fresco adicionando 3-peças metanol com 1-parte de ácido acético glacial. Manter este fixador recentemente preparada à temperatura ambiente.
- Após o tratamento hipotónico, adicionar um volume igual (4 ml) do fixador no tubo e misturar suavemente a solução por inversão do tubo.
- Centrifugar a 400 xg durante 5 min à temperatura ambiente, e remover o sobrenadante. Com esse tamanho de pelotas de células estágio aumenta, tornar-se esbranquiçada e mais visível.
- Remover o sobrenadante, adicionar 4 ml de fixador e mantê-la à temperatura ambiente durante 30 min.
- Centrifuga-se a 400 xg durante 5 minutos, remover o sobrenadante, e dar mais duas lavagens com 4 ml de fixador.
- De limpeza de slides e preparação metafase
- Imergir as lâminas de vidro completamente em detergente líquido a 10% durante 30 min.
- Enxaguar as lâminas cuidadosamente com água corrente fria por 30 min.
- Rinse desliza três vezes com água destilada para remover completamente o detergente, mergulhe em água destilada, e guarde na geladeira para uso futuro.
NOTA: A limpeza lâminas antes do uso facilita a uniformidade do espalhamento e aumenta a qualidade metáfase. - Gota suspensão de células 10 ul no slide molhado gelada e deixe-o ar seco durante a noite à temperatura ambiente.
- Coloração e montagem
- Prepare 50 ml de solução de coloração Giemsa pela mistura de uma parte da solução Giemsa com uma parte da PBS e despeje em um frasco Coplin.
- Imergir as lâminas em solução de coloração para 20 min.
- Lavar as lâminas em água destilada para remover o excesso de corante e imediatamente secar as lâminas através de um secador de cabelo.
- Deixar as lâminas à temperatura ambiente durante a noite.
- Aplique uma gota de meio de montagem no slide, coloque delicadamente uma lamela sobre o meio de montagem, permitem que o meio para espalhar sobre a lâmina lentamente e removao excesso de meio com uma toalha de papel. Permitir que a corrediça montada a secar durante pelo menos 1 h antes de se mudar ou visualização sob um microscópio para evitar o movimento da lamela.
Cuidado: É importante colocar a lamela cuidadosamente sem formar quaisquer bolhas durante este passo. A utilização de excesso de calor para remover as bolhas não é recomendado.
- Tipos de observação microscópica e de aberração
- Examine os CAs estruturais na metáfase se espalha pelo 100X usando um de boa qualidade microscópio de campo brilhante.
- Marque pelo menos 50 a 100 metáfase espalha para cada grupo de tratamento para tratamentos que induzem um grande número de autoridades de certificação. Para tamanhos de efeito menores, a análise de até 300 metáfase é aconselhada.
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Representative Results
Grande deve ser tomado cuidado na escolha da localização do dispositivo de amostragem de TSP, bem como a altura do ano em que a recolha é realizada. A composição química, bem como o tamanho das partículas pode influenciar significativamente os resultados. O material recolhido deve ser visível em relação ao filtro branco. Um rato metaphase propagação normais terá 40 cromossomos acêntricos. O objectivo da técnica é demonstrar uma alteração (ou ausência da mesma) na proporção de cromossomas anormais em células tratadas em comparação com os controlos. Essa mudança pode então ser quantificado (número de cromossomos anormais) e qualificado (tipo de anomalias).
De ratinho normal metáfase propagação terá 40 cromossomas acêntricos (Figura 3A). O tratamento com questões de partículas induz vários CAs como mostrado na Figura 3, como pausa chromatid (3b), fragmento acentric (
Figura 1. O volume de partículas totais em suspensão (PTS) amostrador alta. A imagem mostra o amostrador TSP instalado em um telhado em uma área urbana para recolher partículas ambientais. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. carregado de quartzo filtro de fibra de seguir coleção usando o elevado volume TSP smais amplo. Close-up no filtro instalado no amostrador TSP, após o uso. Note-se que a cor do filtro mudado de branco para cinza. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Fotomicrografia apresentando exemplos representativos de vários tipos de aberrações estruturais induzidas em células RAW264.7 após tratamento com diferentes concentrações de partículas. As aberrações são indicados por setas. (A) propagação normal de metáfase com 40 cromossomos acrocêntricos, (B) do tipo chromatid pausa (CTB), (C) fragmento acentric (acentrics), (D) cromossomo anel, (E) cromossomo dicêntrico (DIC), (F) de casal min (Dimn), (
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Discussion
estudo de citogenética ou análise microscópica dos números ou estruturas de cromossomos, principalmente nos spreads metáfase, fornece informações cruciais para o prognóstico, avaliação de risco e tratamento de várias doenças. está agora bem estabelecido que anomalias citogenéticas estão associados com a progressão e desenvolvimento de várias doenças, incluindo câncer. Até à data, as CAs foram encontrados em todos os principais tipos de tumores. CAs pode surgir espontaneamente ou por qualquer estímulos externos ou internos, tais como a radiação ionizante (IR) - um dos principais fatores de risco externos que podem induzir vários tipos de alterações citogenéticas 16. Análise da CAS auxilia na avaliação da dose de radiação absorvida (chamado citogenética biodosimetria radiação). Além disso, a análise da frequência e tipo de aberração específica também fornece informações importantes para determinar a qualidade da radiação sendo absorvido 17, 18. estudo de citogenética fornece uma imagem direta do icompactas de agentes nocivos sobre DNA. Isto está em contraste com técnicas indirectas de tais como o ensaio de cometa. No entanto, o estudo citogenética tem sido subutilizada em campos fora da radiação, em parte por causa das inúmeras hands-on passos envolvidos.
Embora a exposição a presente carbono orgânico na PM é conhecido por afetar negativamente a nossa saúde, alguns estudos que relatam efeitos biológicos incluem sua composição 9. Isto é devido aos métodos cromatográficos dispendiosos e morosos que exigem trabalho intensivo extracção, processamento, concentrações, e protocolos de derivatização, enquanto que só permitem perspectivas para um pequeno subconjunto de um tipo muito específico de compostos de cada vez. Além disso, os protocolos de resultar na destruição ou manipulação da amostra original substancial, assim, o teste adicional pode não ser realizada. Vantagens da análise de ressonância magnética nuclear (RMN) que incluem RMN é um método não destrutivo; que requer um número muito limitado de stePS (extracção, concentração) antes da análise, e instrumentos de RMN de alta frequência (a partir de 400 MHz a 900 MHz) estão disponíveis em muitos, se não todos, universidades núcleo no interior da instalação. Uma revisão abrangente de aerossol atmosférico estudos de RMN foi recentemente publicada 19. Finalmente, devido à sua capacidade para fornecer informação estrutural e ligações entre grupos, NMR é superior a outros métodos espectrométricos, tais como FT-IR, UV-Vis, e espectrometria de Raman que apenas fornecem dados sobre o tipo de grupos funcionais. Se necessário, a caracterização morfológica de PM pode ser aplicada juntamente com a espectrometria de RMN com o uso de microscopia electrónica de varrimento.
Mesmo a partir de um único local, a composição do PM recolhido pode variar, dependendo da altura do ano. Uma quantidade suficientemente grande de material devem ser tratados e mantidos a -80 ° C para experiências de repetição ou ensaios complementares. Os passos através 2.1.1 3.1.3 deve ser realizada em condições assépticas numa BIOSarmário de egurança. Se a contaminação ou morfologia celular comprometida é observado, não prossiga com o resto do protocolo. O tempo de tratamento com tripsina tem de ser ajustada com base no tipo de célula. Aqui, os macrófagos são muito aderente e verificou-se que uma combinação de 1 min tripsina e raspagem funciona melhor, mas sozinho tripsina durante 5 min obras para a maioria dos tipos de células. tempo de tratamento hipotónico também varia dependendo do tipo de célula e necessita de ser padronizado. O tempo de dosagem e tratamento de colcemida são os parâmetros mais importantes para a preparação cromossoma; uma sobre-dose pode matar as células ou parar o ciclo celular. Descrevemos aqui condições para células RAW264.7 e otimização é necessário para outros tipos de células. Fracasso em encontrar condições ideais nesta etapa podem afetar negativamente o índice mitótico, bem como morfologia dos cromossomos, que afetam os resultados. Recomenda-se também para avaliar os níveis de citotoxicidade do PM antes da análise citogenética e selecione as doses de acordo.
in vitro avaliações toxicológicas estão limitados pelo tipo de células utilizadas, a magnitude de exposição, e as concentrações de partículas. Além disso, no presente estudo, utilizou-se o extracto solúvel em água de PM e, por conseguinte, o potencial de espécies insolúveis em água para causar aberrações citogenéticas não pode ser contabilizada. Outras limitações estão associadas com a presença de "variantes polimórficas" - variações nas regiões centroméricos e braços curtos do cromossoma; alguns submicroscópico ou rearranjos crípticos que podem ser mal interpretadas e a presença de cariótipo complexos.
Aqui, demonstramos que a introdução de análise citogenética pode auxiliar na identificação de dano induzido por PM de ADN e pode potencialmente servir como um ponto de extremidade preditivo na avaliação dos efeitos de saúde causados por exposição a PM ambiente. Nosso estudo é, a nosso conhecimento, o primeiro para indicar CAs em resposta a PM. A replicação destes resultados édesejável para confirmar nossas descobertas. Este protocolo pode também ser adaptado para avaliar a quase qualquer tipo de suspeita de agente danificador de ADN.
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Acknowledgments
O trabalho foi apoiado, em parte, pelo Instituto Nacional do Centro de Pesquisa Biológica Excelência [número de concessão 1P20GM109005], o Grant Consortium Arkansas espaço através do National Aeronautics and Space Administration [número de concessão NNX15AK32A] Saúde e do Instituto Nacional de Segurança Ocupacional e saúde (NIOSH) [número de concessão 2T420H008436]. Os autores gostariam de agradecer a Christopher Fettes para revisão e edição deste manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Total suspended particulate sampler | Tisch Environmental | TE-5170 | |
| Bruker Avance III NMR spectrometer | Bruker | NA | |
| TopSpin 3.5/pl2 software | Bruker | NA | |
| ACD/NMR Processor Academic Edition | ACD/Labs | NA | |
| RAW264.7 murine macrophages | ATCC | ATCC TIB-71 | |
| High glucose DMEM GlutaMAX media | ThermoFisher | 10569010 | Warm in a 37 °C waterbath before use |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000044 | Warm in a 37 °C waterbath before use |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | ThermoFisher | 15140163 | Warm in a 37 °C waterbath before use |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher | 25200056 | Warm in a 37 °C waterbath before use |
| PBS, pH 7.4 | ThermoFisher | 10010049 | Warm in a 37 °C waterbath before use |
| KaryoMAX Colcemid Solution in PBS | ThermoFisher | 15212012 | Warm in a 37 °C waterbath before use |
| KaryoMAX Potassium Chloride Solution | ThermoFisher | 10575090 | Warm in a 37 °C waterbath before use |
| Methanol (HPLC) | Fisher Scientific | A452N1-19 | |
| Acetic Acid, Glacial | Fisher Scientific | BP1185-500 | |
| Decon Contrad 70 Liquid Detergent | Fisher Scientific | 04-355-1 | |
| Wright and Wright-Giemsa Stain Solutions | Fisher Scientific | 23-200733 | |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| Axio Imager 2 | Zeiss | NA |
References
- Lim, S. S., et al. A comparative risk assessment of burden of disease and injury attributable to 67 risk factors and risk factor clusters in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380, 2224-2260 (2012).
- IARC: Outdoor air pollution a leading environmental cause of cancer deaths. , IARC. Press Release 10-17-2013 (2013).
- Putaud, J., et al. A European aerosol phenomenology-2: chemical characteristics of particulate matter at kerbside, urban, rural and background sites in Europe. Atmos. Environ. 38 (16), 2579-2595 (2004).
- Hand, J., Schichtel, B., Pitchford, M., Malm, W., Frank, N. Seasonal composition of remote and urban fine particulate matter in the United States. J Geophys Res-Atmos. 117 (5), (2012).
- Schauer, J. J., et al. Source apportionment of airborne particulate matter using organic compounds as tracers. Atmos. Environ. 30 (22), 3837-3855 (1996).
- Simoneit, B. R. A review of biomarker compounds as source indicators and tracers for air pollution. Environ. Sci. Pollut. Res. 6 (3), 159-169 (1999).
- Kavouras, I. G., Stephanou, E. G. Particle size distribution of organic primary and secondary aerosol constituents in urban, background marine, and forest atmosphere. J Geophys Res-Atmos. 107 (8), (2002).
- Graber, E., Rudich, Y. Atmospheric HULIS: How humic-like are they? A comprehensive and critical review. Atmos. Chem. Phys. 6 (3), 729-753 (2006).
- Pöschl, U., et al. Atmospheric aerosols: composition, transformation, climate and health effects. Angew. Chem. Int. 44 (46), 7520-7540 (2005).
- Hou, L., et al. Altered methylation in tandem repeat element and elemental component levels in inhalable air particles. Environ. Mol. Mutagen. 55 (3), 256-265 (2014).
- Miousse, I. R., et al. Epigenetic alterations induced by ambient particulate matter in mouse macrophages. Environ. Mol. Mutagen. 55 (5), 428-435 (2014).
- Miousse, I. R., et al. In Vitro Toxicity and Epigenotoxicity of Different Types of Ambient Particulate Matter. Toxicol. Sci. 148 (2), 473-487 (2015).
- Ehrlich, M. Genomic instability in cancer development. Genome Instability in Cancer Development. , Springer. 363-392 (2005).
- Michael, S., Montag, M., Dott, W. Pro-inflammatory effects and oxidative stress in lung macrophages and epithelial cells induced by ambient particulate matter. Environ Pollut. 183, 19-29 (2013).
- Li, N., et al. Induction of heme oxygenase-1 expression in macrophages by diesel exhaust particle chemicals and quinones via the antioxidant-responsive element. J Immunol. 165 (6), 3393-3401 (2000).
- Pathak, R., Ramakumar, A., Subramanian, U., Prasanna, P. G. Differential radio-sensitivities of human chromosomes 1 and 2 in one donor in interphase- and metaphase-spreads after 60Co gamma-irradiation. BMC Med. Phys. 9, 6649 (2009).
- Pathak, R., Dey, S. K., Sarma, A., Khuda-Bukhsh, A. R. Genotoxic effects in M5 cells and Chinese hamster V79 cells after exposure to 7 Li-beam (LET= 60keV/µm) and correlation of their survival dynamics to nuclear damages and cell death. Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 628 (1), 56-66 (2007).
- Pathak, R., Dey, S. K., Sarma, A., Khuda-Bukhsh, A. R. Cell killing, nuclear damage and apoptosis in Chinese hamster V79 cells after irradiation with heavy-ion beams of 16 O, 12 C and 7 Li. Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 632 (1), 58-68 (2007).
- Chalbot, M. C., Kavouras, I. G. Nuclear magnetic resonance spectroscopy for determining the functional content of organic aerosols: a review. Environ. Pollut. 191, 232-249 (2014).
