Summary
يصف هذا البروتوكول تقنيات القياس الكمي وتوصيف التشوهات الكروموسومية في المختبر في الضامة الماوس RAW264.7 بعد العلاج مع المحيط الجسيمات الجوية.
Abstract
التعرض لجسيمات (PM) هو مشكلة صحية عالمية رئيسية، والتي قد تؤدي إلى تلف المكونات الخلوية المختلفة، بما في ذلك المادة الوراثية النووية. لتقييم تأثير PM على سلامة الوراثية النووية، وسجل التشوهات الكروموسومية الهيكلية في هوامش الطورية من خلايا البلاعم الماوس RAW264.7. PM يتم جمعها من الهواء المحيط مع جزيئات العينات مجموعه كبيرة الحجم مع وقف التنفيذ. وبالفاعلات المواد التي تم جمعها وتصفيتها للاحتفاظ، جزء غرامة للذوبان في الماء. تتميز الجزيئات عن التركيب الكيميائي بواسطة الرنين المغناطيسي النووي (NMR) الطيفي. يتم إضافة تركيزات مختلفة من الجسيمات تعليق على ثقافة في المختبر الضامة الماوس RAW264.7 لمجموع الوقت تعرض 72 ساعة، جنبا إلى جنب مع الخلايا السيطرة غير المعالجة. في نهاية التعرض، ويتم التعامل مع الثقافة مع colcemid إلقاء القبض على خلايا في الطورية. الخلايا ثم حصادها، وتعامل مع محلول ناقص التوتر، ثابتة في acetomethanol، دropped على الشرائح الزجاجية وملطخة أخيرا مع حل بالغيمزا. يتم فحص الشرائح لتقييم الانحرافات الهيكلية الكروموسومات (CAS) في ينتشر الطورية في 1،000X التكبير باستخدام المجهر مشرق الميدان. وسجل 50-100 انتشار الطورية لكل مجموعة العلاج. ويتم تكييف هذه التقنية للكشف عن الانحرافات الهيكلية الكروموسومات (CAS)، مثل فواصل كروماتيدي من نوع، كروماتيدي من نوع التبادل، شظايا لامركزية، الكروموسومات ذو مركزين وخاتم، دقيقة مزدوجة، تنسخ داخلي، ونقل المواقع روبرتسوني في المختبر بعد التعرض للجسيمات. وهي طريقة قوية لربط نقطة نهاية الوراثية الخلوية راسخة لتعديلات جينية.
Introduction
وتشير التقديرات إلى أن التعرض لجسيمات (PM) يسبب أكثر من 3 ملايين حالة وفاة إضافية سنويا، في المقام الأول من أمراض القلب وسرطان الرئة 1. في الواقع، تم الاعتراف PM أنها مسرطنة للبشر من قبل الوكالة الدولية لبحوث السرطان (المجموعة 1)، وزيادة خطر الإصابة بسرطان الرئة مع زيادة مستويات التعرض للجسيمات وقد تبين 2. ومن المثير للاهتمام، تقريبا كل الخلايا السرطانية تؤوي شذوذ الكروموسومات العددية و / أو الهيكلية. الكربون العضوي الجسيمات هو البديل، مجمع، وخليط غير متجانس، وتركيبتها وحجم التوزيع يعتمد على الانبعاثات وكذلك التحولات الفيزيائية والكيميائية. وتمثل 35-55٪ من المناطق الحضرية PM 2.5 كتلة (PM 2.5 ميكرون في الحجم وأصغر) وأكثر من 60٪ من المناطق الريفية والقاري خلفية PM 2.5 كتلة 3، 4. حسابات الكسر للذوبان في الماء ل30-90٪ من الهباء الجوي العضوي. وهناك عدد كبير من المركبات العضويةتم التعرف عليها، بما في ذلك الهيدروكربونات الأليفاتية، والهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات، ومشتقاتها الاوكسيجين والمنترزة، والألدهيدات الأليفاتية والكحول والأحماض الدهنية الحرة وأملاحها، والأحماض دى الكربوكسيلية، والمركبات متعددة الوظائف، والبروتينات، والجزيئات الشبيهة الدبالية (HULIS) باستخدام طرق الكروماتوغرافي إلى جانب تقنيات قياس الطيف الكتلوي 5-8. وتمثل هذه المركبات أقل من 10-20٪ من الكربون العضوي الجسيمات، وبالتالي معظم الكربون العضوي غير معروف 9.
وتشير الأدلة التجريبية التي السمية الخلوية، الاكسدة، والتهاب تشارك في تطوير الحالات المرضية المرتبطة PM. وقد تبين في الآونة الأخيرة، مع ذلك، أن التعرض للجسيمات النتائج أيضا في عدد من تعديلات جينية، بما في ذلك التغيرات في الحامض النووي من العناصر المتكررة، في كل من التجريبية في أنظمة المختبر وفي المواد البشرية 10-12. ذات أهمية خاصة هي آثارمساء يوم الحمض النووي الفضائية - الأقمار الصناعية الرئيسية والثانوية - والتي توجد في المنطقة كروماتين متغاير حول السنترومير من الكروموسومات. وقد تبين أن هذه الآثار قد تكون مستمرة بطبيعتها، لأنها يمكن أن يتم الكشف عن لا يقل عن 72 ساعة بعد التعرض 12. تغيرات في الحامض النووي، وخاصة حول القسيم، قد يؤدي إلى تراكم النصوص مرنا الحمض النووي الأقمار الصناعية، وسط سلامة الكروموسومات خلال انقسام الخلايا، وبعد ذلك يؤدي إلى تطوير مجموعة متنوعة من الحالات المرضية 13.
تكييف نهج الوراثي الخلوي لتحليل المصدقة بمثابة نقطة نهاية تعديلات جينية تسبب بها مساء، وبالتالي، هو من أهمية قصوى. هنا، نحن تقرير نهج لPM جمع المحيطة والإعداد، في التعرض المختبر وتحليل المصدقة استخدام نظام بلعم نموذج RAW264.7 الفئران. تشمل الضامة خط الدفاع الأول ضد الأجسام الغريبة المستنشقة، وبالتالي، ريخدم خط زنزانته كما ثابتة والأكثر استخداما نموذج في الجسيمات وعلم السموم 11، 12، 14، 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. الجسيمات جمع وإعداد
- معايرة الجسيمات العينات مجموعه كبيرة الحجم مع وقف التنفيذ
- قطع المحرك العينات من وحدة تحكم التدفق الجماعي وربط المحرك إلى مستقر مصدر طاقة تيار متردد (الشكل 1).
ملاحظة: لا يتم استخدام فلتر أثناء هذا الإجراء. - جبل فتحة تدريج وأعلى تحميل لوحة محول لأخذ العينات. تشديد أعلى محول تحميل المكسرات عقد لأسفل بشكل آمن لضمان عدم تسرب الهواء موجودة. السماح للمحرك العينات في عملية الاحماء لفي درجة حرارة التشغيل العادية (حوالي 10-15 دقيقة).
- إجراء اختبار تسرب من خلال تغطية الثقوب على رأس الفوهة والضغط الحنفية على فوهة مع اليدين. الاستماع لصوت الأنين عالي النبرة التي الهروب الهواء. إذا سمع هذا الصوت، وإعادة تشديد أعلى محول تحميل المكسرات عقد لأسفل كما تسرب موجودا. إذا كان الصوت هو أقل من ذلك، وتسرب بالقرب من الحشوات الأخرى في تميز الكليةتيم.
- ربط جانب واحد من مقياس الماء لضغط الصنبور على جانب الفوهة مع فراغ أنبوب المطاط. ترك الجانب الآخر من مقياس مفتوح إلى الغلاف الجوي. عقد مقياس عموديا لضمان قراءات دقيقة. والتنصت على مساعدات من مسجل تدفق مستمر مساعدة لتوسيط القلم وتوفير قراءات دقيقة.
- كرر الخطوة 1.1.2 باستخدام خمسة معدلات تدفق تمثل العاملة معدلات تدفق 30-60 قدم / دقيقة (تقريبا كل 5-6 قدم 3 / دقيقة). ضبط مقبض الباب على فوهة متغيرة إلى خمسة مواقع مختلفة، ويستغرق خمس قراءات مختلفة.
- تسجيل درجة حرارة الغرفة الهواء والضغط الجوي المحيط، والرقم التسلسلي العينات، فتحة الرقم التسلسلي، منحدر فوهة واعتراض مع آخر موعد مصدق، تاريخ، موقع الموقع، والأحرف الأولى المشغل على ورقة المعايرة.
- قطع المحرك العينات من وحدة تحكم التدفق الجماعي وربط المحرك إلى مستقر مصدر طاقة تيار متردد (الشكل 1).
- مجموع جمع الجسيمات العالقة العينة والتحليل الوزني
- التفاف على8 "× 10" فلتر الألياف الكوارتز في طبقتين من رقائق الألومنيوم. وضع مرشح ملفوفة في الفرن وضبط درجة الحرارة عند 550 درجة مئوية. خبز مرشح للا يقل عن 4 ساعة. دع بارد الفرن واسترداد التصفية. وضع مرشح في مجفف مع كربونات الكالسيوم 3.
- تزن مرشح في توازن دقيق مع دقة 10 ميكروغرام. كرر القياس ثلاث مرات خلال يوم واحد. وينبغي أن تكون القياسات الفردية ضمن 25 ميكروغرام. وإذا لم يتحقق هذا، والعودة مرشح ملفوفة إلى مجفف وتكرار هذه العملية في اليوم التالي.
- فتح غطاء المأوى (الشكل 2). إزالة فلتر إطار حامل من خلال تخفيف الجوز الجناح أربعة، والسماح للمسامير النحاس وغسالات للتأرجح أسفل للخروج من الطريق. تتكشف مرشح من رقائق الألومنيوم، واستخدام ملقط تنظيفها إلى مركز بعناية، جنبا عورة حتى، على الشاشة الداعمة. صحيح محاذاة مرشح على الشاشة.
- وضع الإطار على الشاشة وضمان الحصول عليها معمسامير النحاس وغسالات أثناء تطبيق ما يكفي من الضغط لتجنب تسرب الهواء عند الحواف. مسح أي تراكم الغبار من جميع أنحاء حامل مرشح بقطعة قماش نظيفة. انهيار المأوى غطاء بعناية وضمان الحصول عليها.
- تأكد من توصيل جميع الأسلاك إلى مآخذ عاء المناسبة ويتم توصيل الأنابيب بين ضغط الصنبور منفاخ السيارات ومسجل تدفق مستمر.
- إعداد مسجل التدفق. خفض القلم ذراع الرافعة لرفع نقطة القلم وإدراج مخطط جديد. محاذاة علامة التبويب الرسم البياني إلى محور محرك مسجل والضغط مع الإبهام لخفض مركز الرسم البياني على المحور. ضبط الوقت عن طريق تناوب محور حملة عقارب الساعة حتى يتم محاذاة الوقت الصحيح على الرسم البياني مع مؤشر الرقم القياسي الوقت.
- التبديل يدويا على العينات والبدء في جمع. مراقبة مسجل للتأكد من أنه يتم التحبير بشكل صحيح ومؤشر الوقت المنقضي للتأكد من أنها تعمل بشكل صحيح.
- في نهاية فترة أخذ العينات، وإيقاف العينات، سجلفي الوقت المنقضي واسترداد الرسم البياني. إزالة الإطار لفضح مرشح. إزالة عامل التصفية يتعرض من الشاشة دعم بوضعها بلطف في نهايات مع ملقط. أضعاف مرشح بالطول بحيث تلامس تلك العينة العينة مرتين والتفاف عليه في رقائق الألومنيوم الأصلي.
- تخزين مرشح في مجفف مع كربونات الكالسيوم 3 لا يقل عن 24 ساعة قبل وزنها. كرر الخطوة 1.2.2 لقياس الوزن من المرشحات بعد أخذ العينات. وضع مرشح في كيس من البلاستيك والرمز البريدي وتخزينه في -80 درجة مئوية حتى التحليل.
- تحليل عينة جمعت مجموع الجسيمات العالقة
- استرداد مرشح المخزنة، تتكشف رقائق الألومنيوم ونقل مرشح على سطح تفلون نظيفة. باستخدام ملقط ومشرط، وقطع الخارجي (الأبيض) جزءا من تصفية والتخلص منها.
- المقبل، وقطع مرشح في 0.5 "س 0.5" القطع والقطع مكان في قارورة 100 مل. إضافة 50 مل من الماء عالى النقاء. ضع قارورة في الموجات فوق الصوتيةحمام ويصوتن لمدة 60 دقيقة في 33 ± 3 كيلو هرتز.
- استخراج مرشح من خلال 0.45 ميكرون البولي بروبلين حقنة مرشح إلى 100 مل قارورة أسفل جولة. تتبخر المياه باستخدام أداة rotavap تحت الضغط عند 50 درجة مئوية حتى حوالي 5 مل من استخراج يبقى في قارورة.
- تتبخر المياه المتبقية في 15 مل قارورة على شكل كمثرى من الوزن المعروفة. وزن القارورة مع استخراج الجافة وتسجيل كتلة استخراج الجافة.
- حل العينة الجافة مع 400 ميكرولتر من D 2 O من قبل sonicating لمدة 15 دقيقة ونقل إلى 5 مم أنبوب NMR القياسية. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 12000 x ج في درجة حرارة الغرفة لإزالة أي مواد غير منحل.
- كرر مع 300 ميكرولتر من D 2 O. إضافة 10 ميكرولتر من نان 3 1.4٪ (اضرب النهائي: 0.02٪ ث / ت) في أنبوب NMR. إضافة 10 ميكرولتر (32 ميكروغرام) من مجموع الجسيمات العالقة (TSP) -d4 (3.2 ملغ / مل) إلى D 2 O (تركيز النهائي 0.258 ملم) في أنبوب NMR.
- الحصول على 1 أطياف H NMR باستخدام مطياف الرنين المغناطيسي التي تعمل على 600.17 ميغاهيرتز.
- إدراج أنبوب NMR في مسبار بالبرد الرنين الثلاثي. معايرة أجهزة القياس في الترتيب التالي: قفل، لحن، الرقائق، 90 ° النبض طول معايرة وضبط الربح الاستقبال.
- قياس أطياف عند 25 درجة مئوية مع 1 D الإثارة النحت تسلسل باستخدام 180 البقول انتقائية في الماء في وضع الكشف رباعية الرقمية، 8192 بالاشعة، 4 بالاشعة دمية، عرض اكتساح 8012.57 هرتز، تردد تعويض لقمع إشارة المياه وضعت في 4.70 جزء من المليون، 1.70 ثانية اكتساب الوقت، 32،768 مرة نقاط البيانات المجال (TD)، 1 مللي ثانية مدة التدرج (P16)، و 100 μsec تأخير الانتعاش بعد التدرج (D16).
- عملية 1 H NMR الأطياف من خلال تطبيق توسيع خط 1 هرتز والصفر ملء بمعامل 2 (65،536 نقاط البيانات). تصحيح المرحلة والأساس يدويا والاندماج. تعيين TSP-D4 الذروة عند 0.0 جزء في المليون.
- استرداد مرشح المخزنة، تتكشف رقائق الألومنيوم ونقل مرشح على سطح تفلون نظيفة. باستخدام ملقط ومشرط، وقطع الخارجي (الأبيض) جزءا من تصفية والتخلص منها.
2. الجسيمات التعرض
- ثقافة أقامت
- دافئ وسائط النمو الكامل تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) وحل البنسلين ستربتومايسين (100 U / مل)، 0.25٪ حل التربسين والمغنيسيوم والكالسيوم فوسفات الحرة عازلة المالحة (PBS) في حمام مائي (عند 37 درجة مئوية) لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل بدء الثقافة.
- أخرج قارورة T75 من 5٪ CO 2 الحاضنة تحتوي على خلايا RAW264.7 مثقف وغسل الخلايا مع 2 مل من درجة حرارة قبل برنامج تلفزيوني مرتين.
- إزاحة الخلايا الملتصقة RAW264.7 من الجزء السفلي من السفينة زراعة الأنسجة باستخدام 1 مل من قبل حرارة حل التربسين تليها كشط.
- جمع الخلايا من السفينة زراعة الأنسجة وجعل التعليق خلية واحدة من قبل pipetting المتكررة. حساب عدد الخلايا مع التريبان الأزرق ولوحة في مناطق ذات كثافة من 8000 / سم 2 (500،000 خلايا الكلية) في 100 ملم صحن زراعة الأنسجة مع وسائل الإعلام كاملة استعد مسبقا. ضبط حجم وسائل الإعلام إلى 10 مل لتركيز النهائي من 50،000 خلايالكل مل.
ملاحظة: مضاعفة عدد من لوحات إذا أجري أيضا تحليل الحامض النووي. - وضع خلايا RAW264.7 مطلية حديثا مرة أخرى في 5٪ CO 2 حاضنة عند 37 درجة مئوية، والسماح لنعلق لمدة 24 ساعة.
- أيضا في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية، و resuspend الجسيمات التي تمت تصفيتها. على سبيل المثال، وتمييع الجسيمات بتركيز 0.5 ملغ / مل في برنامج تلفزيوني العقيمة ل/ جرعة العلاج مل 5 ميكروغرام وفي 5 ملغ / مل ل/ جرعة العلاج مل 50 ميكروغرام. التخفيفات يمكن إعداد لمدة شهر مقدما وتخزينها في -80 درجة مئوية.
- العلاج مع الجسيمات
- إخراج الخلايا من 5٪ CO 2 الحاضنة والاختيار تحت التكبير 10x باستخدام مجهر مقلوب لنمو الخلايا، مورفولوجيا الخلايا، شرط الثقافة، والتلوث. ينبغي للمرء أن يتوقع أن يكون خلايا متكدسة 30٪ على الأقل في هذه المرحلة.
- جو معقم و مطهر، نضح في وسائل الإعلام باستخدام ماصة معقمة وغسل سفينة الثقافة مع 2 مل 37 درجة مئوية في برنامج تلفزيونيمرتين لإزالة تماما وسائل الإعلام والخلايا العائمة أو ميتا.
- إضافة جرعة محددة مسبقا من الجسيمات مع وسائل الإعلام الجديدة في الأوعية الثقافة واحتضان لمدة الوقت المطلوب عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة. في هذه الدراسة، وعلاج الخلايا RAW264.7 مع رئيس الوزراء لمدة 72 ساعة موازية التعرض المستخدمة لتحليل السمية وepigenotoxic المتزامنة.
ملاحظة: السمسة قد تؤثر سلبا على نوعية التحليل الوراثي الخلوي. لذلك، فحوصات إضافية مثل السمية الخلوية، الحامض النووي، غرب النشاف، أو تحليل التعبير الجيني تتم عادة على الخلايا المعالجة. كشف الخلايا كما هو موضح والمضي قدما في فحص معين المطلوب. مستخدمين عديمي الخبرة قد تحتاج أيضا لتشمل مراقبة إيجابية مثل methanesulphonate الميثيل لاختبار قدرتها على كشف المصدقة.
3. الفحص الوراثي الخلوي
- العلاج لاعتقال خلايا في الطورية
- تدفئة colcemid ذلكlution (10 ميكروغرام / مل) في 37 ° C حمام الماء لمدة 30 دقيقة. مسح الغطاء مع 70٪ من الكحول في إطار مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية للحد من مخاطر التلوث
- تماما إزالة وسائل الإعلام جو معقم و مطهر وغسل الأوعية الثقافة مع 2 مل قبل تحسنت برنامج تلفزيوني مرتين.
- إضافة وسائط جديدة استعد مسبقا (2 مل سائل الإعلام / 10 6 خلايا) التي تحتوي على حل colcemid (5 ميكرولتر / مل) في سفينة الثقافة واحتضان لمدة 2 ساعة.
- حصاد الخلايا
- دافئ حل التربسين وبرنامج تلفزيوني في حمام مائي الحفاظ على 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. من هذه الخطوة فصاعدا، ليست هناك حاجة للحفاظ على حالة العقيم.
- تماما إزالة وسائل الإعلام، وغسل الأوعية الثقافة مع 2 مل 37 درجة مئوية في برنامج تلفزيوني لمرتين، إضافة إلى حجم المطلوب من قبل حرارة حل التربسين (عادة 2 مل لطبق ثقافة 60 ملم أو قارورة T25 و 4 مل لطبق 100 ملم أو قارورة T75 )، ووضع سفينة الثقافة مرة أخرى في 5٪ CO 2 حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.
- تاكه من سفينة الثقافة، فصل الخلايا باستخدام مكشطة، وإضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني لوقف العمل التربسين.
- ماصة صعودا وهبوطا عشر مرات على الأقل لجعل تعليق خلية واحدة ونقل الخلايا في 15 مل المخروطية أنبوب أسفل الطرد المركزي.
- تعليق خلية أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق في أرجوحة من أجهزة الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة طاف، وكسر بيليه الخلية عن طريق التنصت لطيف، إضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني، ومرة أخرى أجهزة الطرد المركزي لمدة خمس دقائق.
- علاج ناقص التوتر والتثبيت
- قبل دافئ 0.075 محلول كلوريد البوتاسيوم M في حمام ماء C 37 درجة على الأقل لمدة 30 دقيقة.
- إزالة طاف دون الإخلال بيليه الخلية وترك ما يقرب من 0.5 مل من برنامج تلفزيوني.
- كسر بلطف بيليه الخلية وتقديم تعليق خلية واحدة باستخدام ماصة P200.
- إضافة 4 مل من قبل حرارة كلوريد البوتاسيوم انخفاض حل قطرة مع اهتزاز لطيف.
- احتضان الخلايا في ص منخفض التوترمحلول كلوريد otassium في 37 ° C حمام الماء لمدة 20 دقيقة.
- جعل حل acetomethanol وذلك بإضافة 3 أجزاء الميثانول مع 1 جزء حمض الخليك الجليدي. الحفاظ على هذا تثبيتي الطازجة في درجة حرارة الغرفة.
- بعد العلاج ناقص التوتر، إضافة حجم مساو (4 مل) من تثبيتي في أنبوب وتخلط بلطف الحل عن طريق أنبوب للقلب.
- أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وإزالة طاف. في هذه المرحلة الخلية بيليه زيادة حجم، وتصبح بيضاء وأكثر وضوحا.
- إزالة طاف، إضافة 4 مل مثبت الطازجة والحفاظ على درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
- أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق، وإزالة طاف، وإعطاء اثنين من أكثر يغسل مع تثبيتي 4 مل.
- تنظيف الشريحة والطورية إعداد انتشار
- تزج الشرائح الزجاجية تماما في 10٪ المنظفات السائلة لمدة 30 دقيقة.
- شطف الشرائح جيدا في ماء الصنبور البارد الجاري لمدة 30 دقيقة.
- رينحد ذاته ينزلق ثلاث مرات مع الماء المقطر لإزالة المنظفات، وتزج في الماء المقطر، وتخزينها في الثلاجة لاستخدامها في المستقبل.
ملاحظة: تنظيف الشرائح قبل الاستخدام يسهل توحيد الانتشار ويزيد من جودة الطورية. - إسقاط تعليق خلية 10 ميكرولتر على الشريحة الرطب المبردة والسماح للهواء الجاف بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
- تلطيخ والتركيب
- تجهيز 50 مل بالغيمزا حل تلطيخ عن طريق خلط جزء واحد من بالغيمزا حل وصمة عار مع جزء واحد من برنامج تلفزيوني وتصب في جرة Coplin.
- تزج الشرائح في حل تلطيخ لمدة 20 دقيقة.
- شطف الشرائح في الماء المقطر لإزالة وصمة عار الزائدة وعلى الفور تجف الشرائح باستخدام مجفف الشعر.
- ترك الشرائح في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.
- تطبيق قطرة واحدة من تصاعد المتوسطة على الشريحة، ضع بلطف ساترة على المتوسطة المتزايدة، تسمح على المديين المتوسط وتنتشر على الشريحة ببطء، وإزالةالمتوسط الزائدة مع منشفة ورقية. السماح للشريحة التي شنت لتجف لمدة لا تقل عن 1 ساعة قبل نقل أو عرض تحت المجهر لتجنب حركة ساترة.
تحذير: من المهم أن تضع ساترة بعناية دون تشكيل أي فقاعات خلال هذه الخطوة. لا ينصح استخدام الحرارة المفرطة لإزالة الفقاعات.
- الملاحظة المجهرية وانحراف أنواع
- دراسة الاكاديمية الهيكلية في الطورية ينتشر في التكبير 100X باستخدام نوعية جيدة المجهر مشرق الميدان.
- تسجيل ما لا يقل عن 50 لينتشر 100 الطورية لكل مجموعة لعلاج العلاجات التي تحفز على عدد كبير من الاكاديمية. لأحجام تأثير أصغر، وينصح تحليل ما يصل الى 300 ينتشر الطورية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يجب توخي الحذر الشديد في اختيار الموقع من العينات TSP، فضلا عن الوقت من السنة عندما يتم تنفيذ مجموعة. التركيب الكيميائي وكذلك حجم الجسيمات قد تؤثر بشكل كبير على النتائج. المواد التي تم جمعها يجب أن تكون واضحة ضد مرشح أبيض. وهناك الفأر العادي انتشار الطورية يكون 40 الكروموسومات لامركزية. والهدف من هذه التقنية هو لإثبات تغيير (أو انتفائها) في نسبة الكروموسومات غير طبيعية في الخلايا المعالجة مقابل الضوابط. أن التغيير يمكن أن ثم يكون كميا (عدد كروموسومات غير طبيعية) والمؤهل (نوع من الشذوذ).
سوف العادي الماوس انتشار الطورية يكون 40 الكروموسومات لامركزية (الشكل 3A). العلاج مع الجسيمات يستحث مختلف المصدقة كما هو مبين في الشكل (3)، مثل كسر الكروماتيدات (3B)، جزء لامركزي (
الشكل 1. عالية حجم مجموع الجسيمات العالقة (TSP) العينات. يظهر في الصورة العينات TSP المثبتة في السقف في منطقة حضرية لجمع الجزيئات المحيطة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
بعد جمع الشكل 2. تحميل الكوارتز فلتر الألياف باستخدام ارتفاع حجم TSP الصورةampler. عن قرب على مرشح المثبتة على العينات TSP، وبعد الاستخدام. لاحظ أن لون مرشح تغير من الأبيض إلى الرمادي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. صورة مجهرية تظهر الأمثلة النموذجية على أنواع مختلفة من الانحرافات الهيكلية التي يسببها في خلايا RAW264.7 بعد علاج مع تركيزات مختلفة من الجسيمات. يشار إلى الانحرافات التي كتبها السهام. (أ) انتشار الطورية العادي مع 40 الكروموسومات طرفي القسيم المركزي، (ب) كروماتيدي من نوع انقطاع (CTB)، (C) جزء لامركزي (acentrics)، (د) حلقة كروموسوم، (E) كروموسوم ثنائي القسيم المركزي (DIC)، (F) المزدوج دقيقة (Dimn)، (
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وتقدم الدراسة الوراثية الخلوية أو التحليل المجهري للأرقام أو هياكل الكروموسومات، في المقام الأول في هوامش الطورية، معلومات مهمة للتشخيص وتقييم المخاطر، والعلاج لمختلف الأمراض. والآن راسخة أن تشوهات الوراثية الخلوية وترتبط مع التقدم والتطور من العديد من الأمراض، بما في ذلك السرطان. حتى الآن، تم العثور على المصدقة في جميع أنواع الأورام الرئيسية. قد تنشأ المصدقة من تلقاء أنفسهم أو من قبل أي مؤثرات خارجية أو داخلية، مثل الإشعاع المؤين (الأشعة تحت الحمراء) - واحدة من عوامل الخطر الخارجية الرئيسية التي يمكن أن تحفز أنواع مختلفة من التعديلات الوراثي الخلوي 16. تحليل المصدقة يساعد في تقييم الجرعة الإشعاعية الممتصة (وتسمى خلوي biodosimetry الإشعاع). وعلاوة على ذلك، يوفر تحليل التردد ونوع من انحراف معين أيضا معلومات هامة لتحديد نوعية الإشعاع يجري استيعاب 17 و 18. وتقدم الدراسة الوراثية الخلوية صورة مباشرة للطMPACT وكلاء ضار على الحمض النووي. هذا هو على النقيض من الأساليب غير المباشرة لمثل الفحص المذنب. ومع ذلك، فقد كانت الدراسة الوراثية الخلوية غير المستغلة في الحقول خارج من الإشعاع، وذلك جزئيا بسبب العديد من التدريب العملي على الخطوات المتبعة.
على الرغم من أن التعرض لالعضوي الحاضر الكربون في رئيس الوزراء هو معروف أن تؤثر سلبا على صحتنا، عدد قليل من الدراسات الإبلاغ عن التأثيرات البيولوجية وتشمل تكوينها 9. ويرجع ذلك إلى أساليب الكروماتوغرافي مكلفة ومرهقة التي تتطلب استخراج كثيفة العمالة، وتجهيز وتركيز، والبروتوكولات اشتقاق هذا، في حين أنها لا توفر سوى رؤى لمجموعة فرعية صغيرة من نوع خاص جدا من المركبات في كل مرة. وعلاوة على ذلك، فإن البروتوكولات تؤدي إلى التلاعب الكبير أو تدمير العينة الأصلية، وبالتالي، يتم إجراء اختبارات إضافية لا يمكن أن يؤديها. وتشمل مزايا التحليل النووي بالرنين المغناطيسي (NMR) أن NMR هي طريقة غير المدمرة. أنها تتطلب عددا محدودا جدا من الظريفملاحظة (الاستخراج، وتركيز) قبل التحليل، وأدوات NMR عالية التردد (من 400 ميغاهيرتز إلى 900 ميغاهيرتز) وتتوفر في العديد، إن لم يكن كلها، والجامعات داخل مرفق الأساسية. استعراض شامل لالهباء الجوي دراسات الرنين المغناطيسي قد نشرت مؤخرا 19. أخيرا، بسبب قدرتها على توفير المعلومات والروابط بين الجماعات الهيكلية، NMR متفوقة على وسائل الطيفي أخرى مثل FT-IR والأشعة فوق البنفسجية فيس، ورامان الطيفي التي توفر البيانات فقط على نوع من المجموعات الوظيفية. إذا لزم الأمر، التوصيف المورفولوجي للPM لا يمكن أن يؤديها بالإضافة إلى NMR الطيفي باستخدام المجهر الإلكتروني.
حتى من موقع واحد، وتكوين PM جمع قد تختلف اعتمادا على الوقت من السنة. وهناك كمية كبيرة كافية من المواد يجب أن تتم معالجتها والاحتفاظ بها في -80 درجة مئوية لمدة تكرار التجارب أو فحوصات تكميلية. الخطوات 2.1.1 خلال 3.1.3 يجب أن يتم تنفيذ جو معقم و مطهر في السير مجلس الوزراء afety. إذا لوحظ تلوث أو خطر التشكل الخلوي، لا المضي قدما مع بقية البروتوكول. يحتاج وقت العلاج التربسين إلى تعديلها على أساس نوع من الخلايا. هنا، الضامة هي ملتصقة جدا ولقد وجدنا أن مجموعة من التربسين 1 دقيقة وكشط يعمل بشكل أفضل، ولكن التربسين وحده لمدة 5 دقائق يعمل لمعظم أنواع الخلايا. وقت العلاج منخفض التوتر يختلف أيضا اعتمادا على نوع من الخلايا ويحتاج إلى أن تكون موحدة. الجرعة والعلاج وقت colcemid هي أهم المعايير لإعداد كروموسوم. والإفراط في الجرعة يمكن أن تقتل الخلايا أو المماطلة دورة الخلية. نحن هنا وصف الظروف للخلايا RAW264.7، ومطلوب الأمثل لأنواع أخرى من الخلايا. الفشل في العثور على ظروف مثالية في هذه الخطوة قد تؤثر سلبا على مؤشر الإنقسامية وكذلك مورفولوجيا كروموسوم، مما يؤثر على النتائج. ويوصى أيضا لتقييم مستويات للخلايا رئيس الوزراء قبل التحليل الوراثي الخلوي وتحديد الجرعات وفقا لذلك.
= "jove_content"> من الناحية النظرية، في المختبر تقييم السمية محدودة بسبب نوع من الخلايا المستخدمة، حجم التعرض، وتركيزات الجسيمات. وعلاوة على ذلك، في هذه الدراسة، ونحن الاستفادة من استخراج للذوبان في الماء من الوزراء و، لذلك، قد لا يتم احتساب إمكانيات الأنواع غير قابلة للذوبان في الماء لسبب الانحرافات الوراثية الخلوية. ترتبط قيود أخرى مع وجود "متغيرات متعددة الأشكال" - تغيرات في المناطق القسيم المركزي والأسلحة قصيرة من كروموسوم. بعض غير مرئي بالمجهر أو إعادة ترتيب خفي التي قد يساء تفسيرها وجود كروتب] معقدة.
هنا، علينا أن نظهر أن إدخال التحليل الوراثي الخلوي قد تساعد في تحديد الضرر الناجم PM لالحمض النووي ويحتمل أن يكون بمثابة نقطة النهاية التنبؤية في تقييم الآثار الصحية الناجمة عن التعرض لالمحيطة PM. دراستنا هي، على حد علمنا، أول واحد للإشارة المصدقة ردا على PM. تكرار هذه النتائجمرغوب فيه لتأكيد النتائج التي توصلنا إليها. ويمكن أيضا أن تتكيف هذا البروتوكول لتقييم ما يقرب من أي نوع من يشتبه الحمض النووي وكيل ضار.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل، في جزء منه، من المعهد الوطني للصحة مركز التميز البيولوجية بحوث [منحة عدد 1P20GM109005]، منحة اتحاد أركنساس الفضائية من خلال الوطنية للملاحة الجوية وإدارة الفضاء [عدد المنح NNX15AK32A]، والمعهد الوطني للسلامة و الصحة (NIOSH) [رقم منحة 2T420H008436]. فإن الكتاب أود أن أشكر كريستوفر Fettes لتصحيح وتحرير هذه المخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Total suspended particulate sampler | Tisch Environmental | TE-5170 | |
| Bruker Avance III NMR spectrometer | Bruker | NA | |
| TopSpin 3.5/pl2 software | Bruker | NA | |
| ACD/NMR Processor Academic Edition | ACD/Labs | NA | |
| RAW264.7 murine macrophages | ATCC | ATCC TIB-71 | |
| High glucose DMEM GlutaMAX media | ThermoFisher | 10569010 | Warm in a 37 °C waterbath before use |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000044 | Warm in a 37 °C waterbath before use |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | ThermoFisher | 15140163 | Warm in a 37 °C waterbath before use |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher | 25200056 | Warm in a 37 °C waterbath before use |
| PBS, pH 7.4 | ThermoFisher | 10010049 | Warm in a 37 °C waterbath before use |
| KaryoMAX Colcemid Solution in PBS | ThermoFisher | 15212012 | Warm in a 37 °C waterbath before use |
| KaryoMAX Potassium Chloride Solution | ThermoFisher | 10575090 | Warm in a 37 °C waterbath before use |
| Methanol (HPLC) | Fisher Scientific | A452N1-19 | |
| Acetic Acid, Glacial | Fisher Scientific | BP1185-500 | |
| Decon Contrad 70 Liquid Detergent | Fisher Scientific | 04-355-1 | |
| Wright and Wright-Giemsa Stain Solutions | Fisher Scientific | 23-200733 | |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| Axio Imager 2 | Zeiss | NA |
References
- Lim, S. S., et al. A comparative risk assessment of burden of disease and injury attributable to 67 risk factors and risk factor clusters in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380, 2224-2260 (2012).
- IARC: Outdoor air pollution a leading environmental cause of cancer deaths. , IARC. Press Release 10-17-2013 (2013).
- Putaud, J., et al. A European aerosol phenomenology-2: chemical characteristics of particulate matter at kerbside, urban, rural and background sites in Europe. Atmos. Environ. 38 (16), 2579-2595 (2004).
- Hand, J., Schichtel, B., Pitchford, M., Malm, W., Frank, N. Seasonal composition of remote and urban fine particulate matter in the United States. J Geophys Res-Atmos. 117 (5), (2012).
- Schauer, J. J., et al. Source apportionment of airborne particulate matter using organic compounds as tracers. Atmos. Environ. 30 (22), 3837-3855 (1996).
- Simoneit, B. R. A review of biomarker compounds as source indicators and tracers for air pollution. Environ. Sci. Pollut. Res. 6 (3), 159-169 (1999).
- Kavouras, I. G., Stephanou, E. G. Particle size distribution of organic primary and secondary aerosol constituents in urban, background marine, and forest atmosphere. J Geophys Res-Atmos. 107 (8), (2002).
- Graber, E., Rudich, Y. Atmospheric HULIS: How humic-like are they? A comprehensive and critical review. Atmos. Chem. Phys. 6 (3), 729-753 (2006).
- Pöschl, U., et al. Atmospheric aerosols: composition, transformation, climate and health effects. Angew. Chem. Int. 44 (46), 7520-7540 (2005).
- Hou, L., et al. Altered methylation in tandem repeat element and elemental component levels in inhalable air particles. Environ. Mol. Mutagen. 55 (3), 256-265 (2014).
- Miousse, I. R., et al. Epigenetic alterations induced by ambient particulate matter in mouse macrophages. Environ. Mol. Mutagen. 55 (5), 428-435 (2014).
- Miousse, I. R., et al. In Vitro Toxicity and Epigenotoxicity of Different Types of Ambient Particulate Matter. Toxicol. Sci. 148 (2), 473-487 (2015).
- Ehrlich, M. Genomic instability in cancer development. Genome Instability in Cancer Development. , Springer. 363-392 (2005).
- Michael, S., Montag, M., Dott, W. Pro-inflammatory effects and oxidative stress in lung macrophages and epithelial cells induced by ambient particulate matter. Environ Pollut. 183, 19-29 (2013).
- Li, N., et al. Induction of heme oxygenase-1 expression in macrophages by diesel exhaust particle chemicals and quinones via the antioxidant-responsive element. J Immunol. 165 (6), 3393-3401 (2000).
- Pathak, R., Ramakumar, A., Subramanian, U., Prasanna, P. G. Differential radio-sensitivities of human chromosomes 1 and 2 in one donor in interphase- and metaphase-spreads after 60Co gamma-irradiation. BMC Med. Phys. 9, 6649 (2009).
- Pathak, R., Dey, S. K., Sarma, A., Khuda-Bukhsh, A. R. Genotoxic effects in M5 cells and Chinese hamster V79 cells after exposure to 7 Li-beam (LET= 60keV/µm) and correlation of their survival dynamics to nuclear damages and cell death. Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 628 (1), 56-66 (2007).
- Pathak, R., Dey, S. K., Sarma, A., Khuda-Bukhsh, A. R. Cell killing, nuclear damage and apoptosis in Chinese hamster V79 cells after irradiation with heavy-ion beams of 16 O, 12 C and 7 Li. Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 632 (1), 58-68 (2007).
- Chalbot, M. C., Kavouras, I. G. Nuclear magnetic resonance spectroscopy for determining the functional content of organic aerosols: a review. Environ. Pollut. 191, 232-249 (2014).
