Detta protokoll beskriver tekniker för kvantifiering och karakterisering av kromosomavvikelser in vitro i RAW264.7 mus makrofager efter behandling med omgivande luft partiklar.
Exponering för partiklar (PM) är en av världens viktigaste hälsoproblem, som kan skada olika cellkomponenter, inklusive kärn genetiska materialet. För att bedöma effekterna av PM på kärn genetisk integritet, är strukturella kromosomavvikelser görs i metafas spreadarna mus RAW264.7 makrofagceller. PM samlas in från luften med hög volym totalt suspenderade partiklar sampler. Det insamlade materialet solubiliseras och filtreras för att kvarhålla den vattenlösliga, fina delen. Partiklarna kännetecknas för kemisk sammansättning med kärnmagnetisk resonans (NMR) spektroskopi. Olika koncentrationer av partikelsuspension tillsätts på en in vitro-kultur av RAW264.7 musmakrofager för en total exponeringstid av 72 h, tillsammans med obehandlade kontrollceller. I slutet av exponeringen är kulturen behandlas med kolcemid att stoppa celler i metafas. Cellerna skördas sedan, behandlades med hypoton lösning, fixerades i acetomethanol, dropped på objektglas och slutligen färgades med Giemsa-lösning. Diabilder undersöks för att bedöma de strukturella kromosomavvikelser (CAS) i metafas sprider på 1,000X förstoring med hjälp av en ljus-fält mikroskop. 50 till 100 metafas spridning poängsätts för varje behandlingsgrupp. Denna teknik är anpassad för att detektera strukturella kromosomavvikelser (CA), såsom kromatid-typ raster, kromatid-typ utbyten, acentrisk fragment, dicentric och ring kromosomer, dubbla minuter, endoreduplikation och Robertsonian translokationer in vitro efter exponering för PM. Det är en kraftfull metod för att associera en väletablerad cytogenetisk slutpunkt för epigenetiska förändringar.
Det har uppskattats att exponering för partiklar (PM) orsakar över 3 miljoner överskott dödsfall årligen, främst från hjärt-kärlsjukdomar och lungcancer 1. I själva verket var PM erkänd som cancerframkallande för människor från International Agency for Research on Cancer (grupp 1), som en ökad risk för lungcancer med ökande nivåer av exponering för PM har visats två. Intressant, nästan alla cancerceller hamnen numeriska och / eller strukturella kromosomavvikelser. Partikulärt organiskt kol är en variant, komplex och heterogen blandning, vars sammansättning och storleksfördelning beror på utsläppen samt fysiska och kemiska omvandlingar. Det står 35-55% av stads PM 2,5 massa (PM 2,5 mikrometer i storlek och mindre) och mer än 60% av landsbygden och kontinental bakgrund PM 2,5 massa 3, 4. Den vattenlösliga fraktionen står för 30-90% av organisk aerosol. Ett stort antal organiska föreningarhar identifierats, inklusive alifatiska kolväten, polycykliska aromatiska kolväten och deras oxygene och nitroderivat, alifatiska aldehyder och alkoholer, fria fettsyror och deras salter, dikarboxylsyror, multifunktionella föreningar, proteiner och humusliknande makromolekyler (HULIS) med hjälp av kromatografiska metoder i kombination med masspektrometriska tekniker 5-8. Dessa föreningar utgör mindre än 10-20% av partikulärt organiskt kol, vilket de flesta av organiskt kol är okänt 9.
Experimentellt bevis antyder att cytotoxicitet, oxidativ stress, och inflammation är involverade i utvecklingen av PM-associerade patologiska tillstånd. Det har nyligen visats, dock att exponering för PM resulterar också i ett antal epigenetiska förändringar, bland annat förändringar i DNA-metylering av repetitiva element, både experimentella in vitro-system och hos människa 10-12. Av särskilt intresse är effekterna avPM på satellit DNA – stora och små satelliter – som finns i heterochromatic regionen runt centromeren av kromosomer. Det visade sig att dessa effekter kan vara långlivade av naturen, eftersom de kan detekteras under minst 72 timmar efter exponering 12. Förändringar i DNA-metylering, särskilt runt centromerer, kan leda till ansamling av satellit DNA mRNA-transkript, kompromiss kromosom integritet under celldelning och därefter leda till utvecklingen av en mängd olika patologiska tillstånd 13.
Anpassning av cytogenetisk tillvägagångssätt för analys av CA som en slutpunkt av epigenetiska förändringar orsakade av PM, vilket är av stor betydelse. Här rapporterar vi tillvägagångssättet för den omgivande PM insamling och förberedelse in vitro exponering och analys av CA med hjälp av mus makrofag RAW264.7 modellsystem. Makrofager omfattar första försvarslinjen mot de inhalerade främmande föremål och därmed thans cellinje fungerar som en etablerad och mest använda modellen i partikel toxikologi 11, 12, 14, 15.
Cytogenetisk studie eller mikroskopisk analys av siffrorna eller strukturer av kromosomer, främst i metafas sprider sig, innehåller information av avgörande betydelse för prognos, riskbedömning och behandling av olika sjukdomar. Det är nu väl etablerat att cytogenetiska abnormiteter är kopplade till utvecklingen och utvecklingen av flera sjukdomar, bland annat cancer. Hittills har CAs hittats i alla större tumörtyper. CA kan uppstå spontant eller av antingen externa eller interna stimuli, såsom joniserande s…
The authors have nothing to disclose.
Arbetet stöddes delvis av National Institute of Health Center of Biological Research Excellence [licensnummer 1P20GM109005], Arkansas Space Grant Consortium genom National Aeronautics and Space Administration [licensnummer NNX15AK32A], och det nationella institutet för arbetarskydd och hälsa (NIOSH) [licensnummer 2T420H008436]. Författarna vill tacka Christopher Fettes för korrekturläsning och redigera detta manuskript.
Total suspended particulate sampler | Tisch Environmental | TE-5170 | |
Bruker Avance III NMR spectrometer | Bruker | NA | |
TopSpin 3.5/pl2 software | Bruker | NA | |
ACD/NMR Processor Academic Edition | ACD/Labs | NA | |
RAW264.7 murine macrophages | ATCC | ATCC TIB-71 | |
High glucose DMEM GlutaMAX media | ThermoFisher | 10569010 | Warm in a 37°C waterbath before use |
Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000044 | Warm in a 37°C waterbath before use |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140163 | Warm in a 37°C waterbath before use |
Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher | 25200056 | Warm in a 37°C waterbath before use |
PBS, pH 7.4 | ThermoFisher | 10010049 | Warm in a 37°C waterbath before use |
KaryoMAX Colcemid Solution in PBS | ThermoFisher | 15212012 | Warm in a 37°C waterbath before use |
KaryoMAX Potassium Chloride Solution | ThermoFisher | 10575090 | Warm in a 37°C waterbath before use |
Methanol (HPLC) | Fisher Scientific | A452N1-19 | |
Acetic Acid, Glacial | Fisher Scientific | BP1185-500 | |
Decon Contrad 70 Liquid Detergent | Fisher Scientific | 04-355-1 | |
Wright and Wright-Giemsa Stain Solutions | Fisher Scientific | 23-200733 | |
Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-100 | |
Axio Imager 2 | Zeiss | NA |