Denne protokol beskriver teknikker til kvantificering og karakterisering af kromosomafvigelser in vitro i RAW264.7 mus makrofager efter behandling med den omgivende luft partikler.
Udsættelse for partikler (PM) er en af verdens største sundhedsproblem, der kan ødelægge forskellige cellulære komponenter, herunder den nukleare genetiske materiale. For at vurdere virkningen af PM om nuklear genetiske integritet, er strukturelle kromosomafvigelser scoret i de metafasespredninger af mus RAW264.7 makrofagceller. PM er indsamlet fra den omgivende luft med en samlet høj lydstyrke suspenderede partikler sampler. Det opsamlede materiale solubiliseres og filtreres til at tilbageholde den vandopløselige, fin portion. Partiklerne er kendetegnet for kemisk sammensætning ved kernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi. Forskellige koncentrationer af partikelsuspension bliver tilføjet på en in vitro-kultur af RAW264.7 musemakrofager til en samlet eksponeringstid på 72 timer, sammen med ubehandlede kontrolceller. Ved slutningen af eksponeringen, er kulturen behandlet med colcemid at anholde celler i metafase. Celler høstes dernæst, behandlet med hypotonisk opløsning, fikseret i acetomethanol, dropped på objektglas og endelig farvet med Giemsa-opløsning. Slides undersøges for at vurdere de strukturelle kromosomafvigelser (CAS) i metafase spreder på 1.000X forstørrelse ved hjælp af en lys-felt mikroskop. 50 til 100 metafasespredning scores for hver behandlingsgruppe. Denne teknik er tilpasset til detektion af strukturelle kromosomforandringer (CAS), såsom kromatidtypen-typen pauser, udveksling kromatidtypen-type, acentriske fragmenter, dicentric og ring kromosomer, dobbelt minutter, endoreduplikation og Robertsonian translokationer in vitro efter udsættelse for PM. Det er en kraftfuld metode til at knytte en veletableret cytogenetisk endpoint til epigenetiske ændringer.
Det er blevet anslået, at eksponering for partikler (PM) forårsager over 3 millioner overskydende dødsfald årligt, primært fra hjerte-sygdomme og lungekræft 1. Faktisk PM blev anerkendt som kræftfremkaldende for mennesker af Det Internationale Agentur for Kræftforskning (gruppe 1), en øget risiko for lungekræft med stigende eksponering for PM er blevet vist 2. Interessant, næsten alle kræftceller havnen numeriske og / eller strukturelle kromosomafvigelser. Partikler organisk kulstof er en variant, kompleks og heterogen blanding, hvis sammensætning og størrelse fordeling afhænger af emissioner samt fysiske og kemiske omdannelser. Den tegner 35-55% af byerne PM 2,5 masse (PM 2,5 um i størrelse og mindre) og mere end 60% af baggrunden landdistrikter og kontinentale PM 2,5 masse 3, 4. Den vandopløselige fraktion udgør 30-90% af organisk aerosol. Et stort antal organiske forbindelserer blevet identificeret, herunder alifatiske carbonhydrider, polycykliske aromatiske kulbrinter og deres oxygenerede og nitroderivater, alifatiske aldehyder og alkoholer, frie fedtsyrer og deres salte, dicarboxylsyrer, multifunktionelle forbindelser, proteiner og humus-lignende makromolekyler (HULIS) under anvendelse kromatografiske metoder kombineret med massespektrometrisk teknikker 5-8. Disse forbindelser udgør mindre end 10-20% af partikulært organisk kulstof, og dermed de fleste af organisk kulstof er ukendt 9.
Eksperimentelle beviser antyder, at cytotoksicitet, oxidativt stress og inflammation er involveret i udviklingen af PM-associerede patologiske tilstande. Det har for nylig vist, dog, at eksponering for PM resulterer også i en række epigenetiske ændringer, herunder ændringer i DNA-methylering af repetitive elementer, i både eksperimentelle in vitro systemer og i humane individer 10-12. Af særlig interesse er virkningerne afPM på satellit-DNA – større og mindre satellitter – som findes i heterochromatic regionen omkring centromeren af kromosomer. Det blev vist, at disse virkninger kan være persistente af natur, da de kan påvises i mindst 72 timer efter eksponering 12. Ændringer i DNA-methylering, især omkring centromerer, kan føre til akkumulering af satellit-DNA-mRNA-transkripter, kompromis kromosomale integritet under celledeling og efterfølgende resultere i udvikling af en række forskellige patologiske tilstande 13.
Tilpasning af cytogenetisk fremgangsmåde til analyse af CA'er som et endepunkt af epigenetiske ændringer forårsaget af PM, således er af stor betydning. Her rapporterer vi tilgangen til den omgivende PM indsamling og forberedelse, in vitro eksponering og analyse af CA'er hjælp af murine makrofag RAW264.7 model system. Makrofager omfatter den første linje i forsvar mod de inhalerede fremmedlegemer og dermed thans cellelinie tjener som en etableret og de hyppigst anvendte model i partikel toksikologi 11, 12, 14, 15.
Cytogenetisk undersøgelse eller mikroskopisk analyse af tal eller strukturer af kromosomer, primært i metafase spreads, giver oplysninger afgørende for prognose, risikovurdering, og behandling af forskellige sygdomme. Det er nu veletableret, at cytogenetiske abnormaliteter er forbundet med progression og udviklingen af flere sygdomme, herunder cancer. Til dato har CA'er blevet fundet i alle større tumortyper. CA'er kan opstå spontant eller ved enten eksterne eller interne stimuli, såsom ioniserende s…
The authors have nothing to disclose.
Arbejdet blev støttet delvist af National Institute of Health Center of Biological Research Excellence [tilskud nummer 1P20GM109005], Arkansas Space Grant Consortium gennem National Aeronautics and Space Administration [tilskud nummer NNX15AK32A], og det nationale institut for Occupational Safety and Sundhed (NIOSH) [tilskud nummer 2T420H008436]. Forfatterne vil gerne takke Christopher Fettes for korrekturlæsning og redigering dette manuskript.
Total suspended particulate sampler | Tisch Environmental | TE-5170 | |
Bruker Avance III NMR spectrometer | Bruker | NA | |
TopSpin 3.5/pl2 software | Bruker | NA | |
ACD/NMR Processor Academic Edition | ACD/Labs | NA | |
RAW264.7 murine macrophages | ATCC | ATCC TIB-71 | |
High glucose DMEM GlutaMAX media | ThermoFisher | 10569010 | Warm in a 37°C waterbath before use |
Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000044 | Warm in a 37°C waterbath before use |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140163 | Warm in a 37°C waterbath before use |
Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher | 25200056 | Warm in a 37°C waterbath before use |
PBS, pH 7.4 | ThermoFisher | 10010049 | Warm in a 37°C waterbath before use |
KaryoMAX Colcemid Solution in PBS | ThermoFisher | 15212012 | Warm in a 37°C waterbath before use |
KaryoMAX Potassium Chloride Solution | ThermoFisher | 10575090 | Warm in a 37°C waterbath before use |
Methanol (HPLC) | Fisher Scientific | A452N1-19 | |
Acetic Acid, Glacial | Fisher Scientific | BP1185-500 | |
Decon Contrad 70 Liquid Detergent | Fisher Scientific | 04-355-1 | |
Wright and Wright-Giemsa Stain Solutions | Fisher Scientific | 23-200733 | |
Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-100 | |
Axio Imager 2 | Zeiss | NA |