Denne protokollen beskriver teknikker for kvantifisering og karakterisering av kromosomale avvik in vitro i RAW264.7 musemakrofager etter behandling med omgivende luft partikler.
Eksponering for svevestøv (PM) er en stor verden helse bekymring, noe som kan skade ulike cellulære komponenter, inkludert kjernefysisk genetisk materiale. For å vurdere effekten av PM på kjernefysisk genetisk integritet, er strukturelle kromosomavvik scoret i de metafase sprer av mus RAW264.7 makroceller. PM er hentet fra luften med et høyt volum total suspenderte partikler sampler. Det oppsamlede materiale er oppløst, og filtrert for å holde den vannoppløselige, fine parti. Partiklene er kjennetegnet for den kjemiske sammensetning av kjernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi. Forskjellige konsentrasjoner av partikkelsuspensjonen blir tilsatt til en in vitro-kultur av RAW264.7 musemakrofager for en total eksponeringstid på 72 timer, sammen med ubehandlede kontrollceller. På slutten av eksponeringen, blir kulturen behandlet med colcemid å stanse celler i metafase. Cellene blir så høstet, behandlet med hypoton oppløsning, fiksert i acetomethanol, dropped på glassplater og til slutt farget med Giemsa løsning. Lysbilder blir undersøkt for å vurdere strukturelle kromosomavvik (CAS) i metafase sprer på 1,000X forstørrelse ved hjelp av en lys-feltet mikroskop. 50-100 metafase spredning er scoret for hver behandlingsgruppe. Denne teknikken er tilpasset for påvisning av strukturelle kromosomavvik (CAS), som kromatid-type pauser, kromatid-type utveksling, asentrisk fragmenter, disentrisk og ring kromosomer, dobbel minutter, endoreduplication og Robertsonske trans in vitro etter eksponering for PM. Det er en kraftig metode for å knytte et veletablert cytogenetisk endepunkt til epigenetiske forandringer.
Det har blitt anslått at eksponering for svevestøv (PM) forårsaker over 3 millioner overflødig dødsfall årlig, hovedsakelig fra hjerte- og karsykdommer og lungekreft en. Faktisk PM ble anerkjent som kreftfremkallende for mennesker ved International Agency for Research on Cancer (gruppe 1), som økt risiko for lungekreft med økende nivåer av eksponering for PM har blitt vist to. Interessant, nesten alle kreftceller havn numeriske og / eller strukturelle kromosomavvik. Partikkelformet organisk karbon er en variant, kompleks, og heterogen blanding, hvis sammensetning og størrelsesfordeling avhenger av utslipp, så vel som fysiske og kjemiske omdannelser. Det står 35-55% av urban PM 2,5 masse (PM 2,5 mikrometer i størrelse og mindre) og mer enn 60% av landlige og kontinentale bakgrunn PM 2,5 masse tre, fire. Den vannløselig fraksjon står for 30-90% av organisk aerosol. Et stort antall organiske forbindelserer blitt identifisert, inkludert alifatiske hydrokarboner, polysykliske aromatiske hydrokarboner og deres oksygenerte og nitrerte derivater, alifatiske aldehyder og alkoholer, frie fettsyrer og deres salter, dikarboksylsyrer, multifunksjonelle forbindelser, proteiner og humuslignende makromolekyler (HULIS) ved hjelp kromatografiske metoder kombinert med massespektrometri teknikker 5-8. Disse forbindelser utgjør mindre enn 10-20% av partikkelformet organisk karbon, og således de fleste av organisk karbon er ukjent 9.
Eksperimentelle bevis tyder på at cytotoksisitet, oksidativt stress og betennelse er involvert i utviklingen av PM-assosierte patologiske tilstander. Det har nylig blitt vist, men at utsettelse for PM resulterer også i en rekke epigenetiske endringer, inkludert forandringer i DNA-metylering av repetitive elementer, i både eksperimentelle in vitro-systemer, og i mennesker 10-12. Av spesiell interesse er virkningen avPM på satellitt DNA – store og små satellitter – som er funnet i heterochromatic regionen rundt cent av kromosomer. Det ble vist at disse effekter kan vedvare av natur, som de kan påvises i minst 72 timer etter eksponering 12. Endringer i DNA-metylering, spesielt rundt sentromerer, kan føre til akkumulering av satellitt-DNA-mRNA-transkripter, kompromiss kromosomalt integritet under celledeling og, senere, resulterer i utvikling av en rekke patologiske tilstander 13.
Tilpasning av cytogenetisk tilnærming for analyse av instanser som et sluttpunkt av epigenetiske endringer forårsaket av PM, derfor er av stor betydning. Her rapporterer vi tilnærming for omgivelses PM innsamling og forberedelse, in vitro eksponering og analyse av instanser bruker murine makrofag RAW264.7 modellsystem. Makrofager utgjør den første forsvarslinje mot inhalerte fremmedlegemer og derfor tsin cellelinje tjener som en etablert og den mest brukte modellen i partikkel toksikologi 11, 12, 14, 15.
Cytogenetisk undersøkelse eller mikroskopisk analyse av tallene eller strukturer av kromosomer, først og fremst i metafase sprer seg, gir informasjon avgjørende for prognose, risikovurdering, og behandling for ulike sykdommer. Det er nå godt etablert som cytogenetiske abnormiteter er forbundet med progresjon og utvikling av en rekke sykdommer, inkludert kreft. Hittil har instanser blitt funnet i alle de store krefttyper. CAer kan oppstå spontant eller av enten eksterne eller interne stimuli, slik som ioniserende st…
The authors have nothing to disclose.
Arbeidet ble støttet delvis av National Institute of Health Center of Biological fremragende forskning [stipend nummer 1P20GM109005], Arkansas Space Grant Consortium gjennom National Aeronautics and Space Administration [stipend nummer NNX15AK32A], og National Institute for Occupational Safety og helse (NIOSH) [tilskuddet antallet 2T420H008436]. Forfatterne ønsker å takke Christopher Fettes for korrekturlesing og redigering av dette manuskriptet.
Total suspended particulate sampler | Tisch Environmental | TE-5170 | |
Bruker Avance III NMR spectrometer | Bruker | NA | |
TopSpin 3.5/pl2 software | Bruker | NA | |
ACD/NMR Processor Academic Edition | ACD/Labs | NA | |
RAW264.7 murine macrophages | ATCC | ATCC TIB-71 | |
High glucose DMEM GlutaMAX media | ThermoFisher | 10569010 | Warm in a 37°C waterbath before use |
Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000044 | Warm in a 37°C waterbath before use |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140163 | Warm in a 37°C waterbath before use |
Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher | 25200056 | Warm in a 37°C waterbath before use |
PBS, pH 7.4 | ThermoFisher | 10010049 | Warm in a 37°C waterbath before use |
KaryoMAX Colcemid Solution in PBS | ThermoFisher | 15212012 | Warm in a 37°C waterbath before use |
KaryoMAX Potassium Chloride Solution | ThermoFisher | 10575090 | Warm in a 37°C waterbath before use |
Methanol (HPLC) | Fisher Scientific | A452N1-19 | |
Acetic Acid, Glacial | Fisher Scientific | BP1185-500 | |
Decon Contrad 70 Liquid Detergent | Fisher Scientific | 04-355-1 | |
Wright and Wright-Giemsa Stain Solutions | Fisher Scientific | 23-200733 | |
Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-100 | |
Axio Imager 2 | Zeiss | NA |