Summary
Wir beschreiben eine Schritt- für -Schritt - Methode der direkten Pulpe an Mäusen Zähne für die Bewertung der Pulpa Wundheilung und reparative Dentin Bildung in vivo Capping durchgeführt wird .
Protocol
Die Mäuse wurden von Jackson Laboratory erworben und in einem keimfreien Vivarium in der UCLA Abteilung für Labortiermedizin (DLAM). Die Experimente wurden aus dem Kanzler Animal Research Committee (ARC # 2016-037) nach den anerkannten Richtlinien des Instituts durchgeführt.
1. Maus Betäubung
- Verwenden Sie acht Wochen alten weiblichen C57 / BL6-Mäusen (n = 3).
- Anästhesieren die Mäuse unter Verwendung von Ketamin (80-120 mg / kg Mausgewicht) / Xylazin (5 mg / kg Mausgewicht) Lösungen und administrieren intraperitoneal (ip) in einer Dosis von 10 ml / kg.
- Bereiten Ketamin (80 - 120 mg / kg) / Xylazin (5 mg / kg) Lösungen und verwalten sie intraperitoneal (ip) in einer Dosis von 10 ml / kg.
- Bestätigen Sie, dass die Mäuse durch Ausführen einer Zehe Prise vollständig betäubt werden.
2. Zellstoff-Capping Verfahren
- Platzieren Sie den Mund Halter in der Maus in den Mund.
- Sichern Sie den Mund Halter auf dem Tisch, so dass die erAnzeige nach oben zeigt.
- Platzieren Sie das Mikroskop (10fach) oben auf den Mund, so dass der erste Oberkiefermolaren vollständig sichtbar ist.
- Mit der ¼-Rundbohrer in einem Hochgeschwindigkeits-Handstück bei 200.000 Umdrehungen pro Minute, entfernen Sie den Zahnschmelz Teil des Zahnes in der Mitte, bis der Brei durch das transparente Dentin sichtbar ist. Sie nicht den Brei mit dem bur aussetzen.
- Unter Verwendung eines # 15 Endodontie K-Datei (Durchmesser von 150 & mgr; m), perforieren durch das Dentin und setzen die Zellstoff.
HINWEIS: Besondere Vorsicht ist geboten werden, so dass das Dentin Schmutz nicht in den Brei geschoben bekommt. Dies kann vierteljährlich durch Drehen der K-Datei vermieden werden, und dann zieht die K-Datei aus. - Mischungs MTA mit sterilem H 2 O gemäß den Anweisungen des Herstellers. mit der Spitze des Explorers liefern und den MTA auf die Pulpa platzieren. Verwenden Sie die Rückseite der Papierspitze (fein) durch leichtes Klopfen der MTA in die Pulpa zu packen. Die dickere Seite des Papiers Punkt ist flach und daher erlaubtfür die ordnungsgemäße Kondensation des MTA in die Pulpa.
- Etch den Zahn für 15 s durch die 35% ige Phosphorsäure-Ätzmittel platzieren, wo es nur um den Zahn abdeckt. Besondere Vorsicht die Platzierung des Ätzmittel zu begrenzen, da es Gingivagewebe reizen können.
HINWEIS: Das Ätzmittel in einer Spritze kommt, und verwendet wird, um die Zahnflächen aufzurauhen, so dass Dentaladhäsive einströmen kann mikromechanischen Bindung auf den Zahn zu vermitteln. Da sie viskos sind, können sie durch die Anwendung kleiner Mengen direkt auf dem Zahn in sich geschlossen sein. - Verwenden Sie negative Druck stehenden Saug- das Ätzmittel zu entfernen. Verwenden Sie einen Wattepellet , das leicht mit H 2 O getränkt wird , um die Reste des Ätzmittel zu entfernen. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis das Ätzmittel vollständig aus dem Zahn entfernt wird.
- Mit Hilfe eines Druckluftstaubtuch trocknen sanft den Zahn.
- Übernehmen Sie die Dentaladhäsive die Rückseite des Papierspitze verwenden.
- Stellen Sie die Klebeschicht dünn mit Druckluft für 3 s.
- Cure die Dentaladhäsive für 20 s die Aushärtung Lichteinheit.
- Legen Sie das fließfähige Composite in kleinen Mengen auf den Zahn, der mit MTA gekappt wurde. Verwenden Sie die Spitze des Forschers des Verbund in die Zahnrillen zu fließen.
- Heilung der Verbund für 30 s eine lichthärtende Einheit unter Verwendung es zu polymerisieren. Bestätigen Sie, dass der Verbund vollständig ausgehärtet ist und hart den Explorer verwenden.
3. Post-op Pflege
- Verabreichen Carprofen (5 mg / kg) subkutan (sc) unmittelbar nach der Pulpe-Capping Verfahren.
- Legen Sie die Mäuse auf einem Heizkissen bei geringer Leistung, die Tiere warm zu halten, bevor sie aufwachen.
- Bringen Sie die Mäuse auf das Vivarium für den Wohnungsbau.
4. Gewebebeschaffung
- Nach 5 - 6 Wochen, die Mäuse durch Genickbruch unter einer vollständigen Betäubung mit Isofluran Zustand einschläfern.
- Entfernen Sie vorsichtig den Oberkiefer aus der Basis des Schädels und steckte es in einen 50-ml-Röhrchen. Befestigen Sie den entire Oberkiefers, die über Nacht in PBS, pH 7,4, bei 4 ° C sowohl die Zellstoff- bedeckten Zahn und die kontralaterale uncapped Zahn in 4% Paraformaldehyd enthält, und es dann speichern Sie in einer 70% igen Ethanollösung.
HINWEIS: Paraformaldehyd ist giftig und krebserregend. Die ordnungsgemäße Verwendung Paraformaldehyd sollte in den Standardarbeitsanweisungen (SOP) wie skizziert überwacht werden. - Scannen Sie die Maus Maxillen die μCT Scan verwenden. Zur Sicherung des Oberkiefers während des Scannens, wickeln Sie die Proben mit Gaze, getränkt mit 70% Ethanol und legen Sie sie in den 15-ml Zellkulturröhrchen.
5. μCT Scanning
- Bereiten Sie die Proben für μCT Scannen. Kurz gesagt, wickeln Sie die Proben mit Gaze mit 70% Ethanol getränkt und sie in einem allgemeinen 15 ml Zellkultur konischen Röhrchen sichern. Montieren Sie das Rohr auf die μCT Scanstufe, wie in den Anweisungen des Herstellers beschrieben.
- Stellen Sie die Röntgenstrahlenquelle einem Strom von 145 uA, einer Spannung von 55 kVp und einer Belichtungszeit von 200 ms.
- Führen der Bildaufnahme mit dem μCT Scanner mit einer 20-um-Auflösung und mit einer 0,5 mm Al-Filter.
- Rekonstruieren Sie das Bild und visualisieren 11.
- Sobald der μCT Scanvorgang abgeschlossen ist, Entkalkung mit 5% EDTA und 4% Saccharose in PBS (pH 7,4) für 2 Wochen.
6. Gewebeverarbeitung und Färbung
- Einbetten der entkalkt Gewebe in Paraffin. Vor dem Einbetten, schneiden Sie den Oberkiefer durch einen sagittalen Schnitt sofort auf den ersten Molaren anterioren machen. Während die Einbettung positionieren diese Fläche nach unten, so dass der Längsschnitt des ersten Molaren ist die Schnittfläche.
- Mit dem Mikrotom, bereiten 5 um dicke Folien. Die Zellstoff-Capping Bereiche übereinstimmen in der Regel mit dem distopalatal (DP) Wurzel, die als Orientierungspunkt verwendet werden kann. Bestimmen Sie den genauen Bereich von Interesse durch die Histologie unter dem Lichtmikroskop zu untersuchen und die μCT Bilder zu vergleichen.
- Für H & E-Färbung, Deparaffinize und die Folien mit Xylol (2x) rehydrieren und seriell verdünnt Ethanol (100% EtOH 2x, 95% EtOH 2x, und 70% EtOH 1x).
- Spülen Sie die Folien mit fließendem Leitungswasser.
- Fleck mit Hämatoxylin-Lösung für 2,5 min und Spülen mit Leitungswasser.
- Tauchen der Objektträger in 95% Ethanol für 1 min.
- Fleck mit Eosin-Lösung für 1 min und Spülen mit Leitungswasser.
- Entwässern mit seriell verdünnten Ethanol (70% EtOH 1x, 95% EtOH 2x und 100% EtOH 3x) und Xylol (3x).
- Montieren Sie die Folien mit Befestigungslösung.
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Representative Results
Hier haben wir gezeigt, die Schritt-für-Schritt-Verfahren Zellstoff zur Durchführung an Mäusen Zähne Capping. Einer der wichtigsten Aspekte der Zellstoff bei Mäusen Capping ist die entsprechende Vorrichtung haben. In dieser Hinsicht mit einem 10fach-facher Vergrößerung des Mikroskops ist von wesentlicher Bedeutung (Abbildung 1A). Um eine Klasse-I-like Vorbereitung in den Zahn zu erstellen, verwendeten wir eine ¼-Runde Grat in einem elektrischen Hochgeschwindigkeitshandstück bei 200.000 Umdrehungen pro Minute (1B). Alternativ kann jede andere Motoren, einschließlich derer, die Druckluft verwenden, können verwendet werden, um einen Zahn herzustellen.
In 2A 2E, repräsentative Schritte zur Durchführung Kappung gezeigt. Die Klasse-I-like - Präparation wurde durchgeführt (2B). Weil ein Wasserstrahl die Mäuse während des Verfahrens ertrinken kann, wird seine Verwendung nicht empfohlen. Aus diesem Grund ist es wichtig, um den Zahn mit sanften und intermi vorzubereitenTtent streicht Überhitzung zu vermeiden. Die Verwendung von Druckluft wird auch verwendet, um Kühleffekte empfohlen. Während der Pulpe mit einer endodontischen Feile aussetzt, nehmen Vorsicht nicht das Dentin Trümmer in den Brei zu schieben, wie dies mit der Interpretation der Daten in reparative Dentinbildung (Abbildung 2C) stören können. Dies kann durch Verwendung der Druckluft vermieden werden. Ebenso sollte der MTA auf der Pulpa platziert werden, ohne zu weit in die Pulpa schieben. MTA Platzierung kann durch Verwendung der Rückseite des Papierspitze mit sanften Klopfen Bewegungen (2D) erreicht werden. Folgende MTA Platzierung, sollte der Zahn H 2 O-getränkten Wattepellets unter Verwendung gereinigt werden alle verbleibenden MTA in den Rillen zu entfernen, die mit der Bindung des Verbund auf den Zahn stören können. Herkömmliche Verfahren zur Kompositrestauration verwendet werden, einschließlich Ätzen der Zahnoberflächen, Primen und Bonden mit Klebstoffen und Platzierung und Härten der fließfähigen Kompositen (Abbildung 2E).
Sechs Wochen nach Kappung wurden die Mäuse geerntet, und die Ansicht von oben fotografiert wurde , um zu bestätigen , dass der Verbund noch intakt war (3A). μCT Scanning zeigte signifikante Rezession der Pulpa Raum in der Pulpe-capped Gruppe (3B), was darauf hindeutet , dass reparative Dentin in der Pulpe gebildet wurde. Die entkalkten Gewebeproben wurden auf H & E - Färbung unterzogen , um weiter in vivo histologisch die Bildung von Dentin reparative untersuchen. In der Kontrollgruppe waren Odontoblastenfortsätze Schichten (OB) um die Ränder des Dentins prominent evident (4A - 4C). Im Gegensatz dazu hatte der Zellstoff-Cap - Gruppe erhebliche Mengen an reparative Dentin (RD) in der Pulpa Raum gebildet (4D - 4F). Interessanterweise eine genauere Untersuchung ergab , dass reparative Dentin (RD) ein typisches Merkmal von Dentin ausgestellt (zB s triated Linien , die Dentintubuli, roter Pfeil), sowie dass der Knochen (zB Osteozyten darstellt eingeschlossene Osteoblasten, schwarz Pfeilspitzen). Wenn wir für Dentin Matrix Protein 1 (DMP1), einem Marker für odontogene Differenzierungs 12 gefärbt, fanden wir eine deutliche Erhöhung der DMP1 Expression in der Zellstoff der Pulpe-capped Zahn , wenn zu der des uncapped Zahn verglichen (5A und 5B) , was darauf hinweist, dass reparative Dentin innerhalb der Zellstoff gebildet wurde.
Abbildung 1: Die Geräteeinstellungen für den Pulp-Capping Verfahren. (A) Ein Mikroskop (10X) zur Sichtbarmachung der Maus Zahnes. (B) Die Hochgeschwindigkeits - Handstück und der Elektromotor Motor eine Klasse - I - Zubereitung für die Herstellung der Pulpe zu belichten.= "_ Blank"> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Repräsentative Schritte im Capping Verfahren. (A) Unvorbereitet Zahn auf der oberen ersten Molaren in einer Maus. (B) Anfängliche Schmelz Entfernung mit dem Viertelrundbohrer. (C) Pulpaexposition die Endodontie - Datei. (D) MTA Platzierung in der Pulpa. (E) Kompositrestauration Platzierung auf den Zahn. Die Bar steht für 500 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Klinische Präsentation und μCT scanning des Pulp-capped und ohne Cap Zahn in Mäuse. (A) Okklusalansicht der Maus Maxillen auf den Zellstoff bedeckten Zahn (links) und nicht begrenzten Zahn (rechts). (B) Die Querschnitts μCT Bilder des Oberkiefers. Die Bar steht für 500 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Die histologische Nachweis der Reparative Dentinbildung In Vivo. (AC) H & E - Färbung der nicht begrenzten oberen ersten Molaren in einer Maus bei 100X, 200X und 400X. (DE) H & E - Färbung der Pulpa bedeckten oberen ersten Molaren in einer Maus bei 100X, 200X und 400X. Der Balken steht für 100 & mgr; m (OB = odontoblast Schichten; RD = reparative Dentin, schwarze Pfeile =Osteozyten; roter Pfeil = Dentintubuli). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5: immunhistochemischen Färbung von DMP1. (A) DMP1 Färbung der nicht begrenzten oberen ersten Molaren in einer Maus bei 400X. (B) DMP1 Färbung des Breis bedeckten oberen ersten Molaren in einer Maus bei 400X. Die Bar steht für 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Derzeit gibt es mehrere verschiedene experimentelle Modelle zur Verfügung , um die in vivo - Effekte von Dentalmaterialien, Gerüste oder Wachstumsfaktoren auf odontogene Differenzierung von Zahnpulpa Stammzellen (DPSCs) 13 zu validieren. Diese Modelle sind mit ektopischen autologe Transplantation von DPSCs in ein Organ, wie die Nierenkapsel oder subkutane Transplantation von DPSCs in immunsupprimierten Mäusen mit Gerüsten 14,15. Jedoch sind diese Verfahren begrenzt, daß ihre Wirkung auf odontogene DPSCs nicht im orthotope Pulpe Umgebung durchgeführt. Auf der anderen Seite, orthotope Transplantation in der Zellstoff- oder Zellstoff-Capping - Verfahren auf einem Zahn in größeren Tieren 16,17 eingesetzt. Obwohl diese Modelle bei der Bewertung odontogenic Potenzial in der orthotoper Umgebung wertvoll sind, ist die Verwendung dieser Modelle weitgehend Beobachtungs in der Natur, begrenzt mechanistische Erkenntnisse auf Zellstoff Wundheilung und reparative Dentinbildung bieten. In diesem Papier präsentieren wir eine detaillierte Methode pulp-capping in Mäusen durchzuführen. Diese Schritt-für-Schritt-Verfahren umfasst die Mäuse betäuben, die Klasse-I-artigen Hohlraum Vorbereitung, Platzierung der Zellstoff-Capping Materialien, das Ernten des Oberkiefers, mit der μCT Analyse scannen und Gewebeproben für die reparative Dentinbildung zu bewerten. Unsere Zellstoff-Capping - Maus - Modell wird durch die die Verwendung von transgenen oder Knockout - Mäusen bei der Untersuchung der grundlegenden molekularen Mechanismen der Pulpa Wundheilung in vivo im Rahmen der reparative Dentin dienlich sein, die in der Forschungsgemeinschaft weithin verfügbar sind.
Jüngste Studien haben gezeigt , mehrere Mausmodelle , in denen Dentinbildung wurde 18,19 beobachtet. Saito et al. eine Klasse-I-like Zubereitung ohne Pulpa geschaffen, die reaktionären, nicht reparative, Dentinbildung stimuliert. Sowohl reaktionär Dentin und reparative Dentin als tertiäre Dentin eingestuftFormen, die externe Stimulation auf den Zahn folgt. Jedoch anders als reaktionäre Dentin, das durch bestehende Odontoblasten gebildet wird, wird reparative Dentin von Odontoblasten-ähnlichen Zellen gebildet, wie DPSCs, wenn die Pulpe freigelegt wird und die Odontoblastenfortsätze Schichten 20 durchbrochen. Deshalb ist es nicht ein tatsächliches pulp-Capping Verfahren in der Klinik dar. In einer weiteren Studie wurde Glasionomer- 19 verwendet die Pulpa Kappe. Jedoch zeigte eine klinische Studie , dass die Glasionomer- chronische Entzündung induziert, aber nicht reparative 21 Dentin. In dieser Hinsicht unsere pulp-Capping Mausmodell besser repräsentiert die tatsächliche Zellstoff-Capping Verfahren bei Patienten.
Es ist bemerkenswert , dass , wenn wir Mäuse nach mehr als 6 Wochen geerntet, reparative Dentinbildung in der gesamten Pulpakammer und die Wurzelkanäle (Abbildung 4) aufgetreten ist . Das ist eine Beobachtung, eher unerwartet, da wir am Juni reparative Dentinbildung erwartetction zwischen dem Zellstoff-Deckmaterial und dem Zellstoff. Jedoch starke Mineralisierung der Zellstoff wird auch im klinischen Umfeld zu beobachten, vor allem bei relativ jungen Patienten 22. Da die 8 Wochen alte Mäuse in dieser Studie verwendet wurden , gelten als "junge Erwachsene" 23, besteht eine Möglichkeit , wobei diese noch Mäuse signifikant odontogenic Potenzial bergen. Daher wäre es sinnvoll sein, um die Alterungseffekte der reparative Dentinbildung in Mäusen zu untersuchen.
Unsere histologische Untersuchungen ergaben, dass, obwohl reparative Dentin deutlich in der Pulpe-capped Zahn gebildet wurde, gibt Merkmale von Dentin und Knochenbildung waren, wie durch die Anwesenheit von Dentinkanälchen (roter Pfeil) und Osteozyten (schwarze Pfeile) in die reparative belegt Dentin (Abbildung 5). Solche Beobachtungen legen nahe, dass reparative Dentin Bildung durch lokal wohn odontoblast artigen Zahnpulpa Stammzellen sowie infiltratin induziert werden kann,g mesenchymalen Stammzellen, die aus dem umgebenden Knochen.
Im Vergleich zu den Dentin-bildenden Zellen, wir keine Dentin-resorbierenden Zellen innerhalb der Pulpe, die von Tartrat-resistente saure Phosphatase (TRAP) Färbung (Daten nicht gezeigt), wie bestimmt gefunden. Tatsächlich induziert Pulpa oder periapikalen Entzündung Osteoklastenbildung auf den Knochenoberflächen um den Zahn herum, aber nicht auf den Dentinflächen wegen als noch unbekannte Mechanismen 24. Bemerkenswert ist , gab es eine klare Abgrenzung zwischen dem bestehenden Dentin und dem neu gebildeten reparative Dentin (Abbildung 4). Eine frühere Studie zeigte ein ähnliches Phänomen; wenn ein Zahn in Gegenwart von Bisphosphonat oder Anti-RANKL - Antikörper, von denen beide hemmen die Funktionen von Osteoklasten extrahiert wird, gab es klare Abgrenzungen zwischen den bestehenden Lamellenknochen und neu gebildete Geflechtknochen 25. Dieser Begriff unterstützt ferner das Fehlen von Dentin-resorbierenden Zellen in der Zellstoff-. Zusammengefasst würde unsere etablierten Mausmodell peinzigartige Möglichkeiten rovide die Mechanismen der Zellstoff Wundheilung und reparative Dentinbildung in vivo zu untersuchen.
Es ist eine Beschränkung auf die Pulpe-Capping-Mausmodell. Genetische Make-ups zwischen Mensch und Maus unterscheiden sich deutlich. Das komplette Genom in Menschen und Mäusen, und es gibt etwa 85% Ähnlichkeit in den Protein-kodierenden Bereichen zwischen Mäusen und Menschen 26,27 sequenziert. Im Einklang mit dieser Vorstellung wurde vorgeschlagen , dass die Ergebnisse auf Zellstoff im Zusammenhang mit Tieren Capping reflektieren nicht unbedingt die beim Menschen 28. Dennoch sind Tiermodelle extensiv in der Forschung verwendet , um Krankheiten des Menschen in vivo, wie beispielsweise Kollagen-induzierter Arthritis bei rheumatoider Arthritis 29, ovariactomy induzierten Knochenverlust rekapitulieren für Osteoporose 30, Lipopolysaccharid (LPS) Verabreichung zur systemischen Schock 31 und Ligatur Platzierung für Parodontitis 32. Als solches der Pulpe-Capping mouse Modell wird wichtig , die molekularen Mechanismen der Zellstoff Wundheilung und reparative Dentinbildung in vivo zu untersuchen. Dennoch, wie auch andere Tiermodelle, Interpretation und Validierung der Ergebnisse aus dem Zellstoff-Capping Mausmodell sorgfältig bewertet werden sollte.
Zusammenfassend zeigt die aktuelle Studie erfolgreich Kappung bei Mäusen. Im Gegensatz zu anderen bekannten Modellen dieser Zellstoff-Capping-Maus-Modell wird eine unschätzbare Forschungswerkzeug im Bereich der Zellstoff- Regeneration und reparative Dentinbildung bieten, weil es bietet: 1) die Möglichkeit zu nutzen, weit verbreitet genetisch veränderte Mausstämme, die zugrunde liegenden Mechanismen bei der aufzuklären molekularer Ebene und 2) eine wirtschaftlich effiziente Weise statistisch signifikante Ergebnisse zu erhalten, indem Probengrößen zu erhöhen. Weitere Studien erwarten, einschließlich objektive Quantifizierung von reparative Dentinbildung in vivo, altersabhängige Effekte von reparative Dentinbildung, AUSWERTtion von klinisch verfügbaren Zellstoff-Capping Materialien und Validierung von molekularen Determinanten, die für die richtige Pulpa Wundheilung und reparative Dentin Regeneration benötigt werden.
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Acknowledgments
Diese Studie wurde von R01DE023348 (RHK) von NIDCR / NIH und der Fakultät Research Grant (RHK) vom Rat für Forschung des Akademischen Senats der Los Angeles Abteilung der Universität von Kalifornien unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BM-LED stereo microscope | MEIJI Techno | Microscope | |
| Optima MCX-LED | Bien Air Dental | 1700588-001 | Electic motor engine |
| isoflurane | Henry schein animal health | NDC 11695-0500-2 | |
| 1/4 round bur | Brasseler | 001092T0 | |
| Endodontic K-file | Roydent | 98947 | |
| ProRoot MTA | Dentsply | PROROOT5W | MTA |
| Paper point | Henry schein | 100-3941 | |
| Ultra-Etch | Ultradent product Inc. | Phosphoric acid etchant | |
| OptiBond SoloPlus | Kerr | 29669 | Adhesives |
| Coltolux LED | Coltene/whaledent Inc. | C7970100115 | Curing light unit |
| Characterization tint | Bisco | T-14012 | Flowable composite |
| Skyscan | Breuker | 1275 | uCT scanner |
| Microm | Thermo | HM355S | Microtome |
| Hematoxyline-1 | Thermo Scientific | 7221 | |
| Eosin-Y | Thermo Scientific | 7111 | |
| Cytoseal 60 | Thermo Scientific | 8310-16 | Mounting solution |
References
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