Summary
我々は、in vivoでの歯髄創傷治癒と修復象牙質形成の評価のために、マウスの歯の上にキャッピング直接パルプを行うステップ・バイ・ステップ方式を説明します。
Protocol
マウスは、ジャクソン研究所から購入し、実験動物医学のUCLA課（DLAM）における病原体のない動物施設で飼育しました。実験は、学長の動物研究委員会（ARCの＃2016から037）から承認された機関のガイドラインに従って行いました。
1.マウスの麻酔
- 8週齢の雌C57 / BL6マウスを使用した（n = 3）。
- ケタミン（マウス体重の80から120ミリグラム/キログラム）/キシラジン（5 mgの/マウスの体重のkg）の溶液を用いてマウスを麻酔し、10 mLの/ kgの用量で腹腔内（ip）に投与します。
- ケタミンを準備します（80から120ミリグラム/キログラム）/キシラジン（5mg / kg）ソリューションおよび10 mLの/ kgの用量で腹腔内（ip）に、それらを管理します。
- マウスが完全につま先のピンチを実行することにより麻酔していることを確認します。
2.パルプキャッピング手順
- マウスの口に口ホルダーを配置します。
- 彼そのようなテーブルの上に口ホルダーを固定します広告が上向きにされています。
- 最初の上顎臼歯が完全に表示されるように、口の上に顕微鏡（10倍）を配置します。
- パルプは透明象牙質を介して表示されるまで20万rpmで高速ハンドピースで1/4ラウンドバーを使用して、途中で歯のエナメル質の部分を削除します。バリでパルプを公開しないでください。
- ＃15歯内K-ファイル（150μmの直径）を使用して、象牙質を通して穿孔し、パルプを公開します。
注：象牙質の破片は、パルプ中に押し込まれないように特別な注意が必要です。これは、四半期ごとのK-ファイルを回転した後、K-ファイルアウトを引っ張ることによって回避することができます。 - 製造元の指示に従って滅菌H 2 OでMTAを混ぜます。エクスプローラの先端で露出してパルプにMTAを提供し、配置します。穏やかなタッピングによって公開されたパルプにMTAをパックするために、紙ポイント（ファイン）の裏面を使用してください。紙点の厚い側は平坦であるため、でき露出されたパルプへのMTAの適切な凝縮のため。
- それだけで歯をカバーして35％リン酸エッチング液を配置することにより、15秒のための歯をエッチングします。それは歯肉組織を刺激することができるように、エッチング液の配置を制限するために特別な注意を払ってください。
注：エッチング液をシリンジに来て、歯科用接着剤は、歯の上にマイクロメカニカル結合を媒介することで流れることができるように、歯の表面を粗面化するために使用されます。それらは粘性であるため、それが歯に直接少量を適用することによって、自己完結型であることができます。 - エッチング液を除去するために、負の圧力をかけ吸引を使用してください。軽くエッチング剤の残留物を除去するために、H 2 Oで浸漬された綿ペレットを使用してください。エッチング液が歯から完全に除去されるまで、この手順を繰り返します。
- 圧縮エアダスターを使用し、軽く歯を乾燥させます。
- 紙ポイントの裏面を使用した歯科用接着剤を適用します。
- 3秒間の圧縮空気を使用して接着剤層を薄く。
- C言語URE硬化光ユニットを用いて20秒間の歯科用接着剤。
- MTAでキャップされた歯の上に少量で流動可能な複合材料を配置します。歯の溝に複合体を流れるようにエクスプローラの先端を使用してください。
- それを重合する光硬化ユニットを用いて30秒間複合体を硬化します。コンポジットが完全に硬化し、ハードエクスプローラを使用していることを確認してください。
3.術後のケア
- すぐに覆髄手順の後にカルプロフェン（5 mgの/ kg）を皮下（SC）を管理します。
- 彼らが目を覚ます前に暖かい動物を保つために低電力で加熱パッド上にマウスを置きます。
- 住宅用ビバリウムにマウスを返します。
4.組織調達
- 5の後 - 6週間、イソフルランとの完全な麻酔状態の下で頸椎脱臼によりマウスを安楽死させます。
- 慎重に頭蓋底から上顎を除去し、50 mLチューブに入れて。 entirを修正しました。4℃で一晩、パルプでキャップされた歯とPBS、pH7.4中の4％パラホルムアルデヒドでキャップされていない反対側の歯の両方が含まれ、その後70％エタノール溶液に保存し、電子の上顎。
注：パラホルムアルデヒドは有毒で発癌性です。標準作業手順（SOP）に概説されるように適切な使用のパラホルムアルデヒドを監視する必要があります。 - μCTスキャンを用いてマウスの上顎をスキャンします。 70％エタノールを浸したガーゼでサンプルをラップし、15 mLの細胞培養チューブの中に置いて、スキャン中に上顎を固定します。
5.μCTスキャン
- μCTスキャンのためのサンプルを準備します。簡潔には、70％エタノールに浸したガーゼで試料をラップし、一般的な15-mLの細胞培養コニカルチューブに固定します。メーカーの説明書で概説されるように、μCT走査ステージ上にチューブをマウントします。
- 145μAの電流55のkVpの電圧、及び2の露光時にX線源を設定します00ミリ秒。
- 20μmの解像度でと0.5ミリメートルのAlフィルタとμCTスキャナーで画像取得を実行します。
- 画像を再構成し、それ11を視覚化します 。
- μCTスキャンが完了すると、2週間、5％EDTA、PBS中4％スクロース（pH7.4）で脱灰し始めます。
6.組織処理と染色
- パラフィンで脱灰組織を埋め込みます。埋め込む前に、すぐに第一大臼歯の前方矢状カットを行うことで、上顎をトリミング。埋め込む一方で、第一大臼歯の縦断面が切断面となるように、下向きのこの面を配置します。
- ミクロトームを用いて、厚さ5μmのスライドを準備します。パルプキャップ領域は、通常、ランドマークとして使用することができるdistopalatal（DP）ルートと一致します。光学顕微鏡下で組織学を調べ、μCT画像を比較することにより、関心の正確な面積を決定します。
- H＆E染色、deparaのためffinize、キシレン（2回）と連続的に希釈したエタノール（100％エタノール2回、95％エタノール2倍、および70％エタノール1×）でスライドを再水和。
- 水道水でスライドを洗浄します。
- 2.5分間ヘマトキシリン溶液で染色し、水道水ですすいでください。
- 1分間、95％エタノールでスライドを浸します。
- 1分間エオシン溶液で染色し、水道水ですすいでください。
- 連続希釈したエタノール（70％エタノール1倍、95％エタノール2倍、および100％エタノール3×）、キシレン（3×）で脱水。
- マウントソリューションでスライドをマウントします。
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Representative Results
ここでは、マウスの歯にキャッピングパルプを実行するためにステップバイステップの手順を示しました。マウスでキャッピングパルプの重要な側面の一つは、適切な装置を持つことです。この点において、10Xパワー倍率で顕微鏡を有する（ 図1A）が不可欠です。歯のClass-I様準備を作成するには、20万回転（ 図1B）の電気高速ハンドピースに1/4ラウンドのバリを使用しました。あるいは、圧縮空気を使用するものを含む他のエンジンは、歯を調製するために使用することができます。
図2A-2Eは、パルプキャッピングを実行するための代表的な手順が示されています。クラスIのような製剤は、（ 図2B）を行いました。水スプレーは、手順の間にマウスを紛らすことがあるので、その使用は推奨されません。このため、優しくintermiで歯を調製することが不可欠ですttentは過熱を防ぐためにストローク。圧縮空気の使用は、冷却効果を提供することをお勧めします。これは、修復象牙質形成（ 図2C）でのデータの解釈を妨げる可能性歯内治療ファイルでパルプを露出させ、パルプに象牙質の破片をプッシュしていない注意してください。これは、圧縮空気を使用することによって回避することができます。同様に、MTAは、パルプにすぎ押さずに露出してパルプに配置する必要があります。 MTAの配置は、穏やかなタッピング動作（ 図2D）で紙点の裏面を使用することによって達成することができます。 MTA配置した後、歯は、歯の上に、複合体の結合を妨害する可能性がある、溝内に残っているMTAを除去するために、H 2 O-浸した綿ペレットを使用して洗浄する必要があります。複合修復する従来の方法は、（流動可能な複合材料を、歯の表面をエッチング接着剤でプライミングおよび結合し、配置して硬化を含め、使用されています図2E）。
6週間パルプキャッピング後、マウスを回収し、そして上面図を複合体は（ 図3A）依然として無傷であったことを確認するために撮影しました。 μCTスキャンは、修復象牙質が歯髄に形成されたことを示唆している、パルプをかぶったグループ（ 図3B）に歯髄スペースの大幅な景気後退を示しました。脱灰組織サンプルはさらに、生体内で組織学的に修復象牙質の形成を調べるためにH＆E染色に供しました。対照群では、象牙芽細胞層（OB）が象牙質（ - 4C図4A）のエッジの周りに顕著に明らかでした。対照的に、パルプキャッピング基は、歯髄空間（ - 4F図4D）に形成された修復象牙質のかなりの量（RD）を有していました。興味深いことに、綿密に検討を修復象牙質（RD）は象牙質の典型的な特徴（ 例えば、秒を示したことを明らかにしました象牙細管、赤い矢印を表す線）、ならびに骨のトラップされた骨芽細胞、黒色の矢じりを表す（ 例えば、骨細胞）をtriated。私たちは象牙質マトリックスタンパク質1（DMP1）、歯原性分化12のマーカーについて染色したとき、我々はキャップされていない歯（ 図5Aおよび5B）に比べパルプに覆われた歯の歯髄におけるDMP1の発現の有意な増加を発見しました、修復象牙質の歯髄内に形成されたことを示します。
図1：パルプ・キャッピング手順のための機器のセットアップ。 （A）マウスの歯を可視化するための顕微鏡（10倍）。 （B）の高速ハンドピースとパルプを公開するクラスI製剤を調製するための電動モータエンジン。= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：キャッピング手順で代表的な手順。 （A）マウスにおける上顎第一大臼歯に準備されていない歯。 （B）四半期ラウンドのバリを使用して、初期のエナメル除去。歯内のファイルを使用して、（C）パルプ暴露。露出されたパルプ中の（D）MTA配置。歯の上（E）複合復元配置。バーは500μmで表します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：臨床プレゼンテーションとμCTScanninマウスにおけるパルプ、蓋をして、キャップのない歯のグラム。 （A）パルプをかぶった歯（左）とキャップなし歯（右）上でマウス上顎の咬合ビュー。 （B）上顎の断面μCT画像。バーは500μmで表します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：in vivoでの修復象牙質形成の組織学的証拠。 100X、200X、および400Xでのマウスでキャップされていない上顎第一大臼歯の（AC）H＆E染色。 100X、200X、および400Xでのマウスでは、パルプをかぶった上顎第一大臼歯の（DE）H＆E染色。 RD =修復象牙質;黒矢じり=バーは100μmで（OB =象牙芽細胞層を表し、骨細胞;赤色の矢印=象牙細管）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5：DMP1の免疫組織化学染色。 400Xでのマウスでキャップされていない上顎第一大臼歯の（A）DMP1染色。 400Xでのマウスでは、パルプをかぶった上顎第一大臼歯の（B）DMP1染色。バーは100μmで表します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
現在、歯髄幹細胞（DPSCs）13の歯原性分化に歯科材料、足場、または成長因子のin vivoでの効果を検証するために利用可能ないくつかの異なる実験モデルがあります。これらのモデルは、腎カプセル、または足場14,15と免疫不全マウスにDPSCsの皮下移植などの臓器へのDPSCsの異所性自家移植が含まれます。しかしながら、これらの方法はDPSCsに対するそれらの歯原性効果は同所パルプ環境で行われていないという点で制限されています。一方、歯の上パルプ、パルプ・キャッピング手順に同所移植は大型動物16,17で使用されています。これらのモデルは同所環境で歯原性の可能性を評価する上で貴重であるが、それらのモデルの使用は、パルプ創傷治癒と修復象牙質形成に限定されたメカニズムの洞察を提供し、自然の中で主に観察されます。 本稿では、マウスでは、パルプ・キャッピングを実行するための詳細な方法を提示します。このステップバイステップの手順では、μCTスキャンで分析し、修復象牙質形成のための組織サンプルを評価し、上顎を収穫、マウスを麻酔クラスI様キャビティを準備し、覆髄材を配置することを含みます。私たちの覆髄マウスモデルは、研究コミュニティで広く入手可能であるトランスジェニックやノックアウトマウスの使用を可能にすることによって、修復象牙質の文脈におけるin vivoでの歯髄創傷治癒の基本的な分子機構を調査するのに役立つであろう。
最近の研究では、象牙質形成が18,19に観察されたいくつかのマウスモデルを示しました。斉藤ら。反動はなく、修復、象牙質形成を刺激するパルプの露出のないクラスI様準備を、作成しました。反動象牙質と修復象牙質の両方が三次象牙質に分類されています、歯に以下の外部刺激を形成します。しかし、既存の象牙芽細胞によって形成される反動象牙質とは異なり、修復象牙質は、歯髄が露出し、象牙芽細胞層を20に違反しているとなりDPSCsとして象牙芽細胞様細胞によって形成されます。したがって、診療所における実際の覆髄手順を表すものではありません。別の研究では、ガラスアイオノマーは、パルプ露光19をキャップするために使用されました。しかしながら、臨床試験は、ガラスアイオノマーは慢性炎症ではなく、修復象牙質21に誘発されたことを示しました。この点で、我々のパルプキャッピングマウスモデルは、より良い患者の実際のパルプキャッピングの手順を表します。
我々が6週間以上後のマウスを収穫するとき、修復象牙質形成は髄室と根管（ 図4）全体で発生したことは注目に値します。このような観察は、我々は6月で修復象牙質形成を予想通り、かなり予想外であります覆髄材とパルプの間ction。しかし、パルプの強力な石灰化は、特に比較的若い患者22に、臨床で観察されます。本研究で用いた8週齢のマウスを、「青年」23であると考えられるので、これらのマウスは、まだかなりの歯原性の可能性を保有することにより、可能性が存在します。したがって、マウスでの修復象牙質形成の経年変化を調べるために価値があるだろう。
私たちの組織学的検査は、修復象牙質が明らかにパルプをかぶった歯に形成されたが、修復中の象牙細管（赤矢印）および骨細胞（黒矢印）の存在によって証明されるように、両方の象牙質および骨形成の特性は、あった、ことを明らかにしました象牙質（ 図5）。このような観察は、修復象牙質形成が局所的に象牙芽細胞様の歯髄幹細胞、ならびにinfiltratinが存在することによって誘導され得ることを示唆しています周囲の骨からグラム間葉系幹細胞。
酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（TRAP）染色によって決定されるように象牙質形成細胞と比較して、我々は、パルプ内には象牙質再吸収細胞は認められなかった（データは示さず）。確かに、歯髄や根尖炎症は、歯の周りの骨表面上ではなく、として、まだ未知のメカニズム24による象牙質表面に破骨細胞形成を誘導します。注目すべきは、既存の象牙質および新たに形成された修復象牙質（ 図4）との間に明確な境界がありました。以前の研究では、同様の現象を実証しました。歯が破骨細胞の機能を阻害どちらも、ビスホスホネートまたは抗RANKL抗体の存在下で抽出された場合、既存の層板骨と新たに形成された網状骨25との間に明確な境界設定がありました。この概念は、さらにパルプ中の象牙質吸収細胞の不在をサポートしています。総称して、私たちの確立マウスモデルは、pだろうパルプ創傷治癒およびin vivoでの修復象牙質形成のメカニズムを検討するためのユニークな機会をrovide。
歯髄キャッピングマウスモデルには限界があります。ヒトとマウスの間の遺伝的メイクは明らかに異なっています。完全なゲノムは、ヒトおよびマウスにおいて配列決定されており、マウスとヒト26,27間のタンパク質コード領域で約85％の類似性が存在します。この考え方に沿って、それは動物でキャッピングパルプに関連する所見が必ずしも人間28のものを反映していないことが示唆されました。それにもかかわらず、動物モデルは広く、関節リウマチ29、全身性ショック31のための骨粗しょう症30、リポポリサッカライド（LPS）投与のためのovariactomy誘発性骨量減少、結紮のためのコラーゲン誘導関節炎などの生体内でのヒト疾患を再現するための研究コミュニティで使用されています歯周32の配置。このように、畝を覆髄SEモデルは、in vivoでのパルプ創傷治癒と修復象牙質形成の分子メカニズムを調べるために不可欠となります。それにもかかわらず、ちょうど他の動物モデルと同様に、覆髄マウスモデルからの所見の解釈および検証は慎重に評価する必要があります。
要約すると、現在の研究では、マウスにおいて、キャッピング成功したパルプを示しています。で基礎となるメカニズムを解明するために広く利用可能な遺伝子操作されたマウス系統を利用する1）機会を：それは提供するため、他の既知のモデルとは異なり、この覆髄マウスモデルは、パルプ再生の分野で非常に貴重な研究ツールと修復象牙質形成を提供します分子レベル2）経済的に効率的な方法は、サンプルサイズを増加させることによって、統計的に有意な結果を得ることができます。さらなる研究は、in vivoでの修復象牙質形成の客観的定量化を含め、修復象牙質形成の年齢依存的効果、evaluaを待ちます臨床的に利用可能な覆髄材の化、および適切な歯髄創傷治癒および修復象牙質の再生のために必要とされる分子決定の検証。
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Acknowledgments
この研究は、NIDCR / NIHからR01DE023348（RHK）とカリフォルニア大学ロサンゼルス部門の学術上院の研究評議会から教員研究助成（RHK）によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BM-LED stereo microscope | MEIJI Techno | Microscope | |
| Optima MCX-LED | Bien Air Dental | 1700588-001 | Electic motor engine |
| isoflurane | Henry schein animal health | NDC 11695-0500-2 | |
| 1/4 round bur | Brasseler | 001092T0 | |
| Endodontic K-file | Roydent | 98947 | |
| ProRoot MTA | Dentsply | PROROOT5W | MTA |
| Paper point | Henry schein | 100-3941 | |
| Ultra-Etch | Ultradent product Inc. | Phosphoric acid etchant | |
| OptiBond SoloPlus | Kerr | 29669 | Adhesives |
| Coltolux LED | Coltene/whaledent Inc. | C7970100115 | Curing light unit |
| Characterization tint | Bisco | T-14012 | Flowable composite |
| Skyscan | Breuker | 1275 | uCT scanner |
| Microm | Thermo | HM355S | Microtome |
| Hematoxyline-1 | Thermo Scientific | 7221 | |
| Eosin-Y | Thermo Scientific | 7111 | |
| Cytoseal 60 | Thermo Scientific | 8310-16 | Mounting solution |
References
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