Summary
Se describe un método paso a paso de realizar el recubrimiento pulpar directo en ratones dientes para la evaluación de la cicatrización de la herida pulpar y la formación de dentina de reparación in vivo.
Protocol
Los ratones fueron adquiridos de Jackson Laboratory y se mantienen en un vivero libre de patógenos en la División de UCLA de Medicina de Laboratorio Animal (DLAM). Los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices institucionales aprobados desde el Comité de Investigación Animal del Canciller (ARC # 2016-037).
1. Ratón anestesia
- Utilizar ratones hembra C57 / BL6 de ocho semanas de edad (n = 3).
- Anestesiar los ratones utilizando ketamina (80 a 120 mg / kg de peso de ratón) / xilazina soluciones (5 mg / kg de peso de ratón) y administrar por vía intraperitoneal (ip) a una dosis de 10 ml / kg.
- Preparar ketamina (80 - 120 mg / kg) / xilazina (5 mg / kg) soluciones y administrarlos por vía intraperitoneal (ip) a una dosis de 10 ml / kg.
- Confirman que los ratones están completamente anestesiados mediante la realización de una pizca dedo del pie.
2. Procedimiento de recubrimiento pulpar
- Coloque el soporte de boca en la boca del ratón.
- Fije el soporte boca sobre la mesa de manera que la quead quede hacia arriba.
- Coloque el microscopio (10X) en la parte superior de la boca de manera que el primer molar superior es totalmente visible.
- El uso de la fresa de ¼ de vuelta en una pieza de mano de alta velocidad a 200.000 rpm, quitar la parte de esmalte del diente en el medio hasta que la pulpa es visible a través de la dentina transparente. No exponer la pulpa con la fresa.
- El uso de un K-lima de endodoncia # 15 (diámetro de 150 micras), perforar a través de la dentina y exponer la pulpa.
NOTA: Se debe tener especial cuidado para que los restos de dentina no consigue empujado en la pulpa. Esto se puede evitar mediante la rotación del archivo-K trimestral y luego tirando de la K-archivo fuera. - Mezclar MTA con H2O estéril de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Entregar y colocar el MTA en la pulpa expuesta con la punta del explorador. Utilice el lado posterior de la punta de papel (fino) para empacar el MTA en la pulpa expuesta con unos golpecitos suaves. La parte gruesa de la punta de papel es plano y por lo tanto permitepara la condensación adecuado de la MTA en la pulpa expuesta.
- Grabar el diente durante 15 s, colocando el grabador de ácido fosfórico al 35% cuando sólo cubre el diente. Tenga especial cuidado para limitar la colocación del reactivo de ataque, ya que puede irritar los tejidos gingivales.
NOTA: El reactivo de ataque viene en una jeringa y se utiliza para hacer rugosa la superficie de los dientes de modo que los adhesivos dentales pueden fluir en mediar la unión micromecánica sobre el diente. Debido a que son viscoso, puede ser en sí misma mediante la aplicación de pequeñas cantidades directamente en el diente. - Utilice negativa de succión-presión para eliminar el reactivo de ataque. Utilice una bolita de algodón que se empapa ligeramente con H 2 O para eliminar los residuos de la solución de ataque. Repita este paso hasta que el grabador se elimina por completo del diente.
- El uso de un limpiador de aire comprimido, secar suavemente el diente.
- Aplicar los adhesivos dentales utilizando el lado posterior de la punta de papel.
- Hacer que la capa adhesiva delgada con aire comprimido durante 3 s.
- doUre los adhesivos dentales durante 20 s usando la unidad de curado por luz.
- Coloque el composite fluido en pequeñas cantidades sobre el diente que fue internacional con MTA. Use la punta del explorador a fluir el material compuesto en las ranuras de los dientes.
- Curar el material compuesto durante 30 s usando una unidad de fotocurado para polimerizar la misma. Confirmar que el compuesto está completamente curado y duro usando el explorador.
3. Post-op Cuidado
- Administrar carprofeno (5 mg / kg) por vía subcutánea (sc) inmediatamente después del procedimiento de recubrimiento pulpar.
- Coloque los ratones en una almohadilla térmica a baja potencia para mantener a los animales tibia antes de que despierten.
- Devolver los ratones para el vivero de la vivienda.
Contratación 4. Tejido
- Después de 5 - 6 semanas, la eutanasia a los ratones por dislocación cervical bajo una condición de anestesia completa con isoflurano.
- Retirar con cuidado el maxilar superior fuera de la base del cráneo y lo puso en un tubo de 50 ml. Fijar la entire maxilar que contiene tanto el diente pulpa-tapado y destapado el diente contralateral en 4% de paraformaldehído en PBS, pH 7,4, a 4 ° C durante la noche, y luego la almacena en una solución de etanol al 70%.
NOTA: El paraformaldehído es tóxico y cancerígeno. El uso adecuado de paraformaldehído debe controlarse como se indica en los procedimientos operativos estándar (SOP). - Analiza los maxilares ratón usando el escaneo μCT. Para asegurar el maxilar durante la exploración, envolver las muestras con una gasa empapada con 70% de etanol y colocarlos en el tubo de cultivo de células de 15 ml.
5. Escaneo μCT
- Preparar las muestras para μCT de exploración. Brevemente, las muestras envolver con una gasa empapada con 70% de etanol y fijarlos en un tubo cónico de cultivo de células de 15 ml genérico. Montar el tubo en la etapa de exploración μCT, como se indica en las instrucciones del fabricante.
- Ajuste la fuente de rayos X a una corriente de 145 mu, una tensión de 55 kVp, y un tiempo de exposición de 200 ms.
- Realizar la adquisición de imágenes con el escáner μCT a una resolución de 20 micras y con un filtro de 0,5 mm de Al.
- Reconstruir la imagen y visualizarlo 11.
- Una vez que la exploración μCT, inicie descalcificación con EDTA al 5% y 4% de sacarosa en PBS (pH 7,4) durante 2 semanas.
6. procesamiento de tejido y tinción
- Incrustar los tejidos descalcificadas en parafina. Antes de ser colocado, recortar el maxilar haciendo un corte sagital de inmediato anterior al del primer molar. Si bien la incrustación, la posición de esta superficie hacia abajo, de manera que la sección longitudinal de la primera molar es la superficie de corte.
- Usando el microtomo, preparar las diapositivas 5 micras de grosor. Las áreas de recubrimiento pulpar generalmente coinciden con la raíz distopalatina (DP), que puede ser utilizado como un punto de referencia. Determinar el área exacta de interés mediante el examen de la histología en el microscopio óptico y la comparación de las imágenes μCT.
- Para tinción H & E, deparaffinize y rehidratar los portaobjetos con xileno (2 x) y etanol diluido en serie (100% EtOH 2x, 95% de EtOH 2x, y 70% de EtOH 1x).
- Enjuague los portaobjetos con agua corriente del grifo.
- Teñir con una solución de hematoxilina durante 2,5 minutos y enjuagar con agua del grifo.
- Sumergir los portaobjetos en 95% de etanol durante 1 min.
- Teñir con una solución de eosina durante 1 min y enjuague con agua del grifo.
- Deshidratar con etanol diluido en serie (70% EtOH 1x, 95% EtOH 2x, y 100% EtOH 3x) y xileno (3x).
- Montar los portaobjetos con solución de montaje.
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Representative Results
A continuación, mostramos los procedimientos paso a paso para llevar a cabo el recubrimiento pulpar de los dientes ratones. Uno de los aspectos clave de recubrimiento pulpar en ratones es tener el aparato apropiado. En este sentido, teniendo el microscopio con un aumento de potencia de 10X es esencial (Figura 1A). Para crear una preparación de Clase-I-al igual que en el diente, se utilizó una fresa de ¼ de vuelta en una pieza de mano de alta velocidad eléctrica a 200.000 rpm (Figura 1B). Alternativamente, cualquier otros motores, incluyendo los que usan aire comprimido, se pueden utilizar para preparar un diente.
En la Figura 2A-2E, se muestran los pasos representativos para realizar el recubrimiento pulpar. La preparación de clase-I-como se llevó a cabo (Figura 2B). Debido a que un rocío de agua puede ahogar a los ratones durante el procedimiento, no se recomienda su uso. Por esta razón, es esencial para preparar el diente con suave y intermittent trazos para evitar el sobrecalentamiento. También se recomienda el uso de aire comprimido para proporcionar efectos de enfriamiento. Mientras que la exposición de la pulpa con una lima de endodoncia, tomar la precaución de no empujar los escombros de la dentina hacia la pulpa, ya que esto puede interferir con la interpretación de los datos en la formación de dentina reparadora (Figura 2C). Esto se puede evitar mediante el uso de aire comprimido. Del mismo modo, la MTA se debe colocar en la pulpa expuesta sin empujar demasiado lejos en la pulpa. Colocación MTA se puede lograr mediante el uso de la parte trasera de la punta de papel con movimientos suaves golpecitos (Figura 2D). Después de la colocación MTA, el diente debe limpiarse con H 2 O bolitas de algodón empapadas-para eliminar cualquier MTA que queda en las ranuras, que pueden interferir con la unión del material compuesto sobre el diente. Se utilizan métodos convencionales de restauración de composite, incluyendo el grabado de las superficies de los dientes, el cebado y la unión con adhesivos, y la colocación y curado de las resinas fluidas (Figura 2E).
Seis semanas después de que el recubrimiento pulpar, se cosecharon los ratones, y la vista desde arriba se fotografió para confirmar que el compuesto estaba intacta (Figura 3A). μCT exploración mostró significativa recesión del espacio pulpar en el grupo de pulpa-capsulado (Figura 3B), lo que sugiere que la dentina reparadora se formó en la pulpa. Las muestras de tejidos descalcificadas se sometieron a tinción H & E para examinar más histológicamente la formación de dentina de reparación in vivo. En el grupo control, las capas odontoblásticos (OB) eran prominente evidente alrededor de los bordes de la dentina (Figura 4A - 4C). En contraste, el grupo de recubrimiento pulpar tenía cantidades significativas de dentina reparadora (RD) formado en el espacio de la pulpa (Figura 4D - 4F). Curiosamente, un examen más detallado reveló que la dentina reparadora (RD) exhibió una característica típica de la dentina (por ejemplo, s triated líneas que representan los túbulos dentinarios, flecha roja), así como la del hueso (por ejemplo, osteocitos representan osteoblastos atrapadas, puntas de flecha negras). Cuando se tiñeron para dentina Matrix Protein 1 (DMP1), un marcador para la diferenciación odontogénico 12, se encontró un aumento significativo en la expresión DMP1 en la pulpa del diente pulpa-tope cuando se compara con la del diente destapado (Figura 5A y 5B) , lo que indica que la dentina reparadora se formó dentro de la pulpa.
Figura 1: La Configuración del equipo para el procedimiento de recubrimiento pulpar. (A) Un microscopio (10X) para visualizar el diente ratón. (B) La pieza de mano de alta velocidad y el motor de motor eléctrico para la preparación de una preparación de la clase I para exponer la pulpa.= "_ Blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Pasos representante en el procedimiento de revestimiento. (A) el diente no preparado en el primer molar superior en un ratón. (B) la eliminación del esmalte inicial utilizando la fresa de un cuarto de vuelta. (C) la exposición de la pulpa utilizando el archivo de endodoncia. (D) MTA colocación en la pulpa expuesta. (E) la colocación de la restauración de síntesis sobre el diente. La barra representa 500 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Presentación clínica y μCT scanning del diente cubiertas de pulpa y debutante en ratones. (A) Vista oclusal del maxilar superior del ratón sobre el diente de pasta con tapón (izquierda) y el diente destapado (derecha). (B) Las imágenes μCT de sección transversal de los maxilares. La barra representa 500 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: La evidencia histológica de dentina reparadora formación in vivo. (AC) tinción H & E del primer molar superior destapado en un ratón a 100X, 200X, 400X y. Tinción (DE) H & E del primer molar superior pulpa rematados en un ratón a 100X, 200X, 400X y. La barra representa 100 micras (OB = odontoblásticas capas; RD = dentina reparadora; puntas de flecha negras =osteocitos; Houthaven túbulos de la dentina). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: tinción inmunohistoquímica de DMP1. Tinción (A) DMP1 del primer molar superior destapado en un ratón a 400X. (B) tinción DMP1 del primer molar superior pulpa rematados en un ratón a 400X. La barra representa 100 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Actualmente, hay varios modelos experimentales disponibles para validar los efectos in vivo de los materiales dentales, andamios, o factores de crecimiento sobre la diferenciación odontogénico de células madre de la pulpa dental (DPSCs) 13. Estos modelos incluyen el trasplante autólogo de ectópico DPSCs en un órgano, tales como la cápsula renal, o trasplante subcutáneo de DPSCs en ratones inmunocomprometidos con andamios 14,15. Sin embargo, estos métodos están limitados en que su efecto odontogénico en DPSCs no se realiza en el entorno de la pulpa ortotópico. Por otro lado, el trasplante ortotópico en los procedimientos de pulpa o de recubrimiento pulpar de un diente se utilizan en animales más grandes 16,17. Aunque estos modelos son valiosos en la evaluación de potencial odontogénico en el entorno ortotópico, el uso de estos modelos es en gran parte de naturaleza observacional, y proporciona información mecanicistas limitados sobre la cicatrización de la pulpa de la herida y la formación de dentina reparadora. En este trabajo, se presenta un método detallado para llevar a cabo de recubrimiento pulpar en ratones. Este procedimiento paso a paso incluye anestesiar a los ratones, la preparación de la cavidad Clase-I-al igual que, la colocación de los materiales de recubrimiento pulpar, la recolección de los maxilares, analizando con el μCT escanear, y la evaluación de muestras de tejido para la formación de dentina reparadora. Nuestro modelo de ratón de recubrimiento pulpar jugará un papel decisivo en la investigación de los mecanismos moleculares fundamentales de la cicatrización de la herida pulpar in vivo en el contexto de la dentina reparadora al permitir el uso de ratones transgénicos o knockout, que están ampliamente disponibles en la comunidad de investigación.
Estudios recientes demostraron varios modelos de ratón en los que se observó la formación de dentina 18,19. Saito et al. creado una preparación de la clase-I-como sin exposición de la pulpa, que estimula, no reparador, la formación de dentina reaccionaria. Tanto la dentina reaccionaria y dentina reparadora se clasifican como dentina terciaria, Que forma después de la estimulación externa al diente. Sin embargo, a diferencia de la dentina reaccionaria, que está formada por odontoblastos existentes, dentina reparadora está formado por células de odontoblastos similar, como DPSCs, cuando la pulpa queda expuesta y las capas odontoblásticos no se cumplen 20. Por lo tanto, no representa un procedimiento de recubrimiento pulpar real en la clínica. En otro estudio, ionómero de vidrio se utiliza para tapar el 19 de exposición de la pulpa. Sin embargo, un estudio clínico demostró que el ionómero de vidrio indujo la inflamación crónica, pero no reparadora dentina 21. En este sentido, nuestro modelo de ratón de recubrimiento pulpar mejor representa el procedimiento de recubrimiento pulpar real en los pacientes.
Es de destacar que cuando cosechamos ratones después de más de 6 semanas, la formación de dentina reparadora se produjo a lo largo de la cámara pulpar y los canales radiculares (Figura 4). Esta observación es bastante inesperado, como anticipamos la formación de dentina reparadora en juncción entre el material de recubrimiento pulpar y la pulpa. Sin embargo, potente mineralización de la pulpa se observa también en la práctica clínica, especialmente en pacientes relativamente jóvenes 22. Debido a que los ratones de 8 semanas de edad usados en este estudio se consideran "jóvenes adultos" 23, existe la posibilidad mediante el cual estos ratones todavía albergan potencial odontogénico significativo. Por lo tanto, sería conveniente examinar los efectos del envejecimiento de la formación de dentina reparadora en ratones.
Nuestros exámenes histológicos revelaron que, aunque dentina reparadora estaba claramente formado en el diente pulpa-capsulado, había características tanto de la formación de dentina y el hueso, como se evidencia por la presencia de los túbulos dentinales (flecha roja) y osteocitos (puntas de flecha negras) en el reparadora dentina (Figura 5). Estas observaciones sugieren que la formación de dentina reparadora se puede inducir por residir localmente las células madre de la pulpa dental de odontoblastos-similares, así como infiltrating de células madre mesenquimales de la médula circundante.
En comparación con las células formadoras de dentina, no se encontraron células de resorción de dentina dentro de la pulpa, como se determina por la fosfatasa ácida resistente al tartrato tinción (TRAP) (datos no mostrados). De hecho, la inflamación pulpar o periapical induce la formación de osteoclastos en las superficies del hueso alrededor de los dientes, pero no en las superficies de dentina debido a mecanismos como todavía desconocido 24. Es de destacar que hubo una clara demarcación entre la dentina existente y la dentina reparadora recién formado (Figura 4). Un estudio anterior demostró un fenómeno similar; cuando un diente se extrae en presencia de bisfosfonato o anticuerpo anti-RANKL, los cuales inhiben las funciones de los osteoclastos, había claras demarcaciones entre hueso laminar existente y tejido óseo recién formado 25. Esta noción apoya aún más la ausencia de células de resorción de dentina en la pulpa. En conjunto, nuestro modelo de ratón establecida haría provide oportunidades únicas para examinar los mecanismos de cicatrización de la herida y la formación de pulpa de dentina de reparación in vivo.
Hay una limitación para el modelo de ratón de recubrimiento pulpar. maquillajes genéticas entre los seres humanos y los ratones son claramente diferentes. El genoma completo ha sido secuenciado en humanos y ratones, y hay alrededor de 85% de similitud en las regiones codificantes de proteínas entre ratones y seres humanos 26,27. En consonancia con esta idea, se sugirió que los hallazgos relacionados con el recubrimiento pulpar en los animales no reflejan necesariamente los de los humanos 28. Sin embargo, los modelos animales se utilizan ampliamente en la comunidad de investigación para recapitular enfermedades humanas en vivo, tales como la artritis inducida por colágeno para artritis reumatoide 29, la pérdida de hueso ovariactomy inducida para la osteoporosis 30, lipopolisacárido administración (LPS) para el shock sistémico 31, y la ligadura la colocación de la periodontitis 32. Como tal, el mou de recubrimiento pulparmodelo SE será esencial examinar los mecanismos moleculares de la curación de heridas y la formación de pulpa de dentina de reparación in vivo. No obstante, al igual que otros modelos animales, la interpretación y validación de los resultados del modelo de ratón de recubrimiento pulpar debe ser cuidadosamente evaluado.
En resumen, el presente estudio demuestra la pulpa con éxito en ratones tapado. A diferencia de otros modelos conocidos, este modelo de ratón de recubrimiento pulpar proporcionará un valioso instrumento de investigación en el campo de la regeneración de la pulpa y la formación de dentina reparadora, ya que proporciona: 1) la oportunidad de utilizar ampliamente disponibles cepas de ratones genéticamente modificados para dilucidar los mecanismos que subyacen en el nivel molecular y 2) una forma económicamente eficiente para obtener resultados estadísticamente significativos mediante el aumento de tamaño de las muestras. Otros estudios esperan, incluyendo la cuantificación objetiva de la formación de dentina de reparación in vivo, los efectos dependientes de la edad de la formación de dentina reparadora, evaluala de los materiales de recubrimiento pulpar clínicamente disponibles, y la validación de los determinantes moleculares que son necesarios para la curación de heridas de la pulpa y la regeneración de la dentina reparadora.
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Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por R01DE023348 (RHK) del NIDCR / NIH y la Beca de Investigación de la Facultad (RHK) del Consejo de Investigación del Senado Académico de la División de la Universidad de California en Los Ángeles.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BM-LED stereo microscope | MEIJI Techno | Microscope | |
| Optima MCX-LED | Bien Air Dental | 1700588-001 | Electic motor engine |
| isoflurane | Henry schein animal health | NDC 11695-0500-2 | |
| 1/4 round bur | Brasseler | 001092T0 | |
| Endodontic K-file | Roydent | 98947 | |
| ProRoot MTA | Dentsply | PROROOT5W | MTA |
| Paper point | Henry schein | 100-3941 | |
| Ultra-Etch | Ultradent product Inc. | Phosphoric acid etchant | |
| OptiBond SoloPlus | Kerr | 29669 | Adhesives |
| Coltolux LED | Coltene/whaledent Inc. | C7970100115 | Curing light unit |
| Characterization tint | Bisco | T-14012 | Flowable composite |
| Skyscan | Breuker | 1275 | uCT scanner |
| Microm | Thermo | HM355S | Microtome |
| Hematoxyline-1 | Thermo Scientific | 7221 | |
| Eosin-Y | Thermo Scientific | 7111 | |
| Cytoseal 60 | Thermo Scientific | 8310-16 | Mounting solution |
References
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