Summary
여기서 우리는 원 자간 력 현미경 (AFM)을 사용하여 단일 분자 힘 분광법 측정에 의해 잘 정의 된 무기 표면 중 펩티드 또는 아미노산의 상호 작용의 힘을 측정하기위한 프로토콜을 제시한다. 측정으로부터 얻어진 정보는 더 펩타이드 무기물 계면을 이해하는 것이 중요하다.
Abstract
단백질이나 펩티드 및 무기 물질 사이의 상호 작용은 몇 가지 흥미로운 프로세스로 이어집니다. 예를 들어, 미네랄 단백질을 결합하는 독특한 성질을 갖는 복합 재료의 형성을 이끈다. 또한,의 생물 연료의 바람직하지 못한 프로세스는 표면에 생체 분자를 주로 단백질의 흡착에 의해 개시된다. 유기층은 박테리아 접착층이고 이들 표면과 상호 작용할 수있다. 유기 - 무기 계면에서의 상호 작용을 지배하는 근본적인 힘을 이해하는 것은 연구의 많은 지역을위한 것이 중요하고, 광학 기계 및 생명 의학 애플리케이션을위한 새로운 재료의 설계가 발생할 수 있습니다. 이 논문은 펩타이드 또는 아미노산 및 잘 정의 된 무기 표면 중 하나 사이의 접착력을 측정하기 위해 AFM을 이용하는 단일 분자 힘 분광 기법을 보여준다. 이 기술은 AFM에 생체 분자를 부착하기위한 프로토콜을 포함원자력 현미경에 의해 공유가요 성 링커 및 단일 분자 힘 스펙트럼 측정을 통한 팁. 또한, 이러한 측정 분석이 포함된다.
Introduction
단백질과 무기 미네랄 간의 상호 작용은 특유의 특성을 가진 복합 재료의 구성을 이끈다. 이것은 높은 기계적 강도 또는 고유 광학 특성을 갖는 물질을 포함한다. 예를 들어 1, 2, 미네랄 하이드 록시 아파타이트와 단백질 콜라겐의 조합은 서로 다른 기능을위한 연질 또는 경질의 뼈를 생성한다. 3 짧은 펩티드는 높은 특이성과 무기 물질을 바인딩 할 수 있습니다. 도 4를 참조하면, 이러한 펩티드 5, 6 특이성이 결정 9는 나노 물질의 제조, 8, 7, 새로운 자기 및 전자 재료를 설계 성장에 사용 된 (10)와 합성 나노 입자. 11 그러므로 우리가 개선 된 흡착 특성을 가진 새로운 복합 재료를 설계 할 수 펩타이드 또는 단백질과 무기 물질 사이의 상호 작용을 기본 메커니즘을 이해. 면역 반응과 임플란트의 계면이 단백질에 의해 매개되기 때문에 또한, 더 나은 무기 물질과 단백질의 상호 작용을 이해하는 것이 임플란트를 설계 할 수있는 능력이 향상됩니다. 무기 표면과 상호 작용하는 단백질을 포함하는 또 다른 중요한 영역 방오 재료의 제조이다. 12, 13, 14, 15은 생 오손 생물이 표면에 부착 한 바람직하지 않은 방법이다. 그것은 우리의 삶에 많은 부정적인 의미를 가지고있다. 예를 들어, 의료 기기에 대한 세균의 생물 연료는 병원 획득 감염으로 이어집니다. 보트와 대형 선박에 해양 생물의 생 오손은 증가 연료의 소비. 12, 16, 17, 18
단일 분자 힘 분광법 (SMFS)는 원자 현미경을 사용하여, 직접, 아미노산 또는 펩티드와 기판 사이의 상호 작용을 측정 할 수있다. 이러한 파아지 디스플레이, 27 (28) 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 다른 방법 석영 크리스탈 마이크로 저울 (QCM) (29) 표면 플라스 몬 공명 (SPR) 29, 30, 31, 32,심판 "> (33) 측정 대량의 무기 표면에 펩타이드와 단백질의 상호 작용. 34, 35, 36 그러면 이러한 방법에 의해 얻어진 결과는 분자 또는 응집체의 앙상블에 관한 것을 의미한다. SMFS에서 하나 또는 소수의 분자는 AFM 팁에 고정되고, 원하는 기판과의 상호 작용을 측정한다. 이 방법은 표면으로부터 단백질을 당겨 단백질 접힘 학습하도록 확장 될 수있다. 또한, 세포와 단백질과 그 리간드에 대한 항체의 결합 상호 작용을 측정하는데 사용될 수있다. 37, 38, 39, 40이 논문은 실라 화학 제를 사용하여 AFM 팁에 펩티드 또는 아미노산 중 하나를 부착하는 방법을 상세히 설명한다. 또한, 종이는 힘의 측정을 수행하는 방법 및 분석 방법을 설명결과.
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Protocol
1. 팁 수정
- 구매 질화 규소 (Si3N4), 실리콘 팁 AFM 캔틸레버 (~ 2 nm 인 캔틸레버 공칭 반경).
- 20 분 동안 무수 에탄올에 침지하여 각 AFM 캔틸레버를 청소합니다. 실온에서 건조. 그런 다음 5 분 동안 O 2 플라즈마에 노출시킴으로써, 캔틸레버를 처리한다.
- (15)의 비율 (3cm) 용액을 함유하는 메틸 트리에 톡시 실란 및 3- (아미노 프로필) 트리에 톡시 실란을 상기 클린 팁 일시 : 1 (V / V)를 불활성 분위기 (질소 또는 아르곤 중)하에 데시 케이 터에서하고 데시 케이 터에 연결 진공 펌프. 2 시간 동안 진공 혼합 실란 화합물의 두 종류의 단층을 형성한다.
- 핫 플레이트에 팁을 배치 (이 과정에 대한 제작) 금속 팁 홀더를 사용합니다. 이어서 대기압 조건에서 70 ° C에서 10 분 동안 팁을 건조. 사용하기 전에 에탄올을 사용하여 핫 플레이트, 금속 홀더와 핀셋을 청소합니다.
- 객실 t의 팁 쿨럼 온하고 1 시간 동안 0.5 % (v / v)의 트라이 에틸 아민을 함유하는 클로로포름 5mm의 농도 플루 오레-PEG-N 히드 록시 숙신이 미드의 용액 (FMOC-PEG-NHS, MW 5,000 다)시에 끝 몰입 실온.
- 5 분 동안 클로로포름의 팁을 찍어 후 추가로 5 분 디메틸 포름 아미드 (DMF)에 찍어. 부착 된 PEG 분자의 FMOC기를 탈 보호하기 위해 30 분 동안 DMF 중의 20 % 피 페리 딘 (V / V)의 팁을 담근다. 4 분 후, 추가로 4 분 동안 N- 메틸 -2- 피 롤리 돈 (NMP)에 DMF에 팁을 찍어. 세 번 찍기 순차를 반복합니다.
- 아미노산의 커플 링, 보호 N 말단 아미노산 (AA) / 디 이소 프로필 에틸 아민 (DIPEA) / 2- (1H- 벤조 트리아 졸 -1- 일) -1,1,3,3- 테트라 메틸 hexafluophosphate을 함유하는 용액으로 끝 몰입 1.5 시간 동안 5 ㎖ NMP 30 mm의 총 농도에서 1 : 1 : 1의 몰비 (HBTU).
- 펩티드 결합의 경우, 5 ㎖의 용액으로 계속 팁을 찍어보호 된 펩타이드의 40 mg의 aining (N 단자와 사이드 체인, 예를 FMOC-Gln의 (트리트) -Pro-의 Ala-빼앗아 (tBu 중에서) -Ser (tBu 중에서) -Arg에 대한 (PBF) -Tyr (tBu 중에서) -COOH.) 15 mg의 2- (1H- 벤조 트리아 졸 -1- 일) -1,1,3,3- 테트라 메틸 우로 늄 헥사 플루오로 포스페이트 (HBTU), 및 2 시간 동안 NMP에 DIPEA 5 ㎖.
- 4 분 동안 NMP의 팁을 찍어. 이어서, 아세틸기로 리밍 무료 / 미 NH 2 보호 몰비 4에 무수 아세트산 / DIPEA의 혼합물을 30 분 동안 팁을 찍어 : 1 NMP에서 0.65 M의 합계 농도.
- 펩타이드 결합의 경우, 두 개의 추가 단계를 수행합니다.
- 펩티드의 측쇄 탈 보호 1 시간 동안 95 % TFA, 2.5 % 트라이 아이소 프로필 실란 및 2.5 %의 물을 함유하는 용액으로 끝 몰입하고 클로로포름, DMF로 세척하기 위해.
- 30 분 동안 DMF 중의 20 % 피 페리 딘 (V / V)로 팁을 펩티드의 FMOC기를 제거 몰입하기 위해.
- 순차적으로 펩타이드 / 아미노산 기능화를 찍어클로로포름, 50 % 에탄올 및 물 (아미노산) (펩티드) DMF 또는 NMP에서 네 분마다 D 팁. 마지막으로 공기의 팁을 건조.
2. 표면 준비
- 운모를 준비합니다. 스카치 테이프를 이용하여 각각의 사용 전에 기판 (9.9 mm 직경)을 절단. 그런 다음, 트리플 증류수 (TDW)로 표면을 세척한다.
- 산화 티타늄이 코팅 된 실리콘을 준비합니다.
- 다이아몬드 펜을 사용 2cm 사각형으로 실리콘 웨이퍼 (100)를 잘라.
- 아세톤으로 채워 15 ㎖의 시험관에 상기 기판을 위치시키고 초음파 조에서 5 분 동안 초음파 처리하여. 이어서, 이소프로판올로 채워진 15ml의 시험관이 배치면을 5 분 동안 초음파 처리하여. 질소를 이용하여 기판을 건조.
- 5 % (중량 / 부피) 용액을 제조하기 위해 에탄올에 계면 활성제 (예하여, Byk-348)를 녹인다. 그 후, 2 ㎖의 30 %의 이산화 티탄 분산액에 계면 활성제 용액 0.02 mL를 첨가.
- 생성 된 용액에서 0 캐스트 놓습니다.깨끗한 Si 기판에 2 mL를.
- 공기에서 2 시간 동안 250 ° C에서 이러한 드롭 주조 표면을 어닐링. (41)
3. 단일 분자 힘 분광학 측정
- 시중에서 판매하는 두 구성 요소 접착제와 AFM의 금속 홀더에 원하는 표면을 연결합니다. 작은 페트리 접시 모양 된 AFM의 유리 홀더 금속 홀더를 배치합니다. 트리스 완충액 (50 mM의 pH는 7.4) 또는 원하는 매체와이 홀더를 입력합니다. 그런 다음, 팁 홀더 아래 AFM 무대에 홀더를 배치합니다.
- 약 10 %의 절대 불확실성과 함께합니다 (AFM 소프트웨어에 포함 된) 열 변동 방법 (26)를 사용하여 10 ~ 30 PN / 나노 미터에 이르는 스프링 상수와 AFM의 캔틸레버를 보정합니다.
- 이 압축에 의해 기판과 접촉 할 때까지 기판에 아미노산 또는 펩티드 - 작용 팁에 근접하여 상호 작용하는 힘을 측정~ 200 PN의 힘과 즉시 ~ 200 nm의 거리를 0.1 ~ 0.8 μm의 / s의에서, 다양한 속도로 끝을 철회.
4. 데이터 분석
- 포토 다이오드 감도 (V / m)을 승산하고, 실험적으로 결정된 스프링 정수를 사용하여 (V)을 강제로 변위 값을 변환한다. (42)이 AFM 소프트웨어에 의해 자동으로 수행된다.
- 곡선의 단일 분자 이벤트, 기록 수백 (800-1,500)와 FD 곡선을 구하십시오. 단일 분자 곡선의 두 피크를 얻었다 : 첫 번째 피크는 팁과 표면과 표면 분자의 특이 적 상호 작용에 대한 두 번째 피크 사이의 대응 비특이적 상호 작용을 나타낸다. 상기 FD 곡선이 두 피크 이상을 함유하는 경우, 가장 가능한 힘의 계산에서 그들을 버린다.
참고 : 하나의 접착 이벤트가 (10에서 곡선의 30 %)을 고려됩니다. (43)
- 곡선의 단일 분자 이벤트, 기록 수백 (800-1,500)와 FD 곡선을 구하십시오. 단일 분자 곡선의 두 피크를 얻었다 : 첫 번째 피크는 팁과 표면과 표면 분자의 특이 적 상호 작용에 대한 두 번째 피크 사이의 대응 비특이적 상호 작용을 나타낸다. 상기 FD 곡선이 두 피크 이상을 함유하는 경우, 가장 가능한 힘의 계산에서 그들을 버린다.
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Representative Results
도 1은 선단부 수정 방법을 나타낸다. 첫 번째 단계에서, 플라즈마 처리는, 질화 실리콘 팁의 표면을 변화시킨다. 끝은 OH 그룹을 제공합니다. 이러한 그룹은 실란과 반응한다. 이 단계의 마지막에, 팁의 표면 자유 -NH 2 그룹에 포함된다. 이러한 유리 아민은 FMOC -PEG-NHS, 공유 링커와 반응 할 것이다. 페그 링커 FMOC 그룹 pipyridine, 탈 보호 시약을 제거한다. 마지막으로, 검토 된 아미노산 또는 펩티드 분자는 결합 시약 HBTU를 사용하여 PEG의 유리 아민 그룹을 통해 결합된다.
수정 된 AFM 팁과 표면 (도 2)와 아미노산 또는 펩티드의 상호 작용을 조사 할 수있다. 페그 분자는 끝에서 펩타이드 나 아미노산을 분리하고 자유롭게 동양에 있습니다. 전형적인 힘 measu포스 - 거리 곡선에서 별 개로 결과 (그림 3). 이 곡선은 표면으로부터 팁 단일 분자 접착 이벤트 분리 특징점을 갖는다. 첫 번째 피크가 특정 부착 이벤트 지칭 팁과 표면과 상기 제 2 피크 사이의 비특이적 인 상호 작용을 나타낸다. 수백 FD 곡선으로부터 그 힘에 비해 접착 이벤트의 수를 플롯하여 히스토그램을 구축하는 것이 가능하다. 이 히스토그램에 가우스 착용감을 적용하면 가장 가능성 힘 (MPF)를 결정합니다.
그림 1 : 팁 수정 절차. AFM 팁의 화학적 변형의 도식 표현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 실험 장치를 SMF에. 아미노산 또는 펩티드 및 원하는 표면 사이의 상호 작용을 측정하기위한 단일 분자 힘 분광법 설정의 개략도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 힘 - 거리 곡선. 이산화 티탄 표면으로부터 운모 표면, 및 (B) 아미노산 페닐알라닌에서 (A) 펩티드 Gln의 프로 - 알라 글리신 -Ser-빼앗아, 인수-티르 파열 전형적인 단일 분자 FD 곡선. cli를하시기 바랍니다이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 (CK).
그림 4 : 히스토그램은 가장 가능성 포스 (MPF)를 플롯과 그래프는 힘 대 음모 로딩 속도. 운모의 (B (3.1 ± 0.6 윈 / s (N = 7 8)의 로딩 속도) (A) 펩티드 Gln의 프로 - 알라 글리신 -Ser-빼앗아, 인수-티르의 파열 력 값의 전형적인 히스토그램 ) 이산화 티탄의 아미노산 페닐알라닌 (4.2 ± 0.7 윈 / s (로딩 속도에서 N = 79)). 가장 가능성 포스 (MPF) 값은 가우시안 피트 (검은 선)에 근거하여 계산 하였다. (C) 상기 펩티드 Gln의 프로 - 알라 글리신 -Ser-빼앗아, 인수-티르 및 (D) 아미노산 페닐알라닌 파단 부대 로딩 속도 의존성. 운동 파라미터는 겉보기로드 (R)의 대수 대 힘의 선형 플롯으로부터 외삽먹었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
프로토콜에서 1.3, 1.4 및 1.7의 광범위한 치료에 매우 부드러운 방식으로 수행되어야 단계. 단계 130에서, 팁 실란 혼합물 실란 화 과정이 불활성 대기 (수분이 없음)에서 수행되어야 접촉이어야한다. (45) 이것은 적층 형성을 방지하기 위하여 실란 분자가 쉽게 수분의 존재하에 가수 분해를 받아야하기 때문에 수행된다. (45)
단계 140에서, 온도 및 시간을 적절하게 유지되어야한다. 단계 1.5을 시작하기 전에, 팁은 실온으로 냉각한다; 그렇지 않으면이 손상됩니다. 결합 단계 (170)에서, HBTU 및 검사 아미노산 또는 펩티드 완전히 혼합물에 용해한다. 결합 후, 다른 용매와 팁을 세척하는 팁에 대한 손상을 방지하기 위해 매우 부드러운 방식으로 수행해야합니다.
보고 된 기술은 APPL 될 수 있습니다어떤 펩타이드 나 아미노산에 IED. 실리콘 팁을 수정하려면, 우리는 실란을 사용합니다. 이 변경 될 수 있습니다 일반적인 화학이다. 예를 들어, 하나의 팁을 수정하는 PEG 화 실란 중 두 가지 유형을 사용할 수있다. 팁은 금으로 제조되는 경우 23, 25, 26 후 티올 기의 선단부의 변형에 사용될 수있다. 대체 프로토콜 니트릴 로트리 아세테이트 (NTA)이 함께 재조합 히스티딘 표지 된 단백질, 히스티딘 타겟팅 할 링커를로 끝나는 이용한다. 최근 Lyubchenko 등. 합성을 설명하고 신규 중합체 링커 검사 SMFS 여러 실험에서의 응용을 나타내었다. 링커의 합성이 잘 발달 포스 (PA) 화학을 기반으로합니다. 이 화학 물질은 소정의 길이와 PA 조성 링커의 일상 합성을 할 수 있습니다. 이러한 링커는 길이가 균일하고 다양한 작용기로 종결 될 수있다.또한, 생체 분자는 황원자 골드 폼 공유 결합 네이티브 또는 설계 티올기를 통해 금 기재 또는 팁에 고정 될 수있다.
이 방법은 대량의 단일 분자 레벨에서의 표면으로부터 분자를 바인딩 해제되지하는데 필요한 힘의 양적 상세한 측정을 허용한다. 이 기술의 미래의 애플리케이션은 팁 부착 단백질의 새로운 복합 재료의 설계를 포함한다. 새로운 복합 재료 및 기능면의 설계 및 개발은 무기 물질과 단백질 또는 펩티드 사이의 상호 작용의 기본적인 이해를 얻는 이점 것이다. AFM과 SMFS 여기에서 제공하는 프로토콜은 단백질, 펩타이드 및 다른 표면과 아미노산 사이의 상호 작용을 연구하기위한 강력한 도구 역할을 할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicon nitride (Si3N4) AFM cantilevers with silicon tips | Bruker (Camarilo, CA, USA) | MSNL10, nominal cantilevers radius ~2 nm | |
| Methyltriethoxysilane | Acros Organics (New Jersey, USA) | For Silaylation of the AFM tip | |
| 3-(Aminopropyl) triethoxysilane | Sigma-Aldrich (Jerusalem, Israel) | For Silaylation of the AFM tip | |
| Triisopropylsilane | Sigma-Aldrich (Jerusalem, Israel) | Used for peptide deprotection | |
| N-Ethyldiisopropylamine | Alfa-Aesar (Lancashire, UK) | Used for tip modification | |
| Triethylamine | Alfa-Aesar (Lancashire, UK) | Used for tip modification | |
| Piperidine | Alfa-Aesar (Lancashire, UK) | Used for tip Fmoc deprotection | |
| Fluorenylmethyloxycarbonyl-PEG-N-hydroxysuccinimide (Fmoc-PEG-NHS) | Iris Biotech GmbH (Deutschland, Germany) | Used as the covalent flexible linker (MW = 5,000 Da) | |
| 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3,-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU) | Alfa Aser (Heysham, England) | Used as a coupling reagent. | |
| N-methyl-2-pyrrolidone (NMP) | Acros Organics (New Jersey, USA) | Used as Solvent in Tip modification procedure | |
| DMF (dimethylformamide) | Merck (Darmstadt, Germany) | Used as Solvent in Tip modification procedure | |
| Chloroform | Bio-Lab (Jerusalem, Israel) | Used as Solvent in Tip modification procedure | |
| Ethanol (Anhydrous) | Gadot (Netanya, Israel) | Used as Solvent in Tip modification procedure | |
| Trifluoro acetic acid (TFA) | Merck (Darmstadt, Germany) | ||
| Acetic anhydride | Merck (Darmstadt, Germany) | ||
| Peptides | GL Biochem (Shanghai, China). | ||
| Phenylalanine and Tyrosine | Biochem (Darmstadt, Germany) | ||
| 30% TiO2 dispersion in the mixture of solvent 2-(2-Methoxyethoxy) ethanol (DEGME) and Ethyl 3-Ethoxypropionate (EEP) | Applied Vision Laboratories (Jerusalem, Israel) | (30%) in the mixture of solvent 2-(2 Methoxyethoxy) ethanol (DEGME) and Ethyl 3-Ethoxypropionate (EEP). Used for TiO2 substrate preparation | |
| Mica substrates | TED PELLA, INC. (Redding, California, USA) | 9.9 mm diameter |
References
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