Här presenterar vi ett protokoll för att mäta kraften för interaktioner mellan en väldefinierad oorganisk yta och antingen peptider eller aminosyror genom en enda molekyl kraft spektroskopimätningar med hjälp av ett atomkraftsmikroskop (AFM). Den information som erhålls från mätningen är viktigt att bättre förstå den peptid-oorganiskt material interfasen.
Interaktionen mellan proteiner eller peptider och oorganiska material leda till flera intressanta processer. Till exempel kombinera proteiner med mineraler leder till bildningen av kompositmaterial med unika egenskaper. Dessutom är den icke önskvärda processen för biobeväxning initieras genom adsorption av biomolekyler, främst proteiner, på ytor. Detta organiska skikt är ett vidhäftningsskikt för bakterier och ger dem möjlighet att interagera med ytan. Att förstå de fundamentala krafter som styr samspelet på organiska-oorganiska gränssnitt är därför viktigt för många forskningsområden och kan leda till design av nya material för optiska, mekaniska och biomedicinska tillämpningar. Detta papper uppvisar en enda molekyl force spektroskopi teknik som utnyttjar en AFM för att mäta vidhäftningskraften mellan antingen peptider eller aminosyror och väldefinierade oorganiska ytor. Denna teknik inbegriper ett protokoll för att fästa biomolekylen till AFMtippa genom en kovalent flexibel linker och enda molekyl kraft spektroskopimätningar av atomkraftsmikroskop. Dessutom är en analys av dessa mätningar ingår.
Samspelet mellan proteiner och oorganiska mineraler leder till byggandet av kompositmaterial med särskiljande egenskaper. Detta inkluderar material med hög mekanisk hållfasthet eller unika optiska egenskaper. 1, 2 exempelvis kombinationen av proteinet kollagen med mineral hydroxiapatit genererar antingen mjuka eller hårda ben för olika funktionaliteter. 3 Korta peptider kan också binda oorganiska material med hög specificitet. 4, har fem, sex Specificiteten av dessa peptider använts för att utforma nya magnetiska och elektroniska material, 7, 8, 9 tillverka nanostrukturerade material, växande kristaller, 10 och syntetisera nanopartiklar. 11 förstå mekanismen bakom växelverkan mellan peptider eller proteiner och oorganiska material kommer därför att göra det möjligt för oss att utforma nya kompositmaterial med förbättrade adsorptiva egenskaper. Dessutom, eftersom mellanfasen av implantat med ett immunsvar medieras av proteiner, bättre förstå de interaktioner mellan proteiner med oorganiska material kommer att förbättra vår förmåga att utforma implantat. Ett annat viktigt område som involverar proteiner interagerar med oorganiska ytor är tillverkningen av båtbotten material. 12, 13, 14, är 15 Biofouling en oönskad process där organismer fästa på en yta. Det har många skadliga konsekvenser för våra liv. Till exempel, påväxt av bakterier på medicintekniska produkter leder till sjukhusförvärvade infektioner. Biologisk påväxt av marina organismer på båtar och stora fartyg ökar förbrukning av bränsle. 12, 16, 17, 18
Enda molekyl force spektroskopi (SMF), med användning av en AFM, kan direkt mäta interaktioner mellan en aminosyra eller en peptid med ett substrat. 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 Andra metoder såsom fagdisplay, 27, 28 kvartskristallmikrovåg (QCM) 29 eller ytplasmonresonans (SPR) 29, 30, 31, 32,ref "> 33 åtgärd växelverkan av peptider och proteiner till oorganiska ytor i bulk. 34, 35, 36 Detta betyder att de resultat som erhållits med dessa metoder avser ensembler av molekyler eller aggregat. I SMF, är ett eller mycket få molekyler fäst AFM spets och deras interaktioner med det önskade substratet mäts. kan utökas detta tillvägagångssätt för att studera proteinveckning genom att dra i proteinet från ytan. Dessutom kan den användas för att mäta interaktioner mellan celler och proteiner och bindningen av antikroppar till deras ligander. 37, 38, 39, 40 Detta dokument beskriver i detalj hur man bifoga antingen peptider eller aminosyror till AFM spets med hjälp av silanol kemi. Dessutom förklarar papper hur man utför kraftmätningar och hur man analyserarresultat.
Steg 1,3, 1,4 och 1,7 i protokollet bör utföras med stor omsorg och i ett mycket skonsamt sätt. I steg 1,3, bör spetsen inte vara i kontakt med silanblandningen och silaniseringen processen bör utföras i en inert atmosfär (fuktfri). 45 Detta görs för att förhindra flerskiktsbildning och eftersom silanmolekyler undergår lätt hydrolys i närvaro av fukt. 45
I steg 1,4, bör temperaturen och tiden hållas korrekt. Före start steg 1,5,…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Marie Curie International Reintegration Grant (EP7). P. D. acknowledges the support of the Israel Council for Higher Education.
Silicon nitride (Si3N4) AFM cantilevers with silicon tips | Bruker (Camarilo, CA, USA) | MSNL10, nominal cantilevers radius ~2 nm | |
Methyltriethoxysilane | Acros Organics (New Jersey, USA) | For Silaylation of the AFM tip | |
3-(Aminopropyl) triethoxysilane | Sigma-Aldrich (Jerusalem, Israel) | Used for tip modification | |
Triisopropylsilane | Sigma-Aldrich (Jerusalem, Israel) | Used for tip modification | |
N-Ethyldiisopropylamine | Alfa-Aesar (Lancashire, UK) | Used for tip modification | |
Triethylamine | Alfa-Aesar (Lancashire, UK) | Used for tip modification | |
Piperidine | Alfa-Aesar (Lancashire, UK) | Used for tip modification | |
Fluorenylmethyloxycarbonyl-PEG-N-hydroxysuccinimide (Fmoc-PEG-NHS) | Iris Biotech GmbH (Deutschland, Germany) | Used as the covalent flexible linker (MW = 5000 Da) | |
2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3,-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU) | Alfa Aser (Heysham, England) | Used as a coupling reagent. | |
N-methyl-2-pyrrolidone (NMP) | Acros Organics (New Jersey, USA) | Used as Solvent in Tip modification procedure | |
DMF (dimethylformamide) | Merck (Darmstadt, Germany) | Used as Solvent in Tip modification procedure | |
Trifluoro acetic acid (TFA) | Merck (Darmstadt, Germany) | ||
Acetic anhydride | Merck (Darmstadt, Germany) | ||
Peptides | GL Biochem (Shanghai, China). | ||
Phenylalanine and Tyrosine | Biochem (Darmstadt, Germany) | ||
30% TiO2 dispersion in the mixture of solvent 2-(2-Methoxyethoxy) ethanol (DEGME) and Ethyl 3-Ethoxypropionate (EEP) | Applied Vision Laboratories (Jerusalem, Israel) | (30%) in the mixture of solvent 2-(2 Methoxyethoxy) ethanol (DEGME) and Ethyl 3-Ethoxypropionate (EEP) | |
Mica substrates | TED PELLA, INC. (Redding, California, USA) | 9.9 mm diameter |