We present a protocol to dissect and culture embryonic day 15 (E15) murine metatarsal bones. This highly physiological ex vivo model of endochondral ossification provides conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture and is a vital tool for investigating bone growth and development.
The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or longitudinal bone growth. As such, it is imperative that we further our understanding of the underpinning molecular mechanisms involved in such disorders so as to provide advances towards human and animal patient benefit. The mouse metatarsal organ explant culture is a highly physiological ex vivo model for studying endochondral ossification and bone growth as the growth rate of the bones in culture mimic that observed in vivo. Uniquely, the metatarsal organ culture allows the examination of chondrocytes in different phases of chondrogenesis and maintains cell-cell and cell-matrix interactions, therefore providing conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture. This protocol describes in detail the intricate dissection of embryonic metatarsals from the hind limb of E15 murine embryos and the subsequent analyses that can be performed in order to examine endochondral ossification and longitudinal bone growth.
Скелет является весьма запутанным, динамичный и сложный орган, который имеет целый ряд функций, охватывающих от локомоции, ионного гомеостаза. Состоящий из кости и хряща, скелет состоит из популяций функционально различных клеток , которые работают для поддержания его структурных, биохимических и механической целостности 1. Одной из главных функций скелета является его роль в развитии и росте. Эти процессы требуют гармоническое сочетание нескольких клеточных популяций, которые регулируются за счет тесной эндокринных и генетического контроля.
За исключением плоских костях , например , лопаткой, черепа и грудины, скелет млекопитающего формируется посредством процесса , известного как эндохондральной окостенения. Этот процесс, как регулируется и пространственно молекулярно, начинается с конденсации мезенхимальных клеток , полученных в основном из мезодермы 2. Под влиянием фактора SOX9 транскрипции, клетки в те интерьер сгущений дифференцируются в хондроциты, выражающие и секретирующих хрящевых специфические внеклеточного матрикса (ЕСМ) компоненты, такие как тип II коллагена и аггрекан. Клетки на краю конденсации, выразить тип I коллагена и образуют надхрящница, разграничивая проспективное кости 3. Позже osteoprogenitors из надхрящница дифференцируются в остеобласты, направленный экспрессии факторов транскрипции, Runx2 и Osterix 4. Это приводит к преобладанию остеобластов и этот слой переименован в надкостницу, который образует минерализованную костистую воротник вокруг средней части кости. Сосудистый проникновение надкостницы и вторжения в хрящевой эшафот происходит в результате чего с ним, haematopoetically полученные резорбции костей клетки, остеокласты, которые резорбции хондроцит остатки и большую часть хрящевой матрицы 5. Пространства, образованные заполнены osteoprogenitors, приводящих к первичной оссификациицентр, который постепенно занимает ядро диафиза и сливается с надкостницей. Другие клетки дают начало костного мозга. Вокруг рождения, кровеносные сосуды и osteoprogenitors проникают в хрящевую богатую матрицу с обеих сторон (эпифиза) развивающегося диафизе с образованием вторичного окостенения центра. Расположенный между эпифизом и диафиза на обоих концах длинных костей является полоса хряща – пластинка роста эпифиза – который отвечает за координацию линейный рост всех длинных костей 6.
Chondrocytes внутри пластины роста первоначально пролиферируют и в дальнейшем прогрессировать через морфологически различных зон, согласованных путем последовательного экспрессии транскрипции и факторов роста. Кульминацией этой последовательности событий является выход из клеточного цикла и гипертрофии хондроцитов в центре этого предшественника хрящей. Гипертрофические хондроциты сильно выражают коллагена Х типа и матрицы металлопротеиназы-13 (ММР13) и их значительное увеличение объема в направлении продольного роста обеспечивает наибольший вклад в рост костей у млекопитающих 7,8. Кроме того, гипертрофические хондроциты минерализуют окружающую их ECM через выпуск матричных везикул, мембранные ограниченные структуры специализированные для производства аморфного фосфата кальция путем их включения фосфатаз (ткань неспецифический щелочной фосфатазы (TNAP) и PHOSPHO1) и кальция направления белков (аннексины ) 9-11. Этот кальцинированная хрящ захвачена кровеносных сосудов из основного мозга, что приводит к наборе остеокластов и резорбции матрицы. За этим следует миграции остеобластов и выравнивания на поверхности кальцинированных хрящей остатков, где они сложили слой остеоидом который быстро минерализованной. Тканый кости первичной губчатой позже перестроенный в пластинчатой кости вторичной губчатой 12. Эпифизарной результаты синтеза впрекращение эндохондральной окостенения 13.
Эндохондральный окостенение находится под жестким регулированием со стороны многих эндокринных и паракриновых гормонов и факторов роста , с тем чтобы предотвратить нарушенное развитие и / или рост 14 продольной кости. Более глубокое понимание молекулярных и клеточных механизмов, лежащих в основе этих процессов Поэтому крайне важно в нашем стремлении клинические достижения по отношению к человеческой выгоде. Предыдущее исследование сходства и различия между ростом пластин разных возрастов, мест и видов значительно улучшили наше понимание физиологических механизмов , окружающих динамику 15,16 пластины роста. Тем не менее, изучение изолированных хондроцитов трудно, так как удаление хондроцитов из их среды может привести к дифференцировке, сопровождается потерей экспрессии ключевых маркеров , таких как Col2a1 17.
Мышь плюсневой орган эксплант, пиoneered профессором Элизабет Бергер и его коллеги в Нидерландах, является весьма физиологическая ех естественных условиях модель для изучения Эндохондральный окостенение и рост кости , как темпы роста костей в культуре имитируют , что видели в естественных условиях 18. Уникально, плюсневой органной культуры позволяет исследовать хондроцитов в различных фазах хондрогенезе и поддерживает клетка-клетка и клетка-матрица взаимодействий, тем самым обеспечивая условия ближе к ситуации в естественных условиях , чем клетки в культуре 19-21. Кроме того, эта модель позволяет для прямого изучения линейного роста костей, которое не возможно в первичных культурах хондроцитов. Она также позволяет для разделения системных и локальных факторов, допускающее поэтому конкретный анализ локальных эффектов на пластине роста.
Культура плюсны позволяет исследовать многочисленных параметров. Ежедневные измерения общей длины и минерализованных областейзачатки могут быть выполнены с помощью стандартного фазово-контрастной микроскопии и программного обеспечения для анализа изображений. Гистологическое, гибридизация и иммуногистохимического окрашивания в легко могут быть выполнены на участках плюсневых, что позволяет для пространственного разрешения обоих клеточных и молекулярных образований, главным преимуществом по сравнению с традиционными методами культивирования клеток. Иммуногистохимический подход включает в себя обнаружение и количественное определение 5-бром-2'-дезоксиуридина (BrdU) поглощение пролиферирующих хондроцитов 22. Кроме того, дальнейшая обработка плюсневых тканей могут быть выполнены, чтобы позволить вниз по течению анализа экспрессии мРНК (RT-КПЦР), белков и внутриклеточной передачи сигналов (анализ Вестерн-блоттинга) или липидный состав (масс-спектрометрия). Большинство исследований на сегодняшний день использовать культивируемые эмбриональные плюсны, а не плюсны от послеродовых животных. Хотя обе модели могут быть информативными, исследование эмбриональных костей имеет ряд преимуществ: они растут быстрее и может быть EXPLOITED для изучения инициации и прогрессирования процесса минерализация 23-25.
Этот протокол подробно описывает сложную рассечение эмбриональных плюсны от задней конечности эмбриональный день 15 (E15) мышиных эмбрионов. Кроме того, рост и минерализацию анатомически различных плюсневые показан.
Культура мышиных эмбриональных плюсневые обеспечивает высокую физиологическую модель эндохондральной роста и минерализации. Ранние исследования подтверждено, что E15 Плюсневые мыши пройти нормальную структуру скелета роста и дифференцировки. Хрящ (хондроциты) и кости (остеобластов и остеокластов) клетки и их соответствующие коллагеновые матрицы не отличаются от наблюдаемых в естественных условиях. Тем не менее, существуют некоторые известные ограничения этой модели. Скорость остеокластов дифференциации нарушается как рост кости (но не хрящей дифференциации). Рост костей примерно на 50% медленнее , чем это наблюдалось в естественных условиях , и может быть из – за недостатков в системных факторов , которые влияют на выработку местных факторов (например, ИФР-1, КМБ и т.д.) 31. Кроме того, оно хорошо известно, что кость чувствительна к его механической среды, и это также относится к культивируемых плюсны, которые реагируют на Changes в механической нагрузке 32,33. Таким образом, в ненагруженных условиях, как описано в данном протоколе, минерализации и минеральных резорбции может быть поставлена под угрозу. Тем не менее, модель плюсневой дает возможность непосредственно измерить линейный рост костей , что невозможно с помощью 2D и 3D в лабораторных системах культивирования.
Мы обеспечили полное описание протокола , участвующего в рассечение и культуре E15 мышиных плюсны и действительно, в первый раз, подтверждают обоснованность объединения 2 – й, 3 – й и 4 – й плюсневых костей для экспериментов.
Плюсны от E17 / E18, как правило , используются для изучения механизмов роста костей в связи с их огромным потенциалом роста ех естественных условиях в течение длительного периода времени (т.е. за 14 дней в культуре). Они хорошо создана модель для исследования роли факторов роста на эмбриональном продольной кости роста.Кроме того, рассечение и культура послеродовых плюсны обычно используется , чтобы очертить механизмы , окружающие послеродовую роста костей , как следует понимать , что послеродовые рост костей плода и рост костей регулируются по- разному 21. Рост костей наблюдается в культивированных послеродовых плюсны, однако значительно меньше , чем это наблюдалось в эмбриональных зачатков 25,34, что ограничивает их потенциал в длительных исследований и выделяя более системное воздействие на рост костей на этой стадии постнатального. В самом деле, 3 – дневных постнатальных плюсневые кости от мышей , как правило , последний этап , который может быть использован для получения измеримой 34 роста.
Здесь мы описываем наш протокол для выделения эмбриональных плюсневых костей на E15. Отсутствие hydroxyapaptite минерала в плюсневых костей E15 означает, что они обеспечивают непревзойденную модель для исследования не только механизмы, окружающие продольный рост костей, но и инициацииминерализации скелета. Минерализованные матрица терминала гипертрофической зоны хондроцитов обеспечивает эшафот для вторжения в остеобласты сложить кости специфические матрицы (остеоида) , который затем минерализуется, и в этом качестве этой начальной минерализации имеет жизненно важное значение для формирования успешной и функциональной кости 35. Действительно, ряд недавних отчетов с использованием E15 плюсны подтвердили свою уникальную способность к исследованию процесса минерализации 28,36,37. Кроме того, исследователи описали использование E15 плюсны в качестве модели ангиогенеза 38, подчеркивает потенциал эмбриональных плюсны как модель за пределами установки костного роста / минерализацией.
Протокол мы описываем требует только стандартного лабораторного оборудования , включая ламинаре, рассекает микроскоп для выполнения рассечение, и инкубатор СО 2 для культуры отсеченных зачатков. Кроме того, очень простой кульратура среды , содержащей αMEM, бычий сывороточный альбумин, антибиотики, антимикотики и L-аскорбиновую кислоту (кофактором в синтезе гидроксипролина и гидроксилизила, две незаменимые аминокислоты для производства коллагена 39) позволяет избежать использования неопределенных добавок, таких как сывороток животных , Традиционно, исследователи добавили βGP к средствам массовой информации, используемых для культивирования эмбриональных плюсны, но, как показали наши результаты, использование дополнительного источника фосфата не требуется для успешной минерализации в этой системе культуры. Это важное открытие в нашем стремлении к пониманию механизмов, лежащих в основе ЕСМ минерализацию.
Плюсны ранее были инфицированы аденовирусов , содержащих доминантно-негативной формы Smad2 , чтобы исследовать роль трансформирующий фактор роста & beta ; в регуляции развития длинных костей 40. Здесь мы также показывают успешное трансфекции дикого типа костей Е15 плюсневых с вирусом GFP частиц, что указывает на тметоды шляпы лентивирусов может быть легко принят, чтобы манипулировать экспрессии генов в плюсневых культурах. Аналогичным образом, система плюсневой культуры орган является отличной моделью, в которой для сравнения рост костей у генетически измененных мышей, чтобы лучше понять роль конкретного гена в процессе роста кости. Наши предыдущие исследования использовали систему органной культуры плюсневой, чтобы определить роль супрессора цитокин сигнализации-2 (SOCS2) в эндохондральной роста костей. Использование плюсневой кости от мышей , дефицитных по SOCS2, мы показали , что гормон роста способен имитировать их продольное независимо роста инсулиноподобного фактора роста (IGF-1), в отличие от плюсневых костей дикого типа , которые не поддаются лечению гормона роста 34, 41. Это подчеркивает, в какой степени плюсневых культуры можно манипулировать для изучения влияния различных генов и / или экзогенных факторов на эндохондральной роста костей.
Таким образом, мы имеем Detaiпривел к способу успешного извлечения и культуры эмбриональных плюсневых костей, которые можно манипулировать и исследовали с использованием различных анализов. Эта бывшая модель поддерживает естественных условиях клетка-клетка и клетка-матрица взаимодействий, а также содержит хондроцитов в различных фазах хондрогенезе, тем самым обеспечивая более физиологическому модель , чем клетки в монослое или 3D культуры. Поэтому плюсневой культуры органов представляют собой уникальную модель для исследования молекулярных механизмов, ответственных за эндохондральной окостенения, и имеют важное значение для более глубокого понимания как костной физиологии и патофизиологии
The authors have nothing to disclose.
We are grateful to the Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) for funding DH (BB/J01446X/1), CF & VEM (Institute Strategic Programme Grant Funding BB/J004316/1). We also acknowledge Arthritis Research UK for funding to KAS (20413). We thank Miss Elaine Seawright for her assistance with the experiments detailed, Dr. Neil Mackenzie for his assistance with the lentiviral techniques, and Mr Darren Smith and Mr Alex Robertson (Roslin Institute BRF) for their assistance with the animal studies.
Dissection scissors | World Precision Instruments | 14393 | Autoclave sterilise before use |
Dumont #5 tweezers | World Precision Instruments | 500342 | Autoclave sterilise before use |
Dumont #4 tweezers | World Precision Instruments | 500339 | Autoclave sterilise before use |
SuperFine Vannas scissors | World Precision Instruments | 501778 | |
Absolute ethanol | Fisher Scientific | E/0650DF/17 | Dilute to 70% v/v in dH2O |
α-MEM without nucleosides | Thermo Fischer Scientific | 22561021 | |
Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A3059 | |
Syringe filters (0.22μm) 33mm diameter | Merck Millipore | SLGP033RS | |
Phosphocholine chloride calcium salt tetrahydrate | Sigma Aldrich | P0378 | Add directly to the media prior to experimentation |
L-ascorbic acid-2-phosphate | Sigma Aldrich | A8960 | Make up stock soution at 5mg/ml and aliquot at -20°C |
Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C5080 | Make up stock soution at 150mM and aliquot at -20°C |
β-glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma Aldrich | G9422 | Make up stock soution at 1mM and aliquot at -20°C |
Gentamicin | Thermo Fischer Scientific | 15710049 | |
Amphotericin B | Thermo Fischer Scientific | 15290018 | |
Nunc cell-culture treated 24-well plates | Thermo Fischer Scientific | 142475 | |
Polybrene | Sigma Aldrich | H9268 | |
DAPI | Thermo Fischer Scientific | D3571 |