We present a protocol to dissect and culture embryonic day 15 (E15) murine metatarsal bones. This highly physiological ex vivo model of endochondral ossification provides conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture and is a vital tool for investigating bone growth and development.
The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or longitudinal bone growth. As such, it is imperative that we further our understanding of the underpinning molecular mechanisms involved in such disorders so as to provide advances towards human and animal patient benefit. The mouse metatarsal organ explant culture is a highly physiological ex vivo model for studying endochondral ossification and bone growth as the growth rate of the bones in culture mimic that observed in vivo. Uniquely, the metatarsal organ culture allows the examination of chondrocytes in different phases of chondrogenesis and maintains cell-cell and cell-matrix interactions, therefore providing conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture. This protocol describes in detail the intricate dissection of embryonic metatarsals from the hind limb of E15 murine embryos and the subsequent analyses that can be performed in order to examine endochondral ossification and longitudinal bone growth.
El esqueleto es un órgano muy complejo, dinámico y complejo que tiene una serie de funciones que van desde la locomoción, a la homeostasis de iones. Compuesto de hueso y cartílago, el esqueleto consta de las poblaciones de células funcionalmente distintas que funcionan para mantener su integridad estructural, bioquímica y mecánica 1. Una de las funciones primarias del esqueleto es su papel en el desarrollo y el crecimiento. Estos procesos requieren la orquestación de múltiples poblaciones celulares que son reguladas a través endocrina apretado y control genético.
Con la excepción de los huesos planos por ejemplo, escápula, cráneo y el esternón, el esqueleto de los mamíferos se forma a través del proceso conocido como osificación endocondral. Este proceso, regulado tanto molecularmente y espacialmente, comienza con la condensación de células mesenquimáticas derivadas principalmente del mesodermo 2. Bajo la influencia del factor de transcripción SOX9, las células en THe interior de las condensaciones se diferencian en condrocitos, expresar y secretar componentes específicos de cartílago de la matriz extracelular (ECM) tales como colágeno de tipo II y agrecano. Las células en el margen de la condensación, expresan colágeno tipo I y la forma del pericondrio, delineando el hueso prospectivo 3. Más tarde, los osteoprogenitors del pericondrio se diferencian en osteoblastos, dirigida por la expresión de los factores de transcripción, y Runx2 osterix 4. Esto conduce a un predominio de los osteoblastos y esta capa se cambia el nombre del periostio que forma un collar óseo mineralizado alrededor de la mitad de la sección del hueso. Penetración vascular del periostio y la invasión del andamio cartilaginosa se produce trayendo consigo, haematopoetically derivado células óseas resorción, osteoclastos, que reabsorben los restos de condrocitos y gran parte de la matriz cartilaginosa 5. Los espacios formados son ocupados por osteoprogenitors que dan lugar a la osificación primariacentro que ocupa progresivamente el núcleo de la diáfisis y se fusiona con el periostio. Otras células dan lugar a la médula ósea. Alrededor del nacimiento, los vasos sanguíneos y osteoprogenitors penetran en la matriz rica en cartílago en cada lado (epífisis) de la diáfisis en desarrollo para formar el centro de osificación secundario. Situado entre la epífisis y la diáfisis en los extremos de los huesos largos es una banda de cartílago – la placa de crecimiento epifisaria – que es la responsable de coordinar el crecimiento lineal de todos los huesos largos 6.
Los condrocitos en el cartílago de crecimiento inicialmente proliferan y posteriormente progresan a través de zonas morfológicamente distintas, coordinados por la expresión secuencial de transcripción y factores de crecimiento. La culminación de esta secuencia de eventos es la salida del ciclo celular y la hipertrofia de los condrocitos en el centro de este precursor cartílago. condrocitos hipertróficos expresan fuertemente colágeno tipo X y metaloproteinasas de la matriz-13 (MMP13) y su considerable volumen de la ampliación en la dirección del crecimiento longitudinal proporciona la mayor contribución al crecimiento óseo en mamíferos 7,8. Además, los condrocitos hipertróficos mineralizan su ECM circundante a través de la liberación de vesículas de matriz, estructuras de membrana delimitada especializados para la producción de fosfato de calcio amorfo a través de su inclusión de fosfatasas (tejido no específica de la fosfatasa alcalina (TNAP) y PHOSPHO1) y calcio canalización de proteínas (anexinas ) 9-11. Este cartílago calcificado es invadido por vasos sanguíneos de la médula ósea subyacente que resulta en el reclutamiento de los osteoclastos y la resorción de la matriz. Esto es seguido por la migración de osteoblastos y la alineación a la superficie de los restos de cartílago calcificadas en la que establecen una capa de osteoide, que es rápidamente mineralizado. El hueso reticular de la sustancia esponjosa primaria es posteriormente remodelado para hueso laminar de la esponjosa secundaria 12. resultados de fusión epifisarias en elcese de la osificación endocondral 13.
Osificación endocondral está bajo una regulación estricta por muchas hormonas endocrinas y paracrinas y factores de crecimiento con el fin de prevenir el desarrollo perturbado y / o el crecimiento del hueso longitudinal 14. Una mejor comprensión de los mecanismos moleculares y celulares que sustentan estos procesos tanto, es imperativo en nuestra búsqueda de avances clínicos hacia el beneficio humano. Las investigaciones previas sobre las similitudes y diferencias entre las placas de crecimiento de diferentes edades, lugares y especies han mejorado en gran medida nuestra comprensión de los mecanismos fisiológicos que rodean la dinámica de la placa de crecimiento 15,16. Sin embargo, el estudio de los condrocitos aislados es difícil, ya que la eliminación de los condrocitos de su medio ambiente puede conducir a la desdiferenciación, acompañado de pérdida de la expresión de marcadores clave como Col2a1 17.
El metatarsiano ratón cultivo de explantes de órganos, pioneered por el Prof. Elisabeth hamburguesa y sus colegas en los Países Bajos, es un modelo muy fisiológica ex vivo para el estudio de la osificación endocondral y el crecimiento óseo como la tasa de crecimiento de los huesos en la cultura imitan a la observada in vivo 18. Excepcionalmente, el cultivo de órganos metatarsiano permite el examen de los condrocitos en diferentes fases de la condrogénesis y mantiene célula-célula y las interacciones célula-matriz, por lo tanto, proporcionar condiciones más cerca de la situación in vivo que las células en cultivo de 19-21. Además, este modelo permite el examen directo del crecimiento óseo lineal que no es posible en cultivos de condrocitos primarios. También permite la separación de los factores sistémicos y locales, por tanto, que permiten el análisis específico de los efectos locales en la placa de crecimiento.
La cultura de los metatarsianos permite la investigación de numerosos parámetros. Las mediciones diarias de longitud total y de las regiones mineralizadas delos rudimentos se pueden realizar con microscopía de contraste de fase estándar y software de análisis de imágenes. Histológico, hibridación in situ y tinción inmunohistoquímico se puede realizar fácilmente en las secciones de los metatarsianos, lo que permite la resolución espacial de las dos entidades moleculares y celulares, una importante ventaja sobre los métodos tradicionales de cultivo de células. El enfoque inmunohistoquímica incluye la detección y cuantificación de 5-bromo-2'-desoxiuridina captación (BrdU) por la proliferación de condrocitos 22. Además, el tratamiento posterior de los tejidos de los metatarsianos se puede realizar para permitir el análisis aguas abajo de la expresión de ARNm (RT-qPCR), proteína y análisis intracelular de señalización (transferencia Western) o la composición de lípidos (espectrometría de masas). La mayoría de los estudios hasta la fecha utilizan metatarsianos embrionarias cultivadas en lugar de los metatarsos de animales después de nacer. Mientras que ambos modelos pueden ser de carácter informativo, el estudio de los huesos embrionarios tiene varias ventajas: crecen más rápido y puede ser ExploITED para estudiar el inicio y la progresión de la 23 a 25 proceso de mineralización.
Este protocolo describe en detalle la intrincada disección de metatarsianos embrionarias a partir de la extremidad posterior de día embrionario 15 (E15) embriones murinos. Además, se muestra el crecimiento y la mineralización de los huesos metatarsianos anatómicamente distintos.
La cultura de los metatarsos de embriones murinos proporciona un modelo altamente fisiológica del crecimiento endocondral y la mineralización. Los primeros estudios han validado que E15 metatarsianos ratón se someten a un patrón normal de crecimiento del esqueleto y la diferenciación. El cartílago (condrocitos) y hueso (osteoblastos y osteoclastos) y las células de sus respectivas matrices de colágeno son indistinguibles de los observados in vivo. Sin embargo, hay algunas limitaciones reconocidas de este modelo. La velocidad de diferenciación de los osteoclastos se deteriora como es el crecimiento del hueso (pero no cartílago diferenciación). El crecimiento óseo es aproximadamente 50% más lento que el observado in vivo y puede ser debido a las deficiencias en los factores sistémicos que influyen en la producción de factores locales (por ejemplo, IGF-1, BMP, etc.) 31. Además, es bien reconocido que el hueso es sensible a su entorno mecánico y esto es también el caso de los metatarsianos cultivadas, que responden a cambios en 32,33 carga mecánica. Por lo tanto, en situaciones sin carga, tal como se describe en este protocolo, la mineralización y la resorción de minerales puede verse comprometida. Sin embargo, el modelo metatarsiano ofrece la posibilidad de medir directamente el crecimiento óseo lineal que no es posible a través de 2D y 3D en los sistemas de cultivo in vitro.
Hemos proporcionado una descripción completa del protocolo involucrado en la disección y la cultura de E15 metatarsianos murinos y, de hecho, por primera vez, confirmar la validez de la combinación de los 2 °, 3 ° y 4 ° metatarsianos para los experimentos.
Metatarsianos de E17 / E18 se utilizan comúnmente para investigar los mecanismos de crecimiento de los huesos debido a su extraordinario potencial para crecer ex vivo durante largos períodos de tiempo (es decir, más allá de 14 días en cultivo). Ellos son un modelo bien establecido para investigar el papel de los factores de crecimiento en el crecimiento longitudinal del hueso embrionario.Además, la disección y la cultura de los metatarsianos postnatales se emplea comúnmente para delinear los mecanismos que rodean el crecimiento óseo postnatal como se entiende que el crecimiento óseo y el crecimiento óseo postnatal fetal se regulan de manera diferente 21. Sin embargo, el crecimiento de los huesos metatarsianos observado en postnatales cultivadas es significativamente menor que la observada en rudimentos embrionarias 25,34, lo que limita su potencial en estudios a largo plazo y resaltando la influencia más sistémico sobre el crecimiento óseo en esta etapa postnatal. De hecho, 3 días de edad postnatal de ratones metatarsianos son típicamente la etapa más reciente que se puede utilizar para obtener 34 crecimiento medible.
Aquí describimos nuestro protocolo para el aislamiento de huesos metatarsianos embrionarias en E15. La ausencia de mineral hydroxyapaptite en huesos metatarsianos E15 significa que proporcionan un modelo sin igual a investigar no sólo los mecanismos que rodean crecimiento longitudinal del hueso, sino también el iniciode la mineralización esquelética. La matriz mineralizada de la zona de condrocitos hipertrófica terminal proporciona un andamiaje para la invasión de los osteoblastos para establecer un hueso matriz específica (osteoide), que es posteriormente mineralizada, y como tal esta mineralización inicial es de vital importancia para la formación ósea exitoso y funcional 35. De hecho, un número de informes recientes que utilizan metatarsianos E15 han confirmado su capacidad única para la investigación del proceso de mineralización 28,36,37. Además, los investigadores han descrito el uso de los metatarsianos E15 como modelo de angiogénesis 38, destacando el potencial de los metatarsianos embrionarias como modelo fuera del entorno de crecimiento óseo / mineralización.
El protocolo se describe sólo requiere equipos de laboratorio estándar, incluyendo una campana de flujo laminar, un microscopio de disección para realizar la disección y una incubadora de CO 2 para el cultivo de rudimentos extirpados. Por otra parte, una calle muy básicotura que contiene medio aMEM, BSA, antibióticos, antimicóticos y ácido L-ascórbico (un cofactor en la síntesis de hidroxiprolina e hidroxilisina, dos aminoácidos esenciales para la producción de colágeno 39) evita el uso de aditivos no definidos, tales como sueros animales . Tradicionalmente, los investigadores han añadido βGP a los medios empleados para el cultivo de embriones metatarsianos, pero como se revela en nuestros resultados, no se requiere el uso de una fuente de fosfato adicional para la mineralización éxito en este sistema de cultivo. Este es un hallazgo importante en nuestra búsqueda de la comprensión de los mecanismos que sustentan la mineralización ECM.
Metatarsianos previamente han sido infectados con adenovirus que contienen formas dominantes negativos de Smad2 para explorar el papel del factor de crecimiento transformante β en la regulación del desarrollo de los huesos largos 40. Aquí también revelamos la transfección exitosa de tipo salvaje huesos metatarsianos E15 con partículas de virus GFP, lo que indica ttécnicas de sombrero de lentivirus podían fácilmente ser adaptada para manipular la expresión génica en las culturas de los metatarsianos. Del mismo modo, el sistema de cultivo de órganos metatarsiano es un excelente modelo en el que comparar el crecimiento de los huesos de ratones genéticamente alterados para entender mejor el papel de un gen particular en el proceso de crecimiento del hueso. Nuestros estudios previos han utilizado el sistema de cultivo de órganos metatarsiano para determinar el papel de supresor de la señalización de citoquinas-2 (Socs2) en el crecimiento de hueso endocondral. El uso de los huesos metatarsianos de los ratones deficientes en Socs2, hemos demostrado que la hormona de crecimiento es capaz de simular su longitudinal crecimiento independiente de la insulina como factor de crecimiento (IGF-1), a diferencia de los huesos metatarsianos de tipo salvaje que no responden al crecimiento tratamiento hormonal 34, 41. Esto pone de relieve la medida en que los cultivos de los metatarsianos pueden ser manipulados para examinar los efectos de diferentes genes y / o factores exógenos en el crecimiento de hueso endocondral.
En resumen, tenemos detaiconducido un método para la extracción exitosa y la cultura de huesos metatarsianos embrionarias que se pueden manipular y se examinaron usando una variedad de análisis. Este modelo ex vivo mantiene célula-célula y las interacciones célula-matriz, así como contiene condrocitos en diferentes fases de la condrogénesis, por lo tanto, proporcionar un modelo más fisiológica de células en monocapa o un cultivo 3D. cultivos de órganos metatarsianos son, por tanto, un modelo único para la investigación de los mecanismos moleculares responsables de la osificación endocondral, y son esenciales para mejorar nuestra comprensión de la fisiología y la fisiopatología ósea
The authors have nothing to disclose.
We are grateful to the Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) for funding DH (BB/J01446X/1), CF & VEM (Institute Strategic Programme Grant Funding BB/J004316/1). We also acknowledge Arthritis Research UK for funding to KAS (20413). We thank Miss Elaine Seawright for her assistance with the experiments detailed, Dr. Neil Mackenzie for his assistance with the lentiviral techniques, and Mr Darren Smith and Mr Alex Robertson (Roslin Institute BRF) for their assistance with the animal studies.
Dissection scissors | World Precision Instruments | 14393 | Autoclave sterilise before use |
Dumont #5 tweezers | World Precision Instruments | 500342 | Autoclave sterilise before use |
Dumont #4 tweezers | World Precision Instruments | 500339 | Autoclave sterilise before use |
SuperFine Vannas scissors | World Precision Instruments | 501778 | |
Absolute ethanol | Fisher Scientific | E/0650DF/17 | Dilute to 70% v/v in dH2O |
α-MEM without nucleosides | Thermo Fischer Scientific | 22561021 | |
Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A3059 | |
Syringe filters (0.22μm) 33mm diameter | Merck Millipore | SLGP033RS | |
Phosphocholine chloride calcium salt tetrahydrate | Sigma Aldrich | P0378 | Add directly to the media prior to experimentation |
L-ascorbic acid-2-phosphate | Sigma Aldrich | A8960 | Make up stock soution at 5mg/ml and aliquot at -20°C |
Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C5080 | Make up stock soution at 150mM and aliquot at -20°C |
β-glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma Aldrich | G9422 | Make up stock soution at 1mM and aliquot at -20°C |
Gentamicin | Thermo Fischer Scientific | 15710049 | |
Amphotericin B | Thermo Fischer Scientific | 15290018 | |
Nunc cell-culture treated 24-well plates | Thermo Fischer Scientific | 142475 | |
Polybrene | Sigma Aldrich | H9268 | |
DAPI | Thermo Fischer Scientific | D3571 |