We present a protocol to dissect and culture embryonic day 15 (E15) murine metatarsal bones. This highly physiological ex vivo model of endochondral ossification provides conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture and is a vital tool for investigating bone growth and development.
The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or longitudinal bone growth. As such, it is imperative that we further our understanding of the underpinning molecular mechanisms involved in such disorders so as to provide advances towards human and animal patient benefit. The mouse metatarsal organ explant culture is a highly physiological ex vivo model for studying endochondral ossification and bone growth as the growth rate of the bones in culture mimic that observed in vivo. Uniquely, the metatarsal organ culture allows the examination of chondrocytes in different phases of chondrogenesis and maintains cell-cell and cell-matrix interactions, therefore providing conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture. This protocol describes in detail the intricate dissection of embryonic metatarsals from the hind limb of E15 murine embryos and the subsequent analyses that can be performed in order to examine endochondral ossification and longitudinal bone growth.
iskelet iyon homeostaza, lokomosyon uzanan bir dizi fonksiyon vardır, son derece karmaşık, dinamik ve karmaşık bir organdır. Kemik ve kıkırdak oluşan bu iskeletinin yapısal, biyokimyasal ve mekanik bütünlük 1 muhafaza etmek üzere yapmaktadır fonksiyonel olarak farklı hücre popülasyonlarının oluşur. İskeletin temel işlevlerinden biri gelişme ve büyüme rolü vardır. Bu süreçler sıkı endokrin ve genetik kontrolü ile düzenlenir çoklu hücresel popülasyonların orkestrasyon gerektirir.
Düz kemikler gibi kürek kemiği, kafatası ve sternum hariç, memeli iskelet endokondral kemikleşme olarak bilinen süreçte oluşur. Düzenlenmiştir, her iki moleküler ve mekansal bu işlem, mezoderm 2 öncelikle türetilen mezenkimal hücrelerin yoğunlaştırılması ile başlar. transkripsiyon faktörü SOX9 etkisi altında, hücreler thsıkıştırmaların e iç ifade ve tip II kollajen ve Agrekanın olarak kıkırdak spesifik hücre dışı matriks (ECM) bileşenleri salgılayan, kondrosit içine ayırt. Yoğuşma marjı en Hücreler muhtemel kemik 3 çizen I kolajen ve Perikondriumun oluşturan türünü ifade eder. Daha sonra, perikondriyumda ve osteoprogenitor transkripsiyon faktörleri, Runx2 ve Osterix 4 ifadesi yönettiği, osteoblastlar içine ayırt. Bu osteoblast baskın yol açar ve bu katman kemiğin orta bölümünde çevresinde bir mineralize kemik yaka oluşturan periost yeniden adlandırıldı. Kıkırdaklı iskele periost ve işgali damar penetrasyon, onunla getiren haematopoetically kondrosit kalıntıları ve kıkırdak matrisin 5 çok rezorbe kemik rezorbe hücreleri, osteoklastlar, türetilmiş oluşur. oluşan boşluklar birincil kemikleşme sebebiyet veren osteoprogenitor tarafından doldurulurgiderek diyafizinde çekirdeğini kaplayan ve periost ile birleşir merkezi. Diğer hücreler kemik iliğinde neden olmaktadır. Doğumdan etrafında, kan damarları ve osteoprogenitor ikincil kemikleşme merkezini oluşturmak üzere gelişmekte olan diafizin her iki tarafında (epifiz) de kıkırdak zengin matris nüfuz. Epifiz büyüme plağı – – bütün uzun kemiklerin 6 doğrusal büyüme koordinasyonundan sorumludur uzun kemiklerin iki ucundaki epifiz ve diyafizine arasında yer alan kıkırdak bir grup.
Büyüme plağı içindeki kondrositler başlangıçta çoğalırlar ve daha sonra transkripsiyon ve büyüme faktörlerinin sıralı ifadesi tarafından koordine morfolojik farklı bölgeleri, yoluyla ilerleme. bu olaylar dizisi doruk noktası, bu kıkırdak öncüsünün merkezinde kondrosit hücre döngüsü ve hipertrofisi çıkış olduğunu. Hipertrofik kondrositler güçlü tip X kolajen ve matris metalloproteinaz ifade-13 (MMP13) ve boyuna büyüme yönünde onların hatırı sayılır hacim genişleme memelilerde 7,8 kemik büyümesine en büyük katkıyı sağlar. Ayrıca, hipertrofik kondrositler matriks veziküllerinin serbest yoluyla çevreleyen ECM'yi mineralize membran sınırlı yapılar fosfatazlar dahil (doku spesifik olmayan alkalin fosfataz (TNAP) ve PHOSPHO1) ve kalsiyum kanal proteinlerin (anneksinler yoluyla amorf kalsiyum fosfat üretimi için uzman ) 9-11. Bu kalsifiye kıkırdak osteoklast işe ve matris rezorpsiyonu ile sonuçlanan altta yatan kemik iliğinden kan damarlarının tarafından işgal edildi. Bu hızla mineralize olan osteoid tabakası yatıp kalsifiye kıkırdak kalıntıları yüzeyine osteoblast göç ve uyum izlemektedir. Primer spongioz dokuma kemik daha sonra ikincil sünger 12 lameller kemiğe tamir edilir. epifiz füzyon sonuçlarıendokondral kemikleşme 13 durması.
Rahatsız geliştirme ve / veya boyuna kemik büyümesini 14 önleyecek şekilde endokondral ossifikasyon çok endokrin ve parakrin hormonlar ve büyüme faktörleri tarafından sıkı yönetmelik altındadır. Bu süreçleri destekleyen moleküler ve hücresel mekanizmaların daha iyi anlaşılması, insan yararına yönelik klinik ilerlemeler bizim peşinde zorunludur. Benzerlik ve farklı yaş, konum ve türlerin büyüme plakaları arasındaki farklılıkları içine Önceki araştırmalar büyük ölçüde büyüme plağı dinamiklerini 15,16 çevreleyen fizyolojik mekanizmaları daha iyi anlamamızı sağlamıştır. Çevrelerinden kondrositlerin ayrılması, Col2a1 17 gibi önemli belirteçler ifade kaybı eşliğinde, farklılaşmadan neden olabilir Ancak, izole edilmiş kondrositlerin çalışma zordur.
Fare metatarsal organı eksplant kültürü, piHollanda'da Prof. Elisabeth Burger ve meslektaşları tarafından oneered, kültür in vivo 18 görülene taklit kemiklerin büyüme oranı olarak endokondral ossifikasyon ve kemik büyümesi çalışmak için son derece fizyolojik ex vivo modeldir. Benzersiz metatarsal organ kültürü farklı kültürleri 19-21 hücrelerin daha vivo duruma yakın koşullarının sağlanması, kondrogenezisi farklı aşamalarında kondrosit incelenmesine olanak tanır ve hücre-hücre ve hücre-matriks etkileşimleri tutar. Ayrıca, bu model, birincil kondrosit kültürlerde mümkün değildir lineer kemik büyüme doğrudan incelenmesi için izin verir. Aynı zamanda, bu nedenle büyüme plağının yerel etkileri spesifik analiz izin sistemik ve lokal faktörlerin ayrılması için izin verir.
metatarsalların kültürü birçok parametre incelenmesi için izin verir. toplam uzunluğunun ve mineralli bölgelerinin günlük ölçümleresaslar, standart faz kontrast mikroskobu ve görüntü analiz yazılımı ile gerçekleştirilebilir. In situ hibridizasyon ve immünohistolojik boyama histolojik, hali hazırda hücresel ve moleküler varlıklar, geleneksel hücre kültürü metotlarına göre önemli bir avantaj uzaysal çözünürlüğü sağlar metatarsal bölümleri üzerinde gerçekleştirilebilir. Immünohistokimyasal yaklaşım kıkırdak 22 çoğalan algılama ve 5-bromo-2'-deoksiüridinin (BrdU) alımı miktarının içerir. Buna ek olarak, metatars dokuların daha fazla işlem mRNA (RT-qPCR), protein ve hücre içi sinyal analizi (Western lekeleme) ya da lipit bileşimi (kütle spektrometrisi) aşağı doğru analize imkan vermek üzere gerçekleştirilebilir. Bugüne kadar çoğu araştırmalar doğum sonrası hayvanlardan kültür embriyonik metatarsallann yerine metatarsallann kullanın. daha hızlı büyümek ve explo olabilir: her iki model de bilgilendirici olabilir iken, embriyonik kemik çalışma birçok avantajı vardırkısıtlı erişim vardır mineralizasyon süreci 23-25 başlangıcı ve ilerlemesini incelemek için.
Bu protokol ayrıntılı olarak embriyonik gün 15 (E15) fare embriyolarının arka bacak embriyonik metatarsallara karmaşık diseksiyonu açıklar. Ayrıca, anatomik farklı metatars büyüme ve mineralizasyonu gösterilmiştir.
fare embriyonik metatarsallara kültürü endokondral büyüme ve mineralizasyon son derece fizyolojik bir model sağlar. İlk çalışmalar E15 fare metatars iskelet büyüme ve farklılaşma normal desen geçmesi onaylamıştır. Kıkırdak (kondrositler) ve kemik (osteoblastlar ve osteoklastlar) hücreleri ve bunların ilgili kollajen matris, in vivo olarak gözlenen ayırt edilemez. Ancak, bu modelin bazı tanınmış sınırlamalar vardır. osteoklast farklılaşması hızı (ancak farklılaşma kıkırdak değil) kemik büyümesi olarak bozulur. Kemik büyümesi in vivo gözlenen göre yaklaşık% 50 daha yavaş ve lokal faktörler (örneğin, IGF-1, BMP, vb) 31 üretimini etkileyen sistemik faktörler eksiklikler nedeniyle olabilir. Ayrıca, iyi bir kemik mekanik çevreye duyarlı olduğu bilinmektedir ve bu da C yanıt kültürlenmiş metatarsalların, için de geçerlidirmekanik yüklenme 32,33 olarak Hanges. Bu nedenle, yüksüz durumlarda, bu protokolde, mineralizasyon açıklanan ve mineral emilmesi bozulabilir. Bununla birlikte, metatarsal modeli doğrudan in vitro kültür sistemlerinde 2D ve 3D aracılığı ile mümkün değildir doğrusal kemik büyümesini ölçmek olanağı sunar.
Biz ilk kez, gerçekten E15 fare metatars ve diseksiyonu ve kültür katılan protokol kapsamlı bir açıklama sağladı, deneyler için 2., 3. ve 4. metatarsallann havuzu geçerliliğini doğrulamaktadır.
E17 / E18 metatarsallann yaygın (kültür içinde 14 günden fazla le) uzun süreler için ex vivo olarak büyümesi olağanüstü potansiyeli sayesinde kemik büyüme mekanizmalarını incelemek için kullanılır. Onlar embriyonik uzunlamasına kemik büyümesi üzerine büyüme faktörlerinin rollerini araştırmak için köklü bir modeldir.Ayrıca, doğum sonrası metatars diseksiyonu ve kültür sık olarak doğum sonrası kemik büyümesi ve fetal kemik büyümesi farklı 21 düzenlenmiş olduğu anlaşılmaktadır olarak doğum sonrası kemik büyümesi çevreleyen mekanizmaları tanımlamak için kullanılır. Kültürlü doğum sonrası metatarsallara gözlenen kemik büyümesi uzun vadeli çalışmalarda potansiyellerini sınırlayıcı ve bu doğum sonrası aşamada kemik büyümesi üzerine daha sistemik bir etkiye vurgulayarak, ancak embriyonik rudiments 25,34 gözlenen önemli ölçüde daha azdır. Gerçekten de, fareler 3 günlük sonrası metatarsalların tipik haliyle ölçülebilir bir artış 34 elde etmek için kullanılabilecek en son aşamasıdır.
Burada E15 embriyonik metatarsal kemikler izolasyonu için bizim protokol açıklar. E15 metatarsal kemiklerde hydroxyapaptite mineral olmaması da rakipsiz uzunlamasına kemik büyümesini çevreleyen sadece mekanizmalarını araştırmak için bir model, ama inisiyasyon sağlamak anlamına geliriskelet mineralizasyonu. Terminal hipertrofik kondrosit bölgenin mineralize matriks daha sonra mineralize edilen kemik spesifik matris (osteoid) bırakmaya osteoblast işgal için bir iskele sağlar ve böyle bu ilk mineralizasyon başarılı ve fonksiyonel kemik oluşumu 35 için hayati önem taşımaktadır. Nitekim E15 metatarsallann kullanan son raporlar bir dizi mineralizasyon süreci 28,36,37 araştırılması için kendi benzersiz yeteneği doğruladı. Ayrıca, araştırmacılar, kemik büyümesi / mineralizasyon ayarı dışında model olarak embriyonik metatarsallara potansiyelini vurgulayarak, anjiyogenez 38 bir model olarak E15 metatarsallara kullanımını tarif etmişlerdir.
Bizim tarif protokol laminer akış kaputu, diseksiyon gerçekleştirmek için bir mikroskop ve eksize rudiments kültürü için CO 2 inkübatör dahil olmak üzere yalnızca standart laboratuar ekipmanı gerektirir. Ayrıca, bir çok temel culOrta αMEM, BSA, antibiyotikler, antimikotikler ve L-askorbik asit ihtiva eden Ture (hidroksiprolin ve hidroksilizin sentezinde bir ko-faktörü, kollajen 39 üretimi için iki temel amino asitler), hayvan serası olarak tanımlanmamış katkı maddelerinin kullanımını önler . Geleneksel olarak, araştırmacılar, kültür embriyonik metatarsalların için kullanılan ortamlara βGP eklemiş ancak sonuçlar ortaya koyduğu gibi, ek bir fosfat kaynağı kullanımı, bu kültür sistemi başarılı mineralizasyonu için gerekli değildir. Bu ECM mineralizasyon destekleyen mekanizmaların anlaşılması bizim peşinde önemli bir bulgudur.
Metatars önce uzun kemik gelişimi 40 düzenlenmesine büyüme faktörü beta dönüştürme rolünü araştırmak için Smad2 dominant-negatif formları içeren adenovirüs ile enfekte olmuştur. Burada da t gösteren gfp virüs partikülleri ile, vahşi tip E15 metatarsal kemiklerin başarılı bir transfeksiyon ortayaşapka lentiviral teknikleri kolayca metatarsal kültürlerde gen ekspresyonu işlemek için kabul edilebilir. Benzer şekilde, metatarsal organ kültürü sistemi daha iyi kemik büyüme sürecinde belirli bir genin rolünü anlamak için genetik olarak değiştirilmiş farelerin kemik gelişimini karşılaştırmak için mükemmel bir modeldir. Daha önceki çalışmalar endokondral kemik büyüme sitokin baskılayıcı sinyalizasyon-2 (SOCS2) rolünü belirlemek için metatarsal organ kültürü sistemi kullanmışlardır. SOCS2 içinde eksik fareler metatarsal kemiklerin kullanılması, söz konusu büyüme hormonu insülin benzeri büyüme faktörü kendi boyuna büyüme bağımsız taklit edebilen göstermiştir (IGF-1), büyüme hormonu tedavisi 34 yanıt yok, vahşi tip metatarsal kemikleri farklı olarak, 41. Bu metatarsal kültürleri, farklı genler ve / veya endokondral kemik büyümesi üzerine dışsal faktörlerin etkilerini incelemek için manipüle edilebilir ölçüde vurgulamaktadır.
Özetle, detai sahipmanipüle edilebilir embriyonik metatarsal kemiklerin başarılı çıkarma ve kültür için bir yöntem açtı ve çeşitli analizler kullanılarak incelendi. Bu eks vivo modeli, bu nedenle tek tabaka ya da 3 boyutlu kültür hücrelerine göre daha fizyolojik bir model sağlayan, hem de kondrojenez farklı aşamalarında kondrositlerin içerdiği, hücre-hücre ve hücre-matris etkileşimlerini tutar. Metatarsal organ kültürleri nedenle endokondral kemikleşme sorumlu moleküler mekanizmaları araştırmak için benzersiz bir modeldir ve kemik fizyolojisi ve patofizyolojisi hem anlayışımızı ilerletmek için gerekli olan
The authors have nothing to disclose.
We are grateful to the Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) for funding DH (BB/J01446X/1), CF & VEM (Institute Strategic Programme Grant Funding BB/J004316/1). We also acknowledge Arthritis Research UK for funding to KAS (20413). We thank Miss Elaine Seawright for her assistance with the experiments detailed, Dr. Neil Mackenzie for his assistance with the lentiviral techniques, and Mr Darren Smith and Mr Alex Robertson (Roslin Institute BRF) for their assistance with the animal studies.
Dissection scissors | World Precision Instruments | 14393 | Autoclave sterilise before use |
Dumont #5 tweezers | World Precision Instruments | 500342 | Autoclave sterilise before use |
Dumont #4 tweezers | World Precision Instruments | 500339 | Autoclave sterilise before use |
SuperFine Vannas scissors | World Precision Instruments | 501778 | |
Absolute ethanol | Fisher Scientific | E/0650DF/17 | Dilute to 70% v/v in dH2O |
α-MEM without nucleosides | Thermo Fischer Scientific | 22561021 | |
Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A3059 | |
Syringe filters (0.22μm) 33mm diameter | Merck Millipore | SLGP033RS | |
Phosphocholine chloride calcium salt tetrahydrate | Sigma Aldrich | P0378 | Add directly to the media prior to experimentation |
L-ascorbic acid-2-phosphate | Sigma Aldrich | A8960 | Make up stock soution at 5mg/ml and aliquot at -20°C |
Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C5080 | Make up stock soution at 150mM and aliquot at -20°C |
β-glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma Aldrich | G9422 | Make up stock soution at 1mM and aliquot at -20°C |
Gentamicin | Thermo Fischer Scientific | 15710049 | |
Amphotericin B | Thermo Fischer Scientific | 15290018 | |
Nunc cell-culture treated 24-well plates | Thermo Fischer Scientific | 142475 | |
Polybrene | Sigma Aldrich | H9268 | |
DAPI | Thermo Fischer Scientific | D3571 |