We present a protocol to dissect and culture embryonic day 15 (E15) murine metatarsal bones. This highly physiological ex vivo model of endochondral ossification provides conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture and is a vital tool for investigating bone growth and development.
The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or longitudinal bone growth. As such, it is imperative that we further our understanding of the underpinning molecular mechanisms involved in such disorders so as to provide advances towards human and animal patient benefit. The mouse metatarsal organ explant culture is a highly physiological ex vivo model for studying endochondral ossification and bone growth as the growth rate of the bones in culture mimic that observed in vivo. Uniquely, the metatarsal organ culture allows the examination of chondrocytes in different phases of chondrogenesis and maintains cell-cell and cell-matrix interactions, therefore providing conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture. This protocol describes in detail the intricate dissection of embryonic metatarsals from the hind limb of E15 murine embryos and the subsequent analyses that can be performed in order to examine endochondral ossification and longitudinal bone growth.
Skelettet er en meget indviklet, dynamisk og komplekst organ, der har en række funktioner, der spænder fra bevægelse, til ion homeostase. Består af knogle og brusk, skelettet består af funktionelt distinkte cellepopulationer, der opererer til at opretholde det strukturelle, biokemiske og mekaniske integritet 1. En af de primære funktioner i skelettet er dens rolle i udvikling og vækst. Disse processer kræver orkestrering af flere cellulære populationer, der er reguleret gennem stram endokrine og genetiske kontrol.
Med undtagelse af den flade knogler f.eks scapula, kranium og brystben er pattedyr skelet dannet gennem processen kaldes endochondral ossifikation. Denne proces, reguleres både molekylært og rumligt, begynder med kondenseringen af mesenkymale celler afledt primært fra mesoderm 2. Under indflydelse af transkriptionsfaktoren Sox9, celler i the indre af kondensationer differentierer til chondrocytter, der udtrykker og udskille brusk specifikke ekstracellulære matrix (ECM) komponenter såsom type II collagen og aggrecan. Celler på margenen af kondens, udtrykker type I collagen og danner perichondrium, afgrænser den kommende knogle 3. Senere osteoprogenitors af perichondrium differentiere til osteoblaster, instrueret af ekspression af de transkriptionsfaktorer, Runx2 og osterix 4. Dette fører til en overvægt af osteoblaster og dette lag er omdøbt periosteum, som danner en mineraliseret bony krave omkring den midterste del af knoglen. Vaskulær penetration af periosteum og invasion af bruskagtig stillads sker bringer med sig, haematopoetically afledt knogleresorberende celler, osteoklaster, som resorberer chondrocyt rester og meget af den bruskagtig matrix 5. Rummene dannede er fyldt af osteoprogenitors giver anledning til den primære ossifikationcenter, som gradvist indtager kernen i diafysen og fusionerer med periosteum. Andre celler giver anledning til knoglemarven. Omkring fødslen, blodkar og osteoprogenitors trænge brusken rige matrix på hver side (epifyser) af den udviklende diafyse til dannelse af den sekundære ossifikation center. Beliggende mellem epifysen og diafysen i hver ende af de lange knogler er et band af brusk – det epifysale vækst plade – som er ansvarlig for at koordinere lineær vækst af alle lange knogler 6.
Chondrocytter i væksten pladen oprindeligt formere og efterfølgende fremskridt gennem morfologisk forskellige zoner, koordineret af sekventiel udtryk for transskription og vækstfaktorer. Kulminationen på denne sekvens af begivenheder er udgang fra cellecyklus og hypertrofi af chondrocytter i centrum for denne brusk forløber. Hypertrofe chondrocytter udtrykke kraftigt type X-collagen og matrixmetalloproteinase-13 (MMP13) og deres betydelige volumen udvidelsen i retning af langsgående vækst giver det største bidrag til knoglevækst i pattedyr 7,8. Desuden hypertrofiske chondrocytter mineralize deres omgivende ECM gennem frigivelse af matrix vesikler, specialiserede membran afgrænset strukturer til produktion af amorf calciumphosphat gennem deres inddragelse af fosfataser (tissue uspecifik alkalisk fosfatase (TNAP) og PHOSPHO1) og calcium kanalisere proteiner (annexiner ) 9-11. Denne forkalket brusk er invaderet af blodkar fra den underliggende marv resulterer i osteoklast rekruttering og matrix resorption. Dette efterfølges af osteoblast migration og tilpasning til overfladen af de forkalket brusk rester, hvor de fastsætter et lag af osteoid som er hurtigt mineraliseret. Det vævede knogle af den primære spongiosa er senere ombygget til lamellar knogle af den sekundære spongiosa 12. Epifyserne fusion resulterer iophør af endochondral ossifikation 13.
Endochondral ossifikation er under stram regulering af mange endokrine og parakrine hormoner og vækstfaktorer for at forhindre forstyrret udvikling og / eller langsgående knoglevækst 14. En bedre forståelse af de molekylære og cellulære mekanismer der ligger til grund disse processer er derfor bydende nødvendigt i vores udøvelse af kliniske fremskridt i retning af menneskelig fordel. Tidligere forskning i ligheder og forskelle mellem vækst plader i forskellige aldre, steder og arter har forbedret vores forståelse af de fysiologiske mekanismer omkring vækst plade dynamik 15,16. Men studiet af isolerede chondrocytter er vanskelig, da fjernelse af chondrocytter fra deres miljø kan føre til dedifferentiering, ledsaget af tab af ekspression af vigtige markører, såsom COL2A1 17.
Musen metatarsal orgel eksplantation kultur, pioneered af Prof. Elisabeth Burger og kolleger i Holland, er en meget fysiologisk ex vivo model til at studere endochondral ossifikation og knoglevækst som væksten af knoglerne i kultur efterligner den, der ses in vivo 18. Unikt, mellemfod organkultur tillader undersøgelse af chondrocytter i forskellige faser af chondrogenese og opretholder celle-celle- og celle-matrix-interaktioner, derfor giver betingelser tættere på in vivo-situationen end celler i kultur 19-21. Desuden er denne model giver mulighed for direkte undersøgelse af lineær knoglevækst hvilket ikke er muligt i primære chondrocyt kulturer. Det giver også mulighed for adskillelse af systemiske og lokale faktorer derfor tillader den specifikke analyse af de lokale virkninger på væksten plade.
Kulturen i metatarsals giver mulighed for undersøgelse af talrige parametre. Daglige målinger af totale længde og de mineraliserede regionerrudimenterne kan udføres med standard fasekontrastmikroskopi og billedanalysesoftware. Histologiske, in situ hybridisering og immunohistologisk farvning let kan udføres på metatarsus sektioner, som giver mulighed for den rumlige opløsning af både cellulære og molekylære enheder, en stor fordel i forhold til traditionelle celledyrkningsmetoder. Den immunhistokemiske tilgang omfatter påvisning og kvantificering af 5-brom-2'-deoxyuridin (BrdU) optagelse af prolifererende chondrocytter 22. Desuden kan yderligere behandling af metatarsus væv udføres for at muliggøre nedstrøms analyse af mRNA-ekspression (RT-qPCR), protein og intracellulær signalering analyse (Western blotting) eller lipidsammensætning (massespektrometri). De fleste undersøgelser til dato bruger dyrkede embryonale mellemfodsknogler snarere end mellemfoden fra postnatale dyr. Mens begge modeller kan være oplysende, studiet af embryonale knogler har flere fordele: de vokser hurtigere og kan være eksplgrænset til at studere initiering og progression af mineralisering proces 23-25.
Denne protokol beskriver detaljeret den indviklede dissektion af embryonale metatarsaler fra bagbenet af embryonale dag 15 (E15) murine embryoner. Endvidere vækst og mineralisering af anatomisk særskilte Mellemfodsben vises,.
Den kultur af murine embryonale Mellemfodsben danner et særdeles fysiologisk model af endochondral vækst og mineralisering. Tidlige undersøgelser har valideret, at E15 muse Mellemfodsben gennemgå en normal mønster af skelet vækst og differentiering. Brusken (chondrocytter) og knogle (osteoblaster og osteoklaster) celler og deres respektive collagene matricer er ikke skelnes fra dem, der observeres in vivo. Der er dog nogle anerkendte begrænsninger af denne model. Hastigheden af osteoklastdifferentiering er forringet som er knoglevækst (men ikke brusk differentiering). Knoglevækst er ca. 50% langsommere end observeret in vivo og kan skyldes mangler i systemiske faktorer, der påvirker produktionen af lokale faktorer (f.eks IGF-1, BMP'er, etc.) 31. Det er også velkendt, at knoglen er følsom over for dens mekaniske miljø, og dette er også tilfældet for dyrkede Mellemfodsben, som svarer til cNDRINGER i mekanisk belastning 32,33. Derfor, i ubelastede situationer, som beskrevet i denne protokol, mineralisering og mineralsk resorption kan være kompromitteret. Alligevel mellemfod model giver evnen til direkte at måle lineær knoglevækst hvilket ikke er muligt via 2D og 3D in vitro dyrkningssystemer.
Vi har givet en omfattende beskrivelse af den pågældende i dissektion og kultur E15 murine Mellemfodsben og faktisk for første gang protokol, bekræfte gyldigheden af at samle de to nd, 3. og 4. th mellemfoden for eksperimenter.
Metatarsaler fra E17 / E18 er almindeligt anvendt til at undersøge mekanismerne i knoglevækst på grund af deres ekstraordinære potentiale til at vokse ex vivo i lange perioder (dvs. ud over 14 dage i kultur). De er en veletableret model for at undersøge rollerne for vækstfaktorer på embryonisk langsgående knoglevækst.Derudover er dissektion og dyrkning af postnatale Mellemfodsben almindeligvis anvendes til at afgrænse de mekanismer omgivende postnatal knoglevækst som det forstås, at postnatal vækst knogle og føtal knoglevækst reguleres forskelligt 21. Den knoglevækst observeret i dyrkede postnatale Mellemfodsben er dog betydeligt mindre end hos embryonale ansatser 25,34, hvilket begrænser deres potentiale i langtidsstudier og fremhæve de mere systemiske indflydelse på knoglevækst på dette postnatal fase. Faktisk 3 dage gamle postnatale metatarsal fra mus er typisk de seneste trin, der kan anvendes til at opnå målbar vækst 34.
Her beskriver vi vores protokol til isolering af embryonale metatarsus knogler på E15. Fraværet af hydroxyapaptite mineral i E15 metatarsus knogler betyder, at de giver en uovertruffen model til at undersøge ikke blot de mekanismer omgivende langsgående knoglevækst, men ligeledes iværksættelseaf skeletal mineralisering. Den mineraliserede matrix af terminalen hypertrofisk chondrocyt zone giver et stillads for at invadere osteoblaster at fastlægge en knogle matrix (osteoid), som efterfølgende mineraliseret, og som sådan denne indledende mineralisering er afgørende for en vellykket og funktionel knogledannelse 35. Faktisk en række nylige rapporter udnytter E15 Mellemfodsben har bekræftet deres unikke evne til undersøgelse af mineralisering proces 28,36,37. Desuden har forskere beskrevet anvendelsen af E15 metatarsaler som en model af angiogenese 38, hvori den potentielle af embryonale metatarsal som model uden indstillingen knoglevækst / mineralisering.
Protokollen beskriver vi kræver kun standard laboratorieudstyr, herunder en laminær strømning, et dissektionsmikroskop til udførelse af dissektion, og et CO2-inkubator til dyrkning af udskårne ansatser. Desuden er en meget grundlæggende culTURE medium indeholdende aMEM, BSA, antibiotika, antimykotika og L-ascorbinsyre (en co-faktor ved syntese af hydroxyprolin og hydroxylysin, to essentielle aminosyrer til fremstilling af kollagen 39) undgår anvendelsen af udefinerede tilsætningsstoffer, såsom animalsk sera . Traditionelt har forskere tilføjet βGP til medier, der anvendes til dyrkning af embryonale metatarsaler men som åbenbaret i vores resultater, er ikke påkrævet at anvende en supplerende phosphatkilde for vellykket mineralisering i dette kultursystem. Dette er et vigtigt resultat i vores jagt på at forstå de mekanismer, der ligger til grund ECM mineralisering.
Mellemfodsben har tidligere været inficeret med adenovirus, der indeholder dominante-negative former for Smad2 at udforske rollen som transformerende vækstfaktor β i reguleringen af lang knogle udvikling 40. Her har vi også afsløre en vellykket transfektion af vildtype-E15 metatarsus knogler med GFP viruspartikler, hvilket indikerer that lentiviral teknikker kunne nemt blive vedtaget at manipulere genekspression i metatarsal kulturer. Tilsvarende mellemfod organkultur system er en fremragende model til at sammenligne væksten af knogler fra genetisk ændrede mus for bedre at forstå den rolle, som et bestemt gen i knoglevækst processen. Vores tidligere undersøgelser har udnyttet mellemfod organkultur system til at bestemme den rolle, som undertrykker af cytokin signalering-2 (SOCS2) i endochondral knoglevækst. Brug af metatarsus knogler fra mus med mangelfuld SOCS2, har vi vist, at væksthormon er i stand til at simulere deres langsgående vækst uafhængig af insulin-lignende vækstfaktor (IGF-1), til forskel fra vildtype-metatarsus knogler, der ikke reagerer på behandling med væksthormon 34, 41. Dette understreger, i hvilket omfang metatarsus kulturer kan manipuleres til at undersøge effekten af forskellige gener og / eller eksogene faktorer på endochondral knoglevækst.
Sammenfattende har vi Detaiførte en fremgangsmåde til vellykket udvinding og kultur af embryonale metatarsus knogler, der kan manipuleres og undersøgt ved anvendelse af en række forskellige analyser. Denne ex vivo-model fastholder celle-celle- og celle-matrix-interaktioner, samt indeholder chondrocytter i forskellige faser af chondrogenese, derfor giver en mere fysiologisk model end celler i monolag eller 3D kultur. Metatarsal orgel kulturer er derfor en enestående model for undersøge de molekylære mekanismer, der er ansvarlige for endochondral ossifikation, og er afgørende for at fremme vores forståelse af både knogle fysiologi og patofysiologi
The authors have nothing to disclose.
We are grateful to the Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) for funding DH (BB/J01446X/1), CF & VEM (Institute Strategic Programme Grant Funding BB/J004316/1). We also acknowledge Arthritis Research UK for funding to KAS (20413). We thank Miss Elaine Seawright for her assistance with the experiments detailed, Dr. Neil Mackenzie for his assistance with the lentiviral techniques, and Mr Darren Smith and Mr Alex Robertson (Roslin Institute BRF) for their assistance with the animal studies.
Dissection scissors | World Precision Instruments | 14393 | Autoclave sterilise before use |
Dumont #5 tweezers | World Precision Instruments | 500342 | Autoclave sterilise before use |
Dumont #4 tweezers | World Precision Instruments | 500339 | Autoclave sterilise before use |
SuperFine Vannas scissors | World Precision Instruments | 501778 | |
Absolute ethanol | Fisher Scientific | E/0650DF/17 | Dilute to 70% v/v in dH2O |
α-MEM without nucleosides | Thermo Fischer Scientific | 22561021 | |
Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A3059 | |
Syringe filters (0.22μm) 33mm diameter | Merck Millipore | SLGP033RS | |
Phosphocholine chloride calcium salt tetrahydrate | Sigma Aldrich | P0378 | Add directly to the media prior to experimentation |
L-ascorbic acid-2-phosphate | Sigma Aldrich | A8960 | Make up stock soution at 5mg/ml and aliquot at -20°C |
Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C5080 | Make up stock soution at 150mM and aliquot at -20°C |
β-glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma Aldrich | G9422 | Make up stock soution at 1mM and aliquot at -20°C |
Gentamicin | Thermo Fischer Scientific | 15710049 | |
Amphotericin B | Thermo Fischer Scientific | 15290018 | |
Nunc cell-culture treated 24-well plates | Thermo Fischer Scientific | 142475 | |
Polybrene | Sigma Aldrich | H9268 | |
DAPI | Thermo Fischer Scientific | D3571 |