We present a protocol to dissect and culture embryonic day 15 (E15) murine metatarsal bones. This highly physiological ex vivo model of endochondral ossification provides conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture and is a vital tool for investigating bone growth and development.
The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or longitudinal bone growth. As such, it is imperative that we further our understanding of the underpinning molecular mechanisms involved in such disorders so as to provide advances towards human and animal patient benefit. The mouse metatarsal organ explant culture is a highly physiological ex vivo model for studying endochondral ossification and bone growth as the growth rate of the bones in culture mimic that observed in vivo. Uniquely, the metatarsal organ culture allows the examination of chondrocytes in different phases of chondrogenesis and maintains cell-cell and cell-matrix interactions, therefore providing conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture. This protocol describes in detail the intricate dissection of embryonic metatarsals from the hind limb of E15 murine embryos and the subsequent analyses that can be performed in order to examine endochondral ossification and longitudinal bone growth.
Lo scheletro è un organo altamente complessa, dinamica e complessa che ha una gamma di funzioni che vanno dalla locomozione, per l'omeostasi di ioni. Composto da ossa e cartilagine, lo scheletro è costituito da popolazioni di cellule funzionalmente distinte che operano per mantenere la propria integrità strutturale, biochimico e meccanica 1. Una delle funzioni primarie dello scheletro è il suo ruolo nello sviluppo e crescita. Questi processi richiedono l'orchestrazione di molteplici popolazioni cellulari che sono regolati attraverso endocrino stretto e controllo genetico.
Con l'eccezione della ossa piatte es scapola, cranio e dello sterno, lo scheletro dei mammiferi è formata attraverso il processo noto come encondrale. Questo processo, regolato sia molecolarmente e spazialmente, inizia con la condensazione di cellule mesenchimali derivate principalmente dal mesoderma 2. Sotto l'influenza del fattore di trascrizione SOX9, cellule in the all'interno degli condensazioni differenziarsi in condrociti, esprimere e secernere componenti cartilagine specifiche matrice extracellulare (ECM) come collagene di tipo II e aggrecano. Le cellule al margine della condensazione, esprimono collagene di tipo I e formo la pericondrio, delineando la prospettiva osso 3. Più tardi, i osteoprogenitors del pericondrio differenziano in osteoblasti, diretto da l'espressione dei fattori di trascrizione, Runx2 e Osterix 4. Questo porta ad una predominanza di osteoblasti e questo strato viene rinominato periostio che forma un collare osseo mineralizzato intorno alla metà sezione dell'osso. La penetrazione vascolare del periostio e l'invasione del ponteggio cartilaginea avviene portando con sé, haematopoetically derivato cellule ossee riassorbimento, osteoclasti, che riassorbono i resti di condrociti e gran parte della matrice cartilaginea 5. Gli spazi formati sono riempiti da osteoprogenitors all'origine della ossificazione primariacentro che occupa progressivamente il nucleo della diafisi e si fonde con il periostio. Altre cellule danno origine al midollo osseo. Intorno nascita, vasi sanguigni e osteoprogenitors penetrano la matrice cartilaginea ricca su entrambi i lati (epifisi) della diafisi sviluppo per formare il centro di ossificazione secondario. Situato tra l'epifisi e diafisi alle due estremità delle ossa lunghe sono un gruppo di cartilagine – la cartilagine di accrescimento epifisaria – che è responsabile del coordinamento crescita lineare di tutte le ossa lunghe 6.
I condrociti all'interno della cartilagine di accrescimento inizialmente proliferano e successivamente progressi attraverso le zone morfologicamente distinte, coordinati da espressione sequenziale di fattori di trascrizione e di crescita. Il culmine di questa sequenza di eventi è l'uscita dal ciclo cellulare e l'ipertrofia dei condrociti al centro di questa cartilagine precursore. condrociti ipertrofici esprimono fortemente tipo X collagene e metalloproteinasi della matrice-13 (MMP13) e la loro notevole allargamento volume nella direzione della crescita longitudinale fornisce il maggior contributo alla crescita delle ossa nei mammiferi 7,8. Inoltre, condrociti ipertrofici mineralizzano loro ECM circostante attraverso il rilascio di vescicole matrice, strutture a membrana delimitata specializzati per la produzione di fosfato di calcio amorfo attraverso la loro inclusione di fosfatasi (tessuto non specifico fosfatasi alcalina (TNAP) e PHOSPHO1) e di calcio canalizzazione proteine (annexins ) 9-11. Questa cartilagine calcificata è invasa da vasi sanguigni dal midollo sottostante con conseguente reclutamento degli osteoclasti e matrice di riassorbimento. Questa è seguita da migrazione degli osteoblasti e l'allineamento alla superficie dei resti cartilagine calcificata dove stabiliscono uno strato di osteoide che è rapidamente mineralizzato. Il tessuto osseo del spugnoso è poi ristrutturato per osso lamellare della spongiosa secondario 12. risultati di fusione epifisari nelcessazione di encondrale 13.
Encondrale è sotto stretta regolamentazione da molti ormoni endocrini e paracrini e fattori di crescita, in modo da prevenire lo sviluppo disturbato e / o la crescita delle ossa longitudinale 14. Una migliore comprensione dei meccanismi molecolari e cellulari alla base di questi processi è quindi indispensabile nella nostra ricerca di progressi clinici verso beneficio umano. Precedenti ricerche sulle somiglianze e le differenze tra le cartilagini di accrescimento di differenti età, luoghi e specie hanno notevolmente migliorato la nostra comprensione dei meccanismi fisiologici che circondano dinamiche cartilagine di accrescimento 15,16. Tuttavia, lo studio dei condrociti isolati è difficile, come la rimozione dei condrociti dal loro ambiente può portare a dedifferentiation, accompagnato da perdita di espressione di marcatori chiave come COL2A1 17.
Il mouse metatarso espianto di organi, pioneered dal Prof. Elisabeth Burger ei suoi colleghi nei Paesi Bassi, è un ex vivo modello altamente fisiologico per lo studio encondrale e la crescita delle ossa, come il tasso di crescita delle ossa nella cultura imitano quello visto in vivo 18. Unicamente, la cultura organo metatarso consente l'esame dei condrociti in diverse fasi di condrogenesi e mantiene cellula-cellula e cellula-matrice interazioni, fornendo quindi condizioni più prossime alla situazione in vivo di cellule in coltura 19-21. Inoltre, questo modello consente esame diretto della crescita ossea lineare che non è possibile in colture di condrociti primari. Esso permette anche la separazione dei fattori sistemici e locali permettendo quindi l'analisi specifica degli effetti locali sulla piastra di crescita.
La cultura del metatarsi permette lo studio di numerosi parametri. misurazioni giornaliere di lunghezza totale e delle regioni di mineralizzatii rudimenti possono essere eseguite con microscopio a contrasto di fase di serie e il software di analisi delle immagini. Istologica, ibridazione in situ e la colorazione immunoistochimica può essere facilmente eseguita su sezioni metatarsali, che permette la risoluzione spaziale di entrambe le entità cellulari e molecolari, un importante vantaggio rispetto ai metodi tradizionali di coltura cellulare. L'approccio immunoistochimica include il rilevamento e la quantificazione di 5-bromo-2'-deossiuridina (BrdU) assorbimento da proliferazione condrociti 22. Inoltre, ulteriore trattamento di tessuti metatarsali può essere effettuato per consentire un'analisi valle di mRNA (RT-qPCR), proteine e analisi segnale intracellulare (Western blotting) o la composizione lipidica (spettrometria di massa). La maggior parte degli studi fino ad oggi utilizzano metatarsi embrionali in coltura piuttosto che metatarsi da animali post-natale. Mentre entrambi i modelli possono essere informativo, lo studio delle ossa embrionali ha diversi vantaggi: crescono più velocemente e può essere exploited per studiare l'inizio e la progressione del 23-25 processo di mineralizzazione.
Questo protocollo descrive in dettaglio la dissezione intricata di metatarsi embrionali dalla dell'arto posteriore di giorno embrionale 15 (E15) embrioni murini. Inoltre, viene mostrato la crescita e la mineralizzazione dei metatarsi anatomicamente distinte.
La cultura del metatarso embrionali murine fornisce un modello altamente fisiologico della crescita endochondral e mineralizzazione. I primi studi hanno confermato che E15 metatarsi del mouse subiscono un normale modello di crescita scheletrica e la differenziazione. La cartilagine (condrociti) e l'osso (osteoblasti e osteoclasti), le cellule e le loro rispettive matrici di collagene sono indistinguibili da quelle osservate in vivo. Tuttavia, ci sono alcune limitazioni riconosciute di questo modello. La velocità di differenziazione degli osteoclasti è compromessa così come la crescita delle ossa (ma non cartilagine differenziazione). La crescita ossea è circa il 50% inferiore a quella osservata in vivo e può essere causa di carenze in fattori sistemici che influenzano la produzione di fattori locali (ad esempio, IGF-1, BMP, ecc) 31. Inoltre, è ben noto che l'osso è sensibile al suo ambiente meccanico e questo è anche il caso per metatarsi coltivate, che rispondono alla cHANGES a carico 32,33 meccanica. Pertanto, in situazioni non caricati, come descritto in questo protocollo, la mineralizzazione e il riassorbimento minerale potrebbe essere compromessa. Tuttavia, il modello metatarso offre la possibilità di misurare direttamente la crescita delle ossa lineare che non è possibile tramite 2D e 3D in sistemi di coltura in vitro.
Abbiamo fornito una descrizione completa del protocollo coinvolti nella dissezione e la cultura della E15 metatarsi murini e in effetti, per la prima volta, confermare la validità di mettere in comune i 2 °, 3 ° e 4 ° metatarso per gli esperimenti.
Metatarsi da E17 / E18 sono comunemente usati per studiare i meccanismi di crescita ossea a causa della loro straordinario potenziale per crescere ex vivo per lunghi periodi di tempo (cioè oltre i 14 giorni di cultura). Si tratta di un modello consolidato per indagare il ruolo dei fattori di crescita sulla crescita embrionale ossea longitudinale.Inoltre, la dissezione e la cultura di metatarsi postnatali è comunemente impiegato per delineare i meccanismi che circondano la crescita delle ossa post-natale, come si è capito che la crescita delle ossa post-natale e la crescita delle ossa del feto sono regolati in modo diverso 21. La crescita ossea osservata in metatarsi postnatali in coltura è comunque notevolmente inferiore a quello osservato nei rudimenti embrionali 25,34, limitando il loro potenziale in studi a lungo termine e mettendo in evidenza l'influenza più sistemico sulla crescita delle ossa, in questa fase post-natale. Infatti, 3 giorni di età metatarsi postnatale di topi sono tipicamente l'ultima fase che può essere utilizzato per ottenere misurabile 34 crescita.
Qui si descrive il nostro protocollo per l'isolamento delle ossa del metatarso embrionali a E15. L'assenza di minerale hydroxyapaptite in E15 metatarsale significa che essi forniscono un modello ineguagliabile per indagare non solo i meccanismi circostanti crescita ossea longitudinale, ma anche l'iniziazionedi mineralizzazione scheletrica. La matrice mineralizzata della zona di condrociti ipertrofica terminale fornisce un'impalcatura per invadere osteoblasti stabilire un osso specifica matrice (osteoide), che viene successivamente mineralizzata, e come tale questo mineralizzazione iniziale è di vitale importanza per la formazione delle ossa di successo e funzionale 35. In effetti una serie di rapporti recenti che utilizzano metatarsi E15 hanno confermato la loro capacità unica per l'indagine del 28,36,37 processo di mineralizzazione. Inoltre, i ricercatori hanno descritto l'uso di metatarsi E15 come modello di angiogenesi 38, mettendo in evidenza il potenziale di metatarsi embrionali come modello di fuori del contesto della crescita ossea / mineralizzazione.
Il protocollo che descriviamo richiede solo apparecchiature di laboratorio standard tra cui una cappa flusso laminare, un microscopio da dissezione per eseguire la dissezione, e un incubatore di CO 2 per la cultura dei primi rudimenti escisse. Inoltre, una strada molto essenzialeture terreno contenente αMEM, BSA, antibiotici, antimicotici e l'acido L-ascorbico (un cofattore nella sintesi di idrossiprolina e idrossilisina, due amminoacidi essenziali per la produzione di collagene 39) evita l'uso di additivi non definiti, come siero animale . Tradizionalmente, gli investigatori hanno aggiunto βGP ai mezzi utilizzati per la coltura metatarsi embrionali, ma come rivelato nei nostri risultati, l'uso di una fonte di fosfato supplementare non è richiesto per la mineralizzazione successo in questo sistema di coltura. Questo è un dato importante nella nostra ricerca di comprensione dei meccanismi alla base ECM mineralizzazione.
Metatarsi sono stati precedentemente infettati con adenovirus contenenti forme dominanti negativi di Smad2 per esplorare il ruolo di fattore di crescita trasformante β nella regolazione dello sviluppo delle ossa lunghe 40. Qui si rivelano anche la trasfezione di successo di wild-type ossa metatarsali E15 con particelle virali GFP, indicando ttecniche di cappello lentivirali potrebbero essere facilmente adottate per manipolare l'espressione genica nelle culture del metatarso. Analogamente, il sistema di coltura organo metatarso è un modello eccellente in cui confrontare la crescita delle ossa da topi geneticamente modificati per comprendere meglio il ruolo di un particolare gene nel processo di crescita ossea. I nostri studi precedenti hanno utilizzato il sistema di coltura di organi metatarso per determinare il ruolo di soppressore di citochine segnalazione-2 (SOCS2) in crescita ossea endochondral. Utilizzando ossa del metatarso da topi deficienti in SOCS2, abbiamo dimostrato che l'ormone della crescita è in grado di simulare il loro longitudinale crescita autonoma di insulina come fattore di crescita (IGF-1), a differenza di wild-type ossa metatarsali che non rispondono alla crescita trattamento ormonale 34, 41. Ciò evidenzia la misura in cui le culture metatarsali possono essere manipolati per esaminare gli effetti di diversi geni e / o fattori esogeni sulla crescita ossea endochondral.
In sintesi, abbiamo detaicondotto un metodo per l'estrazione di successo e cultura metatarsale embrionali che possono essere manipolate ed esaminati utilizzando una varietà di analisi. Questo modello ex vivo mantiene cellula-cellula e le interazioni cellula-matrice, così come contiene condrociti in diverse fasi di condrogenesi, fornendo quindi un modello più fisiologico di cellule in monostrato o coltura 3D. Metatarsali organo culture sono quindi un modello unico per lo studio dei meccanismi molecolari responsabili encondrale, e sono essenziali per migliorare la nostra comprensione sia la fisiologia dell'osso e fisiopatologia
The authors have nothing to disclose.
We are grateful to the Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) for funding DH (BB/J01446X/1), CF & VEM (Institute Strategic Programme Grant Funding BB/J004316/1). We also acknowledge Arthritis Research UK for funding to KAS (20413). We thank Miss Elaine Seawright for her assistance with the experiments detailed, Dr. Neil Mackenzie for his assistance with the lentiviral techniques, and Mr Darren Smith and Mr Alex Robertson (Roslin Institute BRF) for their assistance with the animal studies.
Dissection scissors | World Precision Instruments | 14393 | Autoclave sterilise before use |
Dumont #5 tweezers | World Precision Instruments | 500342 | Autoclave sterilise before use |
Dumont #4 tweezers | World Precision Instruments | 500339 | Autoclave sterilise before use |
SuperFine Vannas scissors | World Precision Instruments | 501778 | |
Absolute ethanol | Fisher Scientific | E/0650DF/17 | Dilute to 70% v/v in dH2O |
α-MEM without nucleosides | Thermo Fischer Scientific | 22561021 | |
Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A3059 | |
Syringe filters (0.22μm) 33mm diameter | Merck Millipore | SLGP033RS | |
Phosphocholine chloride calcium salt tetrahydrate | Sigma Aldrich | P0378 | Add directly to the media prior to experimentation |
L-ascorbic acid-2-phosphate | Sigma Aldrich | A8960 | Make up stock soution at 5mg/ml and aliquot at -20°C |
Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C5080 | Make up stock soution at 150mM and aliquot at -20°C |
β-glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma Aldrich | G9422 | Make up stock soution at 1mM and aliquot at -20°C |
Gentamicin | Thermo Fischer Scientific | 15710049 | |
Amphotericin B | Thermo Fischer Scientific | 15290018 | |
Nunc cell-culture treated 24-well plates | Thermo Fischer Scientific | 142475 | |
Polybrene | Sigma Aldrich | H9268 | |
DAPI | Thermo Fischer Scientific | D3571 |