We present a protocol to dissect and culture embryonic day 15 (E15) murine metatarsal bones. This highly physiological ex vivo model of endochondral ossification provides conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture and is a vital tool for investigating bone growth and development.
The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or longitudinal bone growth. As such, it is imperative that we further our understanding of the underpinning molecular mechanisms involved in such disorders so as to provide advances towards human and animal patient benefit. The mouse metatarsal organ explant culture is a highly physiological ex vivo model for studying endochondral ossification and bone growth as the growth rate of the bones in culture mimic that observed in vivo. Uniquely, the metatarsal organ culture allows the examination of chondrocytes in different phases of chondrogenesis and maintains cell-cell and cell-matrix interactions, therefore providing conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture. This protocol describes in detail the intricate dissection of embryonic metatarsals from the hind limb of E15 murine embryos and the subsequent analyses that can be performed in order to examine endochondral ossification and longitudinal bone growth.
Skelettet är en mycket invecklad, dynamiska och komplexa organ som har en rad funktioner som spänner från förflyttning, till jon homeostas. Består av ben och brosk, skelettet består av funktionellt distinkta cellpopulationer som verkar för att bibehålla det strukturella, biokemiska och mekaniska integritet 1. En av de främsta funktionerna hos skelettet är dess roll i utveckling och tillväxt. Dessa processer kräver orkestreringen av flera cellpopulationer som regleras genom tät endokrina och genetisk kontroll.
Med undantag för den platta ben t.ex. skulderblad, kraniet och bröstbenet är däggdjurs skelettet bildas genom processen kallas endokondral benbildning. Denna process regleras både molekylärt och rumsligt, börjar med kondensering av mesenkymala celler härrör främst från mesoderm 2. Under påverkan av transkriptionsfaktorn SOX9 celler i the inre av förtätningar differentierar till kondrocyter, uttrycka och utsöndra broskspecifika extracellulära matrix (ECM) komponenter såsom kollagen typ II och aggrekan. Celler vid kanten av kondens, uttrycker typ I-kollagen och bildar perichondrium, avgränsar den blivande benet 3. Senare osteoprogenitors av perichondrium differentiera till osteoblaster, regisserad av uttrycket av transkriptionsfaktorer, Runx2 och osterix 4. Detta leder till en dominans av osteoblaster och detta skikt döps periosteum som bildar en mineraliserad benig krage runt den mellersta delen av benet. Vaskulär penetration av periostet och invasion av brosk ställningen sker för med sig, haematopoetically härledd benresorberande celler, osteoklaster, vilka resorberar de kondrocytceller rester och mycket av den broskmatrisen 5. Utrymmena bildade fylls av osteoprogenitors ger upphov till den primära benbildningcentrum som successivt upptar kärnan i diafysen och går samman med benhinnan. Andra celler ger upphov till benmärgen. Runt födelse, blodkärl och osteoprogenitors penetrera brosk rika matris på båda sidor (epifys) i utvecklings diafys att bilda den sekundära benbildning centrum. Beläget mellan epifysen och diafys i vardera änden av de långa benen är ett band av brosk – epifys tillväxtplattan – som är ansvarig för att samordna linjär tillväxt av alla långa ben 6.
Kondrocyter inom tillväxtplattan initialt föröka och därefter fortskrida genom morfologiskt distinkta zoner, som samordnas av sekventiell expression av transkriptions och tillväxtfaktorer. Kulmen på denna händelseförloppet är utträdet från cellcykeln och hypertrofi av kondrocyter i mitten av detta brosk föregångare. Hypertrofiska kondrocyter uttrycka starkt typ X kollagen och matrix-metalloproteinas-13 (MMP13) och deras betydande utvidgning volym i riktning mot längdtillväxt ger det största bidraget till bentillväxt hos däggdjur 7,8. Vidare hypertrofiska kondrocyter mineralize deras omgivande ECM genom frisättning av matris vesiklar, membran avgränsas strukturer specialiserade för framställning av amorft kalciumfosfat genom att införliva dem av fosfataser (vävnads ospecifik alkaliskt fosfatas (TNAP) och PHOSPHO1) och kalciums kanalisera proteiner (annexiner ) 9-11. Detta förkalkade brosk invaderas av blodkärl från den underliggande benmärgen resulterar i osteoklastrekrytering och matris resorption. Detta följs av osteoblastmigrering och anpassning till ytan av förkalkade brosk resterna där de fastställer ett lager av osteoid som är snabbt mineraliserad. Den vävda benet av den primära spongiosa senare ombyggda till lamellära ben av den sekundära spongiosa 12. Epifys fusionsresulterar iupphörande av endokondral benbildning 13.
Endokondral benbildning är under sträng reglering av många endokrina och parakrina hormoner och tillväxtfaktorer för att förhindra störd utveckling och / eller längsgående bentillväxt 14. En bättre förståelse av de molekylära och cellulära mekanismer som ligger till grund dessa processer är därför viktigt i vår strävan efter kliniska framsteg mot mänsklig nytta. Tidigare forskning på likheterna och skillnaderna mellan tillväxtplattor i olika åldrar, platser och arter har avsevärt förbättrat vår förståelse av de fysiologiska mekanismer som omger tillväxtplatt dynamik 15,16. Emellertid är studien av isolerade kondrocyter svårt, eftersom avlägsnande av kondrocyter från deras omgivning kan leda till dedifferentiering, tillsammans med förlust av expression av viktiga markörer såsom Col2a1 17.
Musen metatarsal organ Explantation kultur, pioneered av professor Elisabeth Burger och kollegor i Nederländerna, är en mycket fysiologisk ex vivo modell för att studera endokondral benbildning och bentillväxt som tillväxten av ben i kultur efterliknar den som ses in vivo 18. Unikt tillåter metatarsal organodling undersökning av kondrocyter i olika faser av kondrogenes och upprätthåller cell-cell och cell-matris-interaktioner, därför att skapa förutsättningar närmare in vivo situationen än celler i odling 19-21. Dessutom tillåter direkt undersökning av linjär bentillväxt vilket inte är möjligt i primära kondrocytceller kulturer denna modell. Det möjliggör också för separation av systemiska och lokala faktorer därför gör det möjligt att särskild analys av de lokala effekter på tillväxtplattan.
Kulturen i fotbenen tillåter för undersökning av ett stort antal parametrar. Dagliga mätningar av total längd och av de mineraliserade regionerna avgrunderna kan utföras med standard faskontrastmikroskopi och bildanalysmjukvara. Histologiska, in situ hybridisering och immunhistologisk färgning kan lätt utföras på mellanfots sektioner, vilket möjliggör den rumsliga upplösningen av både cellulära och molekylära enheter, en stor fördel jämfört med traditionella cellodlingsmetoder. Den immunohistokemiska strategi omfattar detektering och kvantifiering av 5-brom-2'-deoxiuridin (BrdU) upptag av prolifererande kondrocyter 22. Dessutom kan ytterligare bearbetning av metatarsal vävnader utföras för att möjliggöra efterföljande analys av mRNA-uttryck (RT-qPCR), protein och intracellulär analys signalering (Western blotting) eller lipidkompositionen (masspektrometri). De flesta studier hittills använda odlade embryonala fotbenen snarare än metatarsals från postnatala djur. Medan båda modellerna kan vara informativ, har studier av embryonala ben flera fördelar: de växer snabbare och kan vara explosad för att studera initieringen och utvecklingen av mineraliseringsprocessen 23-25.
Detta protokoll beskriver i detalj intrikata dissektion av embryonala fotbenen från den bakre delen av embryonala dag 15 (E15) murina embryon. Dessutom visas tillväxten och mineralisering av anatomiskt distinkta fotbenen.
Kulturen i murina embryonala fotbenen ger en mycket fysiologisk modell av endokondral tillväxt och mineralisering. Tidiga studier har bekräftat att E15 mus metatarsals genomgå ett normalt mönster av skelett tillväxt och differentiering. Brosket (kondrocyter) och ben (osteoblaster och osteoklaster) celler och deras respektive kollagen matriser är omöjlig att skilja från de som observerats in vivo. Det finns dock vissa erkända begränsningar av denna modell. Hastigheten på osteoklastdifferentiering försämras som är bentillväxt (men inte brosk differentiering). Bentillväxt är cirka 50% lägre än den som observerades in vivo och kan bero på brister i system faktorer som påverkar produktionen av lokala faktorer (t.ex. IGF-1, BMP, etc.) 31. Dessutom är det väl känt att ben är känslig för dess mekaniska miljö och detta är också fallet för odlade metatarsalerna, vilka svarar på cHanges i mekanisk belastning 32,33. Därför i obelastade situationer som beskrivs i detta protokoll, mineralisering och mineral resorption kan äventyras. Ändå erbjuder nämnda metatarsala modell förmågan att direkt mäta linjär bentillväxt vilket inte är möjligt via 2D och 3D i odlings vitro-system.
Vi har gett en omfattande beskrivning av protokollet involverade i dissekering och kultur E15 murina metatarsalerna och faktiskt för första gången bekräftar giltigheten av sammanslagning 2: a, 3: e och 4: e metatarsals för experiment.
Fotbenen från E17 / E18 används ofta för att undersöka mekanismerna för bentillväxt på grund av sin extraordinära potential att växa ex vivo under långa tidsperioder (dvs mer än 14 dagar i kultur). De är en väl etablerad modell för att undersöka rollerna av tillväxtfaktorer på embryonala längd bentillväxt.Dessutom är dissekering och kultur av postnatala metatarsalerna vanligtvis används för att avgränsa de mekanismer som omger postnatal bentillväxt, eftersom det är underförstått att postnatal bentillväxt och fetal bentillväxt regleras på olika sätt 21. Bentillväxt observeras i odlade postnatal fotbenen är dock betydligt mindre än den som observerades i embryonala grunderna 25,34, vilket begränsar deras potential i långtidsstudier och lyfta fram mer systematisk påverkan på bentillväxt i denna postnatal skede. I själva verket tre dagar gamla postnatal fotbenen från möss är vanligtvis det senaste steget som kan användas för att erhålla mätbar tillväxt 34.
Här beskriver vi våra protokoll för isolering av embryonala metatarsal ben på E15. Frånvaron av hydroxiapatit mineral i E15 metatarsal ben innebär att de ger en oöverträffad modell för att undersöka inte bara de mekanismer som omger längd bentillväxt, men också att inledaskelettmineralisering. Den mineraliserade matrisen av terminalen hypertrofisk kondrocyt zon ger en byggnadsställning för invaderande osteoblaster att fastställa ett ben specifik matris (osteoid) som därefter mineraliseras och som sådan denna inledande mineralisering är avgörande för ett framgångsrikt och funktionell benbildning 35. Faktum är att ett antal nya rapporter som använder E15 metatarsals har bekräftat sin unika förmåga för undersökning av mineraliseringsprocessen 28,36,37. Dessutom har forskare beskrivit användningen av E15 fotbenen som en modell av angiogenes 38, belysa potentialen hos embryonala fotbenen som modell utanför inställningen bentillväxt / mineralisering.
Det protokoll beskriver vi kräver endast standardlaboratorieutrustning som innefattar en huv med laminärt flöde, ett dissektionsmikroskop för utförande av dissektion, och en CO2-inkubator för odlingen av exciderade rudiment. Dessutom en mycket grundläggande culture medium innehållande aMEM, BSA, antibiotika, antimykotika och L-askorbinsyra (en co-faktor i syntesen av hydroxiprolin och hydroxilysin, två essentiella aminosyror för framställning av kollagen 39) undviker användning av odefinierade tillsatser, såsom djursera . Traditionellt har forskare lagt βGP till medier som används för att odla embryonala metatarsalerna men som avslöjas i våra resultat, inte är nödvändigt att använda en extra fosfatkälla för framgångsrik mineralisering i detta odlingssystem. Detta är ett viktigt fynd i vår strävan efter att förstå de mekanismer som ligger till grund ECM mineralisering.
Fotbenen har tidigare varit smittad med adenovirus som innehåller dominerande-negativa former av Smad2 att utforska rollen av transformerande tillväxtfaktor β i regleringen av långa ben utveckling 40. Här avslöjar vi också framgångsrika transfektion av vildtyp E15 metatarsal ben med GFP viruspartiklar, vilket tyder på thatt lentivirala tekniker skulle lätt kunna antas att manipulera genuttryck i metatarsal kulturer. På liknande sätt är nämnda metatarsala organodlingssystemet en utmärkt modell, i vilken för att jämföra tillväxten av ben från genetiskt förändrade möss för att bättre förstå vilken roll en viss gen i benet tillväxtprocessen. Våra tidigare studier har utnyttjat metatarsal organkultursystem för att bestämma vilken roll suppressor av cytokin signalering-2 (SOCS2) i endokondral bentillväxt. Med användning av metatarsal ben från mus med brist på SOCS2, har vi visat att tillväxthormonet kan simulera deras längdtillväxt oberoende av insulinliknande tillväxtfaktor (IGF-1), till skillnad från vildtyp metatarsal ben som inte svarar på behandling med tillväxthormon 34, 41. Detta visar i vilken utsträckning metatarsal kulturer kan manipuleras för att undersöka effekterna av olika gener och / eller exogena faktorer på endokondral bentillväxt.
Sammanfattningsvis har vi detailedde en metod för framgångsrik utvinning och odling av embryonala metatarsal ben som kan manipuleras och undersökas med hjälp av en mängd olika analyser. Detta ex vivo-modell bibehåller cell-cell- och cell-matris-interaktioner, liksom innehåller kondrocyter i olika faser av kondrogenes, därför ger en mer fysiologisk modell än celler i monoskikt eller 3D-kultur. Mellanfot organkulturer är därför en unik modell för att undersöka de molekylära mekanismer som ansvarar för endokondral benbildning, och är avgörande för att öka vår förståelse av både ben fysiologi och patofysiologi
The authors have nothing to disclose.
We are grateful to the Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) for funding DH (BB/J01446X/1), CF & VEM (Institute Strategic Programme Grant Funding BB/J004316/1). We also acknowledge Arthritis Research UK for funding to KAS (20413). We thank Miss Elaine Seawright for her assistance with the experiments detailed, Dr. Neil Mackenzie for his assistance with the lentiviral techniques, and Mr Darren Smith and Mr Alex Robertson (Roslin Institute BRF) for their assistance with the animal studies.
Dissection scissors | World Precision Instruments | 14393 | Autoclave sterilise before use |
Dumont #5 tweezers | World Precision Instruments | 500342 | Autoclave sterilise before use |
Dumont #4 tweezers | World Precision Instruments | 500339 | Autoclave sterilise before use |
SuperFine Vannas scissors | World Precision Instruments | 501778 | |
Absolute ethanol | Fisher Scientific | E/0650DF/17 | Dilute to 70% v/v in dH2O |
α-MEM without nucleosides | Thermo Fischer Scientific | 22561021 | |
Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A3059 | |
Syringe filters (0.22μm) 33mm diameter | Merck Millipore | SLGP033RS | |
Phosphocholine chloride calcium salt tetrahydrate | Sigma Aldrich | P0378 | Add directly to the media prior to experimentation |
L-ascorbic acid-2-phosphate | Sigma Aldrich | A8960 | Make up stock soution at 5mg/ml and aliquot at -20°C |
Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C5080 | Make up stock soution at 150mM and aliquot at -20°C |
β-glycerophosphate disodium salt hydrate | Sigma Aldrich | G9422 | Make up stock soution at 1mM and aliquot at -20°C |
Gentamicin | Thermo Fischer Scientific | 15710049 | |
Amphotericin B | Thermo Fischer Scientific | 15290018 | |
Nunc cell-culture treated 24-well plates | Thermo Fischer Scientific | 142475 | |
Polybrene | Sigma Aldrich | H9268 | |
DAPI | Thermo Fischer Scientific | D3571 |