Summary
パーキンソン病（PD）では、黒質（SNC）ドーパミン作動性ニューロンは、運動機能障害につながる、退化します。ここでは、チロシンヒドロキシラーゼ（TH）プロモーター配列によって駆動されるeGFPを発現するマウスから腹側中脳の神経細胞を培養する培養物から個々の蛍光ニューロンを収穫し、RNA-seqのを使用して、それらのトランスクリプトームを測定するためのプロトコルを報告しています。
Abstract
パーキンソン病（PD）で動作緩慢、硬直、振戦につながるのSNcにおけるドーパミン作動性ニューロンの顕著な変性と脳全体広まっ神経細胞の損失があります。蛍光マーカーを使用して、プライマリ腹側中脳（VM）の文化に住んでドーパミン作動性ニューロンの同定は、固定した細胞の免疫染色に頼ることなく、これらのニューロンの選択的脆弱性を研究するための代替方法を提供します。ここでは、単離、解離、および培養マウスVMニューロン3週間。私たちは、その後、（チロシンヒドロキシラーゼ（TH）プロモーターによって駆動される）eGFP蛍光を用いて、培養物中のドーパミン作動性ニューロンを識別します。個々のニューロンは、ガラスマイクロピペットを用いて、マイクロ遠心チューブに回収します。次に、我々は、採取した細胞を溶解し、単一細胞RNA-のSeqライブラリ1、2を生成するために、cDNA合成およびトランスポゾン媒介」tagmentation」を実施しますお尻= "外部参照"> 3、4、5。品質管理チェックを通過した後、単一細胞ライブラリーを配列決定され、その後の分析は、遺伝子発現を測定するために行われます。私たちは、個々のドーパミン作動性および中脳培養物から単離しGABA作動性ニューロンのためのトランスクリプトームの結果を報告します。私たちは、収穫し、配列決定したライブTH-EGFP細胞の100％がドーパミン作動性ニューロンであったことを報告しています。これらの技術は、神経科学および分子生物学において広範な用途を持つことになります。
Introduction
パーキンソン病（PD）は、不治の、年齢関連神経変性疾患です。この比較的一般的な障害の原因はよくわかっていないままです。脳全体広まっニューロンの損失は緩慢、硬直及び振戦の診断臨床的特徴につながる、黒質におけるドーパミン作動性ニューロンの顕著な神経変性（SNC）と、があります。
SNCドーパミン作動性ニューロンを含む初代混合培養物は、パーキンソン病のために特に関連しています。腹側被蓋領域（VTA）ドーパミン作動性ニューロンは報酬と中毒に関与しています。腹側中脳（VM）の一次混合胚の培養は、SNCとVTAのドーパミン作動性（DA）ニューロン及びGABA作動性ニューロンの両方を含みます。 VM初代培養物は、神経保護アッセイに有用であることができ、ドーパミン作動性ニューロンの選択的脆弱性を明らかにすること。形態に基づいて、培養中のドーパミン作動性細胞を同定する信頼できる方法はありません。彼再我々は特定し、収穫単一ドーパミン作動性ニューロンを、および単一セル、高収量RNAシーケンシングライブラリーを構築するための技術を開発します。
我々は、単一のドーパミン作動性および中脳培養物から単離しGABA作動性ニューロンのための代表的なRNAトランスクリプトームデータを報告しています。このプロトコルは、DA / GABAのトランスクリプトームの様々な治療の効果を研究するため、神経保護、神経変性、および薬理学的アッセイのために使用することができます。ドーパミン作動性ニューロンは、一次VM培養で発現したニューロンの少数を代表しているので、確実に生きている培養物中のこれらのニューロンを同定する能力は、単一細胞研究の強化された範囲を可能にします。これらの新規の技術は、細胞レベルで起こるメカニズムの理解の進歩を促進し、他の場所で神経科学と分子生物学の分野での用途を有することができます。
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Protocol
注：全ての実験は、国立衛生研究所により提供される動物の管理と使用に関するガイドラインに従って行った、およびプロトコルはカリフォルニア工科大学施設内動物管理使用委員会によって承認されました。
マウス胎児の脳からの初代ドーパミン作動性細胞培養の1導出
- ソリューションおよび培養培地
- アスコルビン酸原液の調製
- アスコルビン酸の352ミリグラムを秤量。滅菌H 2 Oを20 mLの最終総容量に追加します。 37℃の水浴に入れて溶解します。 -20℃で500μLずつ0.2μmシリンジ先端とストアを介してフィルタリングします。
- パパインストック溶液の調製
- 1×Hanks'-バランス塩溶液（HBSS）で15単位/ mLにパパインを希釈します。完全に混合するまでピペットダウン5回。解剖の日に準備します。
- DNA分解酵素原液の調製
- DNアーゼ20mgを秤量。滅菌H 2 Oを20mLの総最終体積に追加します。 0.2μmシリンジフィルターチップと滅菌フィルター。 1mLのアリコートで-20℃で保存。
- 停止液の調製
- 45 mLの1×HBSS中の10％に5 mLのドナーウマウマ血清を希釈します。 0.2μmシリンジフィルターチップと滅菌フィルター。 4℃で保存。
- 4％ウシ血清アルブミン（BSA）のストック溶液の調製
- BSAを2g秤量し、45mLの合計最終体積に、1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を加えます。 0.2μmシリンジフィルターチップと滅菌フィルター。 4℃で保存。
- メッキ媒体の作製
- 494 mLの培地に、L-アラニル-L-グルタミン（Lグルタミンの安定化されたソース）を含み、ドナーウマ血清5mLの1.25 mLの培養培地を加えます。 0.2μmシリンジフィルと殺菌フィルターター先端。 4℃で保存。
- 細胞培養培地の調製
- 196 mLのメッキ培地中に、4 mLのB27および200μLのアスコルビン酸を追加します。フィルタは、0.2μmのフィルターで滅菌します。 4℃でソリューションを保存し、一週間以内に使用します。
- 4％パラホルムアルデヒド（PFA）溶液の調製
注意：次のようにパラホルムアルデヒドを使用するための一般的な注意事項は次のとおりです、ヒュームフードを使用して皮膚や眼への接触を避けるため、蒸気の吸入を避けるため、熱や裸火から遠ざけます。適切な保護衣を着用します。 PFAは、したがって、取扱い後はよく手を洗う、感作および皮膚炎を引き起こす可能性があります。- 1×PBS、pH7.4中の30 mLに16％PFAの10ミリリットルを追加します。
- 0.1％トリトンX-100の調製
- 10％溶液を作るために9 mLの1×PBS中にピペット1mLのトリトンX-100。粘性溶液は、ピペットチップを埋めるためにできるようにするピペットゆっくり。 DISに37℃の水浴中で暖かいです解決する。 4℃で10％の株式を保管してください。
- 2連続1時10希釈を行うことによって、 例えば、（0.01％〜10％のストックを希釈：1％の溶液を作製するために9 mLの1×PBS中の10％溶液1mLを希釈し、1％溶液1mL 9 mLの1×PBSに行うこと0.1％溶液）。
- 10％の調製し、1％ロバ血清
- 10％溶液のための1×PBSの9 mLにロバ血清の1 mLを加え。 1％溶液のために1×PBS、pHが7.4の49.5 mLにロバ血清の0.5 mLを加え。
- 1×PBSの調製
- pHメーターを用いてpH 7.4に溶液のpHを調整する450 mLのH 2 Oの中に50ミリリットルを添加することにより1Xに10×PBSを希釈します。
- アスコルビン酸原液の調製
- 培養皿をコーティング
- ポリ-L-オルニチンコーティング
- コート無菌技術を用いて、120μL、ポリ-L-オルニチンを持つすべての35mm皿の中心部で唯一の10ミリメートルの直径のガラスボトム。 37℃で1時間インキュベートします。ポリローを吸引する真空吸引器を使用して、rnithine。滅菌H 2 Oで二回皿をすすぎます
- ラミニンコーティング（1mg / mlのストック濃度）
- 滅菌H 2 O（最終濃度は0.01mg / mL）を2mLで20μLのラミニンを希釈します。
- コート無菌技術を用いては0.01mg / mLに希釈したラミニンの120μLを有するすべての皿の中央にのみ直径10mmガラス底部、及び使用前に37℃で1時間またはO / Nインキュベートします。
- ポリ-L-オルニチンコーティング
- マウスの解剖
注：彼らは培養インキュベーターに胚嚢から転送されているように、この解剖のメソッドは、細胞の最小限の露出のために設計されています。細胞の生存率は、中脳の解剖のために脳の一部のみを除去することによって保存されます。領域にアクセスするために、脳全体を分析する必要なく、より迅速に、中脳進行の単離。本研究で用いたマウス系統のための材料の表を参照してください。 - 70％エタノールで安楽死させたマウスの腹部をスプレーします。 2×3歯とピンセットを用いて下腹部の皮膚をつかみ、鈍いブレード手術用はさみを使用して腹腔を開きます。それぞれの側に横方向に近位に移動する2カットを行います。腹腔を露出するために鉗子を使用して腹壁を超える倍。
注：子宮が今露出されています。胸膜腔と気胸の作成を公開するも、動物が回復しないことを保証します。 - 子宮を分離するために子宮角の両端をカットします。無菌フードでペトリ皿に置きます。
- それぞれの手にストレートチップピンセットを使用すると、胚嚢を開き、胚を削除します。迅速にピンセットで首に頭をつまんで首を切ります。背面がアクセスできるようにしっかりと鼻に置い鉗子で頭を安定させます。
- 他ヘクタールで開催された鉗子を使用してndは、単に脳の尾根の前に皮膚や頭蓋骨の層をつまみます。尾側正中線に沿って皮膚や頭蓋骨をバックピール。皮質と中脳と小脳を介して他の間に1つのチップで尾根の周りに鉗子を置きます。
- ピンチと尾側吻側側と小脳に前脳を残し、全体の中脳を削除します。解剖顕微鏡下で冷HBSSでペトリ皿に置きます。
- 残りの胚のための手順を繰り返します。
- 腹側にアクセスできるようになったように、解剖顕微鏡下で、脳のセグメント裏返し。今4象限見えるがあります。優しく髄膜を把握し、上向きに離れて脳から引いて、髄膜及び血管系のすべてを削除します。
- 中脳を分離しながら、脳のセグメントを安定化するために鉗子を使用してください。セグメントのほぼ中央に心室に鉗子の1トングを置きます。私を指して、第1のピンチ背を作りますディッシュNtoに、その後内側にそれぞれの側に。両側の横方向のカットを行うことで、下2つの象限を取ります。
注：目的の組織が密表示され腹劣る部分、です。この領域は、VTAとのSNcの両方が含まれています。 - 密度が低い組織をトリミングして、捨てる：これは優れたと下丘を含んでいます。ペトリ皿の別の領域に新鮮なHBSSでVTAとのSNcの両方を含む解剖組織を置きます。
注：マウスの脳の発達のこの段階（E14）で、腹側中脳内の関心領域は、不確帯および他の視床下部の細胞群から心室によって分離されています。発展途上の胚性マウス脳のより細長い構造は、成体マウスの脳内で互いに近接して配置されているこれらの領域間の区別を可能にします。 - 残りのすべての脳のセグメントに対して繰り返します。
- すべての脳のセグメントが解剖された後、四半期のEAに鉗子と11番メスを使用ほぼ同じ大きさの小片にchの中脳セクション。
- 細胞の酵素処理
- HBSS中のすべての4分割中脳のセグメントを取るし、15 mLコニカルチューブにそれらを配置するために広い口径P1000ピペットチップを使用してください。セグメントは、チューブの底に沈殿し、宿舎の作品で取り上げてきたHBSSを削除してみましょう。
- チューブにパパイン溶液500μLを加え、15分間37℃の水浴中に配置します。 7.5分後にチューブをフリック指で細胞を再懸濁し。
- デオキシリボヌクレアーゼI（DNアーゼ）溶液1mLアリコートにのみ、中脳のセグメント広口径P1000チップ、ピペットを使用して。セグメントは、チューブの底に沈殿することを可能にします。
- ワイドボアP1000チップを使用して、すすぐために冷たい停止液1 mLを含む15 mLのチューブにのみ、中脳のセグメントを転送します。セグメントは、チューブの底に沈殿してみましょうとのすすぎを繰り返しますCEより。
- 細胞懸濁液の機械的粉砕して
- 新鮮な停止溶液及びピペットアップの1ミリリットルとの最後のすすぎを交換し、ダウン7X P1000ピペットチップで細胞を摩砕します。細胞溶解を最小限にするために、過度の摩砕を避けます。
- ゆっくりとチューブの底部に4％BSA溶液の200μLをピペットで細胞懸濁液を下敷き。慎重に細胞懸濁液層の中断を避けるためにピペットチップを撤回。 6分間280×gで遠心分離した後、P1000で上清を吸引し、培地をメッキ1mLの細胞を再懸濁。
- 血球計数器を用いて細胞数を実行します。プレーティング培地に、1,000細胞/μLに細胞懸濁液を希釈します。
- 真空吸引器を使用して、最大でも3皿のバッチで、コーティングされた皿からラミニンを吸引。プレート120μL（1.2×10 5細胞/皿（78.5ミリメートル2
- 1時間後、慎重に細胞の破壊を最小限にするために培養皿の播種していない領域に、培養培地3mlを加えます。
- 3週間3日間隔で細胞培養皿上の完全な培地交換に半分を実行します。
RNAの配列決定のための2.収穫培養、ドーパミン作動性ニューロン
注：細胞を収穫し、単一細胞RNA配列決定プロトコールの概要を、図1に示されています。
- 実験の日の前に実行する手順
- 15分間蒸留H 2 Oに再び15分間100％エタノール中で超音波処理によって清浄なホウケイ酸ガラスキャピラリーチューブ。チューブをドレインおよびRNaseを不活性化するために200℃のオーブンで一晩焼きます。
- たて開い使用RNaseフリーのピペットチップは、微小遠心管中でRNase阻害剤溶液1μL（20μL総容積）でシークエンシングキットから10倍の溶解緩衝液19μLを混合することにより、10×反応緩衝液のストック溶液を調製しました。簡単にマイクロ遠心機を用いて混合物をスピンダウンし、氷上に保ちます。
- 個々の0.2mLのPCRチューブ（収穫ニューロンを収集するために使用される）のそれぞれに10×反応緩衝液の2μLを追加します。適切なタグを回収し、ストアは4℃で凍結するニューロンを特定してチューブにラベルを付けます。
- 実験の日に実行する手順
- 収穫ピペットの作製。
- 微小電極プラーとマイクロフォージのガラスでコーティングされた加熱フィラメントを使用して焼いた毛細管から - （8μmの2）大先端径のマイクロピペットを引き出します。長いテーパー付きマイクロピペットを形成するために、プラーを設定します。較正された接眼レンズの目盛りとハイパワーOBを搭載したマイクロフォージを使用してください（ - 20〜10μm程度）は、所望のチップサイズにマイクロピペットの先端を破ることjective。
- マイクロフォージピペットホルダーにマイクロピペットを固定し、マイクロフォージにホルダーを取り付けます。それを加熱するフィラメントに電流にマイクロフォージとスイッチの機械的マニピュレーターを用いてガラスでコーティングされた加熱フィラメント上記焦点にマイクロピペットの先端を持参してください。加熱されたフィラメントにピペットチップをタッチします。ピペットチップは、適切な直径に溶融している電流をオフにします。
注意。電流を遮断すると、フィラメントは下向きに急に移動し、所望の直径を持つ大規模な、オープンひっくり返したピペットを生成する、ピペットチップから切り離すことになります。 - 必要になるまで密閉箱に完成マイクロピペットを保管してください。
- ニューロンを収穫。
注意。培養ニューロンは、以前に公開されたプロトコル6の修正バージョン以下収穫しました。- 徹底的CL水リンス、続いて液体消毒剤と水を使用して、文化の料理や収集チューブと接触する細胞収穫部屋の全ての表面をEAN。 80％エタノールとその後のRNase阻害剤を注入したワイプで消毒表面を拭いてください。
- 氷で2本の絶縁容器、レギュラー（水）氷とドライアイスで別のものを入力します。定期的な氷の上に10×反応緩衝液2μLで以前に満たされた0.2 mLのPCR採取チューブを置きます。
- インキュベーターから神経細胞を含む培養皿を外し、皿から培地をドレイン、RNaseフリーのダルベッコPBS（DPBS）2mLで洗浄し、収穫のためにDPBS 1mLで交換してください。
- 40X位相目的、Hgランプ、およびGFPフィルターセットを備えた倒立、落射蛍光顕微鏡を用いて、一次中脳培養物における蛍光、TH陽性ニューロンを特定します。
- 電動式または手動のマイルを使用して、細胞体の上にピペットを置きcromanipulator。マイクロピペットホルダーの側ポートに接続されているプラスチックチューブを介して口から適用穏やかな吸引を用いてガラスマイクロピペットにニューロンを吸引。すぐに入浴液から細胞を含むマイクロピペットを削除します。
- 反応緩衝液を含む0.2mLのPCRチューブのコレクションの内部にピペットチップを配置し、底部近くに、チューブの側面に先端を破ります。マイクロピペットの背面に滅菌21 G注射針を配置し、外向きの圧力を適用することによって、マイクロピペットの壊れた先端から - （1.5μL0.5）残りの流体を排出します。
- デスクトップマイクロ遠心機を用いて5秒間コレクションチューブを遠心し、ドライアイスでそれを凍結します。 -80℃で単一細胞を含むコレクションチューブを保管してください。典型的には、5個の細胞を周囲温度で1時間かけて皿ごと回収します。
- 収穫ピペットの作製。
3.単一細胞RNA-のSeqライブラリの生成
- <第1鎖cDNAの李>ジェネレーション
- PCRキャビネットに氷上で以下の試薬を持参してください。 （2μL5X第一鎖緩衝液、0.25μLDTT（100mMの）、1μLのdNTPミックス（10 mM）の、1μLのオリゴヌクレオチド：PCRキャビネットに室温で以下の試薬を組み合わせることで、第一鎖マスターミックス+ 10％を準備12μM）、0.25μLのRNase阻害剤、及び1μL転写酵素（100単位）を逆にします。これは、逆転写酵素マスターミックス（反応あたり5.5μLの総容量）です。
- ドライアイスで-80℃からサンプルを取り、PCRキャビネットにもたらします。単一細胞サンプルに以下を追加します：1μL3 'プライマー1と1μLのRNAスパイクを定量化しました。 72℃のホットリッドサーマルサイクラーのプリセットにチラーブロックにサンプルを持参してください。
- 72℃で3分間、サーモサイクラーにチューブをインキュベートし、その後、PCRクーラーラックにサンプルを置きます。各反応管に（ステップ3.1.1から）マスターミックスの5.5μLを加え、穏やかにピペッティングして混ぜます。 10分間42℃で90分間、70°C：5秒間0.2μLチューブをスピンし、以下のようにサーモサイクラー中でインキュベートします。 4℃で保持します。
- 増幅された第1鎖cDNAの精製。
注：PCR増幅したcDNAを磁気ビーズ上に固定化することにより精製しました。 0.2 mLチューブ用の磁気分離装置を使用してください。- 1.5 mLのチューブに磁気ビーズを等分。各使用の前に、少なくとも30分間室温にビーズのアリコートを持参し、分散させるためによく混ぜます。渦磁気ビーズを均一に混合するまで。
- 各試料に磁性ビーズの25μLを追加します。完全に混合するには、上下に少なくとも10倍のボリューム全体をピペットで混ぜます。ビーズにcDNAのバインドをできるように8分間RTでインキュベートします。
- PCRマスターミックスの調製
- ADDITを持つすべての反応のためのds-cDNAの増幅PCRマスターミックスを調製しますional 5μLの10×PCR緩衝液を混合することにより10％、2μLのdNTPミックス（10 mM）の、2μLPCRプライマー2（12μM）、2μL50×2ポリメラーゼミックス、および39μLのヌクレアーゼフリー水（50μL総容量/反応）。
- ファーストストランドの増幅
- 液体が完全に透明になるまで、磁気分離装置≥5分のサンプルや磁気ビーズを配置し、上清中に残されたビーズはありません。
- 分離装置に試料を維持、上清をピペットで廃棄します。チューブの側面から液体を収集するために、5秒間のサンプルをスピン。その後、P10ピペッターで残りのすべての上清を除去し、30秒のための磁気分離装置に試料を置きます。
- 前のステップからのビーズに結合したDNAを含む各チューブにPCRマスターミックスの50μLを追加します。加熱蓋付き予熱したサーマルサイクラー（95°C）にチューブを置きます。次PROGRAを使用して熱サイクルを開始メートル：95℃1分、30秒、15秒、65℃95℃の26サイクル、68℃で6分間。その後、72℃で10分。 4℃で保持します。
注：詳細については、シークエンシングのユーザーマニュアルを参照し、サンプルの設定を最適化します。
- 増幅された二本鎖cDNAの精製
- 各サンプルにビーズの90μLを追加します。完全に混合するには、上下に少なくとも10倍のボリューム全体をピペットで混ぜます。ビーズにcDNAのバインドをできるように8分間RTでインキュベートします。液体が完全に透明になるまで、≥5分間磁気分離装置に試料を加えたビーズを置き、上清中に残されたビーズはありません。
- サンプルは、磁気分離装置でありながら、上清を除去し、廃棄します。磁気分離装置に試料を保管してください。ビーズを乱すことなく各サンプルに新たに調製した85％エタノール140μLを追加します。 30秒間待ちます。上清をオフにピペット。 cDNAは、BEAにバインドされたままになります洗浄プロセス中DS。
- もう一度エタノール洗浄を繰り返します。
- 簡単に言えばチューブの側面から液体を収集するために、サンプルをスピン。 30秒のための磁気分離装置に試料を置き、その後、ピペットを用いて、残りのすべてのエタノールを除去。ペレットが乾燥し、もはやピカピカになるまで（亀裂が表示されますつまり前に）2.5分- 2室温でサンプルを置きます。
注：それはちょうど乾燥しているだけになるまで、ペレットを乾燥させます。ペレットは無い輝きとマットになります。ペレットが乾燥していない場合には、エタノールが増幅されたcDNAの回収率及び収率を低下させるであろう、サンプルウェルに残ります。ペレットは、過乾燥している場合は、ペレットに亀裂が存在することになります。これは、再水和するために長い2分以上かかりますし、増幅されたcDNAの回収及び歩留まりを低下させることができます。 - ビーズが乾燥したら、ビーズペレットをカバーするために溶出バッファーの22.5μLを追加します。磁気分離装置からサンプルを取り出して、ビーズを再懸濁するために十分に混合します。に10分間RTでcubateは、再水和します。
- チューブの側面から液体を収集するために、5秒間のサンプルをスピン。溶液が完全に透明になるまで、≥1分間バック磁気分離装置に試料を置きます。
注：ビーズの小集団は、インキュベーション中に磁石に対してペレット化しない場合があります。上清と再懸濁し、その後、（既存のペレットを中断せずに）ビーズの残りの部分は、既にペレット化している磁石に向かって、それらをピペットするには、上下これらunpelletedビーズをピペット。 - 何のビーズが上清中になくなるまでインキュベーションを続けます。ヌクレアーゼフリー、低接着チューブに、各チューブから精製されたcDNAを含む透明な上澄み液を移します。 -20℃でサンプル情報と店舗との各チューブにラベルを付けます。サンプルは、無期限に-20℃で保存することができます。
- DNA濃度およびフラグメントサイズの測定
- 1μLアルを定量することにより、品質管理チェックを行います蛍光光度計でのcDNAのiquot。 DS-cDNAを電気泳動システムを用いて、（1で説明したように）の1μL（3 NG）を評価します。
- DNAの断片化
注：DNAサンプル調製キットを使用してください。- チューブにcDNAの20μL（35 ngの合計）を追加します。 Tagment DNAの25μL（TD）のcDNAを含むチューブにバッファを追加します。
- チューブにTDE1（Tagment DNA酵素）の5μLを追加します。アップピペットと10倍のダウンミックスします。各サンプルの新鮮なヒントを使用してください。 1分間20℃で280×gで遠心分離します。
- 加熱蓋付きサーマルサイクラーにサンプルを置き、でそれを実行します。55°C、5.5分。迅速に50μLQG溶液（ゲル抽出キット）を追加します。アップピペットと10倍のダウンミックスします。次のステップに直接進みます。
- 断片化DNAの精製
- ミックスするビーズ、ピペット上下10倍の170μLを追加します。それが10分間静置します。磁石上にチューブを入れてください。チューブを10分間磁石上に座ってみましょう。サンプルは、磁気分離装置でありながら、上清をピペットで廃棄します。
- 磁石上にチューブを残し、85％エタノール200μLを加えます。エタノールを除去した後、30秒間座ってみましょう。エタノール洗浄を繰り返します。 RTでチューブ千×gでスピン。
- 背面磁石にチューブを入れてください。任意の残留エタノールをオフにピペット。サンプルは室温で15分間乾燥させます。
- ゲル抽出キットから溶出緩衝液の21μLを追加します。チューブを混合する磁石、ピペットアップおよび10倍のダウンをオフに座ってみましょう。チューブを室温で15分間座ってみましょう。
- 5分間磁石にチューブを返します。新しいチューブに溶液（精製されたDNA）のピペット20μL。
- タグ付けと断片化したDNAのPCR増幅
注：このステップで精製したDNAは、制限されたサイクルのPCRプログラムを介して増幅されます。 PCR工程は、インデックス1（I7）とインデックス2（I5）と同様に、共通アダプタ（クラスタ生成及び配列決定のために必要な）（P5とP7）を追加します。 DNAのを参照してください。詳細については、十分な準備ガイド。- 新しいチューブでは、インデックス2のプライマーの5μL（白キャップ）を追加します。新しいピペットチップを使用すると、インデックス1プライマー（オレンジキャップ）の5μLを追加します。各チューブにPCRマスターミックスの15μLを追加します。
- 各チューブにPCRプライマーカクテルの5μlを添加します。チューブに精製されたDNAの20μLを追加します。静かにアップピペットと3ダウン - 5回。
- 3分間、30秒で30秒、10秒、98℃での5サイクル、63°Cのために、3分間72℃を72°C 98°C：サーモサイクラー上で以下のプログラムを用いてPCRを行います。 10℃で保持します。 PCRクリーンアップにすぐに進むか、最大2日間4℃でサンプルを保存します。
- 増幅されたDNA断片の精製
- RTにビーズを持参してください。新鮮な85％のエタノールを準備します。 PCR装置の外にサンプルを取り、簡単にスピンダウン。
- チューブにビーズの30μLを追加します。静かにピペットミックス上下10倍。チューブは5分間室温で放置します。プレイスBAC5分間磁石上にk個。磁石にチューブで上澄み液を廃棄し、ピペットを使用しています。
- 各チューブに85％エタノール200μLを追加します。 30秒後にピペットエタノールオフ。 85％のエタノール洗浄を繰り返します。 30秒後にピペットエタノールオフ。
- 磁石にまだチューブとキャップを開いた状態で、15分間空気乾燥にビーズを許可します。磁石からチューブを外します。
- 溶出バッファーの32.5μLを追加します。静かにアップピペットと10倍ダウン。 15分 - 10のための磁石をオフにインキュベートします。
- 2分間磁石にチューブを返し、または上清をクリアしたまで。慎重に新しいチューブに上清の30μLを移します。
- DNA濃度およびフラグメントサイズの測定
- 蛍光光度計のcDNAの1μLのDNA濃度を定量することにより品質管理チェックを行っています。電気泳動によるDNAのフラグメントサイズを決定します。 DS-cDNAの1μL（3 NG）を評価します。
- シークエンシング
- シークエンシング施設に単一細胞RNA-のSeqライブラリを持参してください。 100 bpの塩基配列決定は、以前に公開されたプロトコル4以下のシーケンサに読み込む生成します。
注：各シーケンシングライブラリが一意にマッピングが読み込み>2000万を生成します。
- シークエンシング施設に単一細胞RNA-のSeqライブラリを持参してください。 100 bpの塩基配列決定は、以前に公開されたプロトコル4以下のシーケンサに読み込む生成します。
注：以下の手順についての市販のシークエンスキットからの試薬を使用しています。
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Representative Results
ここでは、チロシンヒドロキシラーゼプロモーター配列によって駆動されたeGFPを発現するマウスから腹側中脳の神経細胞を培養する培養物から個々の蛍光ニューロンを収穫し、RNA-seqの（ 図1）を使用して、それらのRNAトランスクリプトームを測定するためのプロトコルを報告しています。データを収集し、配列決定したTH-EGFP陽性細胞の100％は、次の3つのDA関連遺伝子の転写物の存在、TH、ドーパデカルボキシラーゼ（DDC）、およびドーパミン輸送体DATに基づいて、ドーパミン作動性ニューロンであることが示されました（SLC6A3）。 RNA-のSeqによって評価されるように、TH-EGFP陽性細胞のすべては、これらの3つの遺伝子を発現しました。各単一細胞RNA-のSeqライブラリーでは6000 - 8000タンパク質をコードする遺伝子は、（ 図2）を検出しました。ドーパミン作動性ニューロンは、ロバストに、いくつかのニコチン性アセチルコリン受容体（nAChR）サブユニット（ 表1）に加えて、ドーパミン関連転写物を発現します。我々はありませんことを観察しましたトンTHたGABA作動性のために陰性であった細胞のすべて。したがって、我々は、RNA-seqのことで評価されるようにGAD1転写物の存在に基づいてGABA作動性などの細胞を定義しました。我々はGABA作動性ニューロンのように定義された細胞は、ドーパミン関連転写物を発現しないが、前述のようにすると、GABA合成、GAD1のための主要な遺伝子を発現ありません。単一セルライブラリはまた、チャネル、受容体、核タンパク質、ヒストン、オルガネラのタンパク質、及び転写因子をコードする長い非コーディングRNA、ならびに転写物を明らかにしました。
個々のニューロンにおける図1. RNA-のSeq、プライマリTH-EGFPマウスの中脳の文化に私たちの実験で行いました。 3週間（1）文化TH-EGFPマウス腹側ニューロン。 （2）水銀光源とFITC / GFPフィルターを使用して、エキサイティングなGFPによって蛍光単一ニューロンを特定します。 （3）のWi位相光学系の下で、同じ対物レンズ40倍番目、単一ニューロンを可視化し、正確にピペットを配置します。 （4から5）ガラスマイクロピペットに吸引する単一のセル。画像は収穫後の細胞を示しています。（4）フェーズ40X。 （5）eGFP蛍光。 72℃でのオリゴdTプライマーとの溶解緩衝液（6）を溶解細胞。 （7）cDNA合成。 26サイクルの増幅。 cDNAの（8）トランスポゾン媒介」tagmentation」。 （9）のcDNA品質管理チェック及び多重シークエンシング。トップハット、カフスとCuffdiff 7を用いて、（10）以降のコンピューター分析。発現された遺伝子の相対的存在量は、（FPKM）読み取りマッピングされた百万あたりの転写物のキロベースあたりのフラグメントの単位で測定しました。 RNA-seqのの目標は、細胞とそれらの相対的な量で発現する遺伝子のリストを提供することにあります。画像（2から4）は、現在の WORからですK、（6から10）は 、以前の報告1から変更されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図 2。 TH-EGFP陽性細胞から生成された単一ドーパミン作動性RNA-のSeqライブラリーで検出されたタンパク質をコードする遺伝子の数。 6,000 - 8,000タンパク質遺伝子は、単一のセルライブラリで検出されました。 FPKMは：マッピングされた百万あたりの転写物のキロベースあたりの断片は、（FPKM）を読み出します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 遺伝子 | DA単セルのn = 10 | GABA作動性単セルのn = 7 |
| FPKM（平均±SEM） | ||
| TH | 4714±764 | 1.2±0.14 |
| DDC | 779±167 | 0.8±0.1 |
| SLC6A3 / DAT | 506±144 | 0.5±0.04 |
| DRD2 | 14±8 | 0.1±0.004 |
| chrna6（α6） | 174±57 | 0.0 |
| CHRNA4（α4） | 17±5 | 26.4±2.3 |
| CHRNB2（β2） | 9±3 | 17.3±1.2 |
| chrnb3（β3） | 38±13 | 0.0 |
| GAD1 | 0.0 | 959.0±70.0 |
| HTR3A | 0.0 | 0.6±0.01 |
| HTR3B | 0.0 | 0.0 |
表1.ドーパミン関連VentrMidbrain培養で21日目にし、ドーパミン及びGABA作動性ニューロンでのnAChR遺伝子転写産物。 TH-EGFP陽性および陰性ニューロンのためのRNAを、配列番号データが示されています。単一細胞が21、RNAのSeqデータがTH-EGFP陽性ニューロンは、チロシンヒドロキシラーゼ（TH）、ドーパデカルボキシラーゼ（DDC）、ドーパミン輸送体DAT（SLC6A3）を含む、DA関連遺伝子の転写の高いレベルを持っていたことを示した培養日目に採取しましたα6、α4、β2及びβ3を含む、およびニコチン性アセチルコリン受容体（nAChR）サブユニット。しかしながら、これらの細胞は、GABA作動性マーカー遺伝子グルタミン酸デカルボキシラーゼ1（GAD1）およびセロトニン5-HT3受容体AおよびBサブユニット（HTR3AとHTR3B）の低いレベルを有していました。 GABA作動性ニューロンはありませんから低いレベル持っていますDA関連遺伝子の転写産物、chrna6、chrnb3、およびHTR3A / Bのが、GAD1の高いレベルを持っています。 RNA-SEQ（Cuffdiff）データは、ドーパミン関連、GABA作動性、ニコチン性受容体、およびセロトニンの転写のために示されています。 FPKMは：マッピングされた百万あたりの転写物のキロベースあたりの断片は、（FPKM）を読み出します。
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Discussion
ここでは、単一細胞RNA-seqの各セルを研究、蛍光タグを使用して、不均一な集団から単一細胞を単離。私たちは、私たちが収穫し、配列決定し、ライブTH-EGFP細胞の100％は、次の3つのDA関連遺伝子の転写産物、TH、DDCおよびSLC6A3の存在に基づいて、実際にドーパミン作動性ニューロンであったことを報告しています。 RNA-のSeqによって評価されるように、TH-EGFP陽性細胞のすべては、これらの3つの遺伝子を発現しました。これは、各TH-EGFP細胞はまた、ドーパミン作動性ニューロン8、9に関連付けられているイオンチャネルのレパートリーを表示することが示された電気生理学的研究と一致しました。このプロトコルでは、我々は、ライブドーパミン作動性ニューロンのための信頼できるマーカーとしてGENSATチロシンヒドロキシラーゼ-EGFPマウス系統10を利用しました 。 WT文化では現在、それらの形態に基づいて生きてドーパミン作動性ニューロンを識別するための信頼できる方法はありません。アイデンにおける当社の豊富な経験にもかかわらず、tifyingと3つしか収穫疑われるドーパミン作動性細胞の10のうち、野生型培養において、ドーパミン作動性ニューロンからの記録ドーパミン作動性ニューロンでした。さらに、当社はない、すべてのTH陰性であった細胞のは、GABA作動性であったことを観察しました。 RNA-seqのことで評価されるように我々は、GAD1転写物およびDA関連転写物の有無に基づいて、GABA作動性などの細胞を定義しました。
ドーパミン作動性ニューロンは、一次VM培養で発現したニューロンの少数を代表しているので、確実に生きている培養物中のこれらのニューロンを同定する能力は、利用可能な単一細胞研究の範囲を向上させます。このプロトコルは、ドーパミン作動性トランスクリプトーム上の様々な治療の効果を研究するために神経保護、神経変性、および薬理学的アッセイのために使用することができます。また、1は免疫組織化学的、電気生理学、バイオフォトニック11のためにこのプロトコルを使用することができ、原理的には、プロテオミクスアッセイ。ザSEのアッセイは、パーキンソン病や中毒の研究に特に有用です。しかし、もちろんGENSATマウスまたは同様に標識されたマウスの類似のプロトコルは、他の疾患状態または稀である細胞のために使用することができます。また、このプロトコルは、与えられたニューロンのサブタイプ内の不均一性の新興ビューを提供します。
以前の研究では、単一の細胞を収穫した後、我々はPBSに直接置かれ、しかし今、私たちは反応バッファーに直接採取し、単一のセルを配置します。各ライブラリで検出された遺伝子の数によって評価されるようにこれは、より良い品質のRNA-のSeqライブラリになります。技術の主な制限の一つは、蛍光細胞が必要とされているタグが付けられています。先に述べたように、形態に基づいて混合培養における特定の細胞型を識別するために、真に信頼できる方法はありません。細胞特異的な蛍光またはCreを発現マウス系統の大規模な範囲は、現在、多くの場合、適切にマークされた細胞を提供します。しかし、ケア笙適切な蛍光マウス系統を選択する際に、トランスジェニックマウス系統の大規模な研究は、TH-Creをノックインマウス系統は非ドーパミン性のセル12に導入遺伝子の発現を顕著に示すことが見出さようULDが取られます。
さらに、今後の実験で最適化される必要があるかもしれない別のステップは、マイクロピペットの所望の先端サイズがあります。将来の実験は、ドーパミン作動性ニューロン以外の細胞型の使用が含まれている場合、マイクロピペットチップのサイズは、目的の細胞のために最適化される必要があるかもしれません。
RNA深いシーケンシング、マイクロアレイよりも強力な手法です。 RNA-SEQが良いランツーラン再現性を提供します。検出されたダイナミックレンジは、細胞内の実際の転写産物量に匹敵します。一つは、選択的スプライシング形態及び新規アイソフォームを検出することができます。参照遺伝子ない試料のデノボ分析が可能です。新たな参照遺伝子が発見された場合、データはのために再分析することができます再び13ウェット作業実験を実行することなく、特定の遺伝子（複数可）。
要約すると、我々は、回収し、配列決定したライブTH-EGFP細胞の100％がドーパミン作動性ニューロンであったことを報告しています。この技術は、急性解離またはGENSATマウスからの長期培養ドーパミン作動性ニューロン識別する他のレポートを拡張して14、15、および技術は、神経科学および分子生物学において広範な用途を持つことになります。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | |
| Hanks-balanced Salt Solution (HBSS), 1x | Gibco | 14175-095 | |
| Donor Equine Serum | Thermo Scientific | SH30074.03 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030-50G | |
| Medium: Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Culture media that contains a stabilized form of L-glutamine, L-alanyl-L-glutamine: GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 0.5 mM final concentration. |
| L-Ascorbic acid | Sigma | A7506 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | 50x stock solution, 1x final concentration. |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek | P35GC-1.5-10-C | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P4957 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | Stored at -20 °C in 20 µL aliquots |
| Deoxyribonuclease I (DNase) | Sigma | DN25 | |
| Blue pipette tips P1000 | Sorenson Bioscience | Inc. 10130 | |
| 10 mm shallow Petri dish | VWR | 25384-324 | |
| 37 °C Water bath | |||
| 37 °C, 5% humidity incubator | |||
| 16% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| Donkey serum | Equitech | SD-0100HI | 100% stock solution, 1% final concentration. |
| Standard Pattern surgical scissors | Fine Science Tools | 14000-14 | |
| Forceps - 2x3 teeth | Fine Science Tools | 11022-14 | |
| Forceps - Dumont #55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Forceps - Dumont #5 | Fine Science Tools | 11252-23 | |
| 10x PBS, pH 7.4 | Gibco | 70011-044 | |
| Dulbecco's Phosphate-buffered solution (DPBS) 1x | Gibco | 14190-144 | 500 mL |
| 21 G needle | BD PrecisionGlide Needle | 305167 | 100 needles |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | model P-87 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285 | |
| Sequencing Kit: SMARTer Ultra Low RNA Kit for Illumina Sequencing | Clontech | 634936 | 100 rnxs,incl Advantage2PCR Kit |
| oligonucleotide (12 µM): SMARTer IIA oligonucleotide (12 µM) | From the SMARTer Kit | ||
| Reverse transcriptase (100 units) | SMARTcribe reverse transcriptase | From the SMARTer Kit | |
| Primer 1 | 3’ CDSIIa primer | From the SMARTer Kit | |
| Primer 2 | IS PCR primer | From the SMARTer Kit | |
| 50x 2 polymerase mix | 50x Advantage 2 polymerase mix | From the SMARTer Kit | |
| 10x PCR buffer | 10x Advantage 2 PCR buffer | From the SMARTer Kit | |
| RNA Spikes | ThermoFisher | 4456740 | |
| PCR cooler rack | IsoFreeze PCR cooler rack | ||
| DNA Sample Preparation Kit | (Illumina/Nextera) Nexter | FC-121-1030 | 24 Samples |
| PCR master mix | Nextera PCR master mix (NPM) | From the Nextera Kit | |
| PCR primer cocktail (PPC) | Nextera PCR primer cocktail (PPC) | From the Nextera Kit | |
| Fluorometer | The Qubit ThermoFisher | Q33216 | |
| HS DNA BioAnalyzer kit | Agilent | 5067-4626 | 110 rxns |
| Electrophoresis system | Agilent 2100 Bioanalyzer. | G2938C | |
| Magnetic beads: Agencourt AMPure | Beckman Coulter | A63880 | 5 mL |
| RNAse wipe: RNAse Zap wipes | Ambion | AM9786 | Size 100 Sheets |
| Qubit ds HS Assay Kit | Molecular probes | Q32854 | 500 assays |
| Gel extraction kit: Qiaquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Glass capillary tubing | (Kimax-51, 1.5 - 1.8 mm o.d.) | ||
| Microforge | Narishige (or equivalent) | ||
| Sequencer | Illumina HiSeq instrument | ||
| GENSAT tyrosine hydroxylase-eGFP mouse strain | MMRRC stock number: 000292-UNC | Stock Tg(Th-EGFP)DJ76Gsat/Mutant Mouse Regional Research Center |
References
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