Summary
Vid Parkinsons sjukdom (PD), substantia nigra (SNC) dopaminerga neuroner degenererar, vilket leder till motorisk dysfunktion. Här rapporterar vi ett protokoll för odling ventrala mitthjärnan nervceller från en mus som uttrycker EGFP drivs av en tyrosinhydroxylas (TH) promotorsekvens, skörda enskilda fluorescerande nervceller från kulturerna, och mätning av deras transkriptom med hjälp av RNA-punkter.
Abstract
Vid Parkinsons sjukdom (PD) det finns en utbredd neuronal förlust i hela hjärnan med uttalad degeneration av dopaminerga neuroner i SNC, vilket leder till bradykinesi, stelhet och skakningar. Identifieringen av levande dopaminerga neuroner i primära Ventral mesencefala (VM) kulturer med hjälp av en fluorescerande markör ger ett alternativt sätt att studera den selektiva sårbarhet dessa nervceller utan att förlita sig på immunfärgning av fixerade celler. Här, vi isolera, dissociera och kultur mus VM neuroner för 3 veckor. Vi identifierar sedan dopaminerga neuroner i kulturer med hjälp av EGFP fluorescens (drivs av en tyrosinhydroxylas (TH) promotor). Enskilda nervceller skördas i mikrocentrifugrör med hjälp av glasmikropipetter. Nästa, vi lysera de skördade cellerna och utföra cDNA-syntes och transposon-medierad "tagmentation" för att producera enkelcells RNA-Seq bibliotek 1, 2,ass = "xref"> 3, 4, 5. Efter att ha passerat genom kvalitetskontroll check, är biblioteken encelliga sekvenserades och efterföljande analys utförs för att mäta genuttryck. Vi rapporterar transkriptom resultat för enskilda dopaminerga och GABAergic nervceller isolerade från mitthjärnan kulturer. Vi rapporterar att 100% av de levande TH-EGFP celler som skördades och sekvenserades var dopaminerga neuroner. Dessa tekniker kommer att ha omfattande tillämpningar inom neurovetenskap och molekylärbiologi.
Introduction
Parkinsons sjukdom (PD) är en obotlig, åldersrelaterad neurodegenerativ sjukdom. Orsaken till denna relativt vanlig sjukdom fortfarande dåligt förstådd. Det finns en utbredd neuronal förlust i hela hjärnan, med uttalad neuronal degenerering av dopaminerga neuroner i substantia nigra (SNC), vilket leder till diagnostiska kliniska tecken på bradykinesi, stelhet och skakningar.
Primära blandade kulturer innehållande SNC dopaminerga nervceller är särskilt relevanta för Parkinsons sjukdom. Ventrala tegmentområdet (VTA) dopaminerga neuroner har varit inblandade i belöning och missbruk. Ventral mesencefala (VM) primära blandade embryonala kulturer innehåller både SNC och VTA dopaminerga (DA) neuron och GABAergic nervceller. VM primära kulturer kan vara användbara för neuroprotektion analyser och för att belysa den selektiva sårbarhet av dopaminerga neuroner. Det finns ingen tillförlitlig sätt att identifiera dopaminerga celler i odling baserat på morfologi. hanre vi utveckla teknik för att identifiera och skörda enstaka dopaminerga neuroner, och bygga encelliga, högavkastande RNA sekvense bibliotek.
Vi rapporterar representativa RNA transkriptom data för enkel dopaminerga och GABAergic nervceller isolerade från mitthjärnan kulturer. Protokollet kan användas för neuroprotektion, neurodegeneration, och farmakologiska analyser för att studera effekterna av olika behandlingar på DA / GABA transkriptom. Eftersom dopaminerga neuroner utgör en liten minoritet av de nervceller som uttrycks i primär VM kulturer, kommer förmågan att på ett tillförlitligt sätt identifiera dessa nervceller i levande kulturer möjliggöra ett utökat sortiment av single-cellstudier. Dessa nya tekniker kommer att underlätta framsteg inom förstå de mekanismer som äger rum på cellnivå och kan ha applikationer på andra ställen i områdena neurovetenskap och molekylärbiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Alla experiment genomfördes i enlighet med de riktlinjer för skötsel och användning av djur som tillhandahålls av National Institutes of Health, och protokoll har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén vid California Institute of Technology.
1. Härledning av primär Dopaminerga cellkulturer från embryonala Mouse Brain
- Lösningar och kultur Medium
- Framställning av askorbinsyra Stock Solution
- Väg upp 352 mg askorbinsyra. Tillsätt steril H2O till en slutlig total volym av 20 ml. Rum i 37 ° C vattenbad för att lösa upp. Filtrera genom 0,2 | im sprutspetsen och lagra i 500 mikroliter alikvoter vid -20 ° C.
- Framställning av Papain Stock Solution
- Späd papain till 15 enheter / ml i 1 x Hanks'-balanserad saltlösning (HBSS). Pipett upp och ned 5 gånger för att blanda väl. Förbered på dagen för dissektion.
- Framställning av DNas stamlösning
- Väg upp 20 mg DNas. Tillsätt steril H2O till en total slutvolym av 20 ml. Sterilt filter med 0,2 um sprutfilter spets. Förvara vid -20 ° C i 1 ml alikvoter.
- Framställning av Stopplösning
- Späd 5 ml donatorhästhästserum till 10% i 45 ml 1x HBSS. Sterilt filter med en 0,2 um sprutfilter spets. Lagra vid 4 ° C.
- Framställning av 4% bovint serumalbumin (BSA) stamlösning
- Väg in 2 g BSA och lägga 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) till en total slutlig volym av 45 ml. Filter sterilisera med 0,2 um sprutfilter spets. Lagra vid 4 ° C.
- Framställning av plätering Medium
- In 494 ml medium, tillsätt 1,25 ml odlingsmedium som innehåller L-alanyl-L-glutamin (en stabiliserad källa till L-glutamin) och 5 ml av donatorhästserum. Filter sterilisera med 0,2 ìm spruta filter spets. Lagra vid 4 ° C.
- Framställning av cellodlingsmedium
- I 196 ml plätering medium, tillsätt 4 ml B27 och 200 mikroliter askorbinsyra. Filter sterilisera med 0,2 | j, m filter. Lagra lösningen vid 4 ° C och använd inom en vecka.
- Framställning av 4% paraformaldehyd (PFA) Lösning
Varning: Allmänna försiktighetsåtgärder för att använda paraformaldehyd är följande: Använd ett dragskåp undvika hud- och ögonkontakt, undvik inandning av ånga, hålla sig borta från värme eller öppen eld. Bär lämplig personlig skyddsutrustning. PFA kan ge allergi och eksem, därför tvätta händerna noggrant efter hantering.- Tillsätt 10 ml 16% PFA till 30 ml 1 x PBS, pH 7,4.
- Framställning av 0,1% Triton X-100
- Pipettera 1 ml Triton X-100 i 9 ml 1 x PBS för att göra en 10% -ig lösning. Pipettera långsamt för att tillåta viskös lösning för att fylla pipettspetsen. Varm i 37 ° C vattenbad att dislösa. Lagra 10% lager vid 4 ° C.
- Späd 10% lager till 0,01% (t ex genom att utföra 2 seriella 1:10 späd: späd 1 ml 10% lösning i 9 ml 1x PBS för att göra 1% lösning, 1 ml 1% lösning i 9 ml 1x PBS för att göra 0,1% lösning).
- Framställning av 10% och 1% åsna serum
- Tillsätt 1 ml av åsna serum till 9 ml 1x PBS för en 10% -ig lösning. Tillsätt 0,5 ml av donkey serum till 49,5 ml 1 x PBS, pH 7,4 för en 1% -ig lösning.
- Framställning av 1 x PBS
- Späd 10x PBS till 1x genom tillsats av 50 ml till 450 ml H2O Justera lösningens pH till pH 7,4 med användning av en pH-mätare.
- Framställning av askorbinsyra Stock Solution
- Beläggning odlingsskålama
- Poly-L-Ornithine Beläggning
- endast belägga 10 mm glas diameter botten i mitten av alla de 35 mm plattor med 120 mikroliter poly-L-Ornithine med steril teknik. Inkubera under 1 h vid 37 ° C. Använda en vakuumsuganordning för att aspirera poly-Lornithine. Skölj rätter två gånger med sterilt H2O
- Laminin Coating (stamkoncentration av 1 mg / ml)
- Späd 20 | il laminin med 2 ml sterilt H2O (slutkoncentration 0,01 mg / ml).
- endast belägga 10 mm glas diameter botten i mitten av alla rätter med 120 mikroliter av laminin utspätt till 0,01 mg / ml med steril teknik, och inkubera i 1 timme eller O / N vid 37 ° C före användning.
- Poly-L-Ornithine Beläggning
- mus Dissection
OBS: De metoder i denna dissektion är utformade för minimal exponering av celler, eftersom de överförs från embryonala säckar till odlingsinkubator. Viabiliteten hos cellerna bevaras genom att avlägsna endast en del av hjärnan för dissektion av mellanhjärnan. Isolering av mellanhjärnan går snabbare utan att behöva dissekera hela hjärnan för att komma till regionen. Se tabell över material för musstam som används i denna studie. - Spraya buk euthanized mus med 70% etanol. Ta tag i huden på nedre delen av buken med hjälp av pincett med 2 x 3 tänder och öppna bukhålan med hjälp av trubbig blad kirurgisk sax. Göra två snitt som rör sig i sidled och proximalt på varje sida. Vik över bukväggen med användning av pincett för att exponera bukhålan.
OBS: Livmodern är nu exponerad. Utsätta pleurahålan och skapande av pneumothorax också ser till att djuret inte återhämta sig. - Skär båda ändarna av livmoderhornet för att separera uterus. Placera i en petriskål i en steril huva.
- Använda rak spets pincett i varje hand öppna fostersäcken och ta bort embryot. Snabbt halshugga genom att nypa huvud i nacken med pincett. Stabilisera huvudet med pincett stadigt placerade på nosen, så att ryggens yta är tillgänglig.
- Med hjälp av tången hålls i den andra hand, nypa lagret av huden och skallen strax före åsen av mitthjärnan. Skala tillbaka huden och skallen caudally längs mittlinjen. Placera pincett runt åsen med en spets mellan cortex och hjärnan och den andra över lillhjärnan.
- Nyp och ta bort hela mitthjärnan, lämnar bakom framhjärnan på rostralt sidan och lillhjärnan på svanssidan. Placera i en petriskål med kallt HBSS under ett dissektionsmikroskop.
- Upprepa proceduren för de återstående embryon.
- Enligt dissekera mikroskop, vänds hjärnan segmentet så att den ventrala sidan är nu tillgänglig. Det finns nu 4 kvadranter synlig. Ta bort alla hjärnhinnorna och kärl genom att försiktigt ta tag hjärnhinnorna och dra uppåt bort från hjärnan.
- Använd pincett för att stabilisera hjärnan segmentet medan separera mellanhjärnan. Placera en tång av tång i ventrikeln ungefär i mitten av segmentet. Gör första nypa dorsalt, pekar into skålen, sedan medialt på varje sida. Ta två nedre kvadranter genom att göra sido snitt på båda sidor.
OBS: vävnaden av intresse är i det ventrala underlägsna avsnitt, som verkar tät. Denna region innehåller både VTA och SNC. - Trim och kassera den vävnad som är mindre tät: detta inkluderar den överlägsna och underlägsna colliculi. Placera dissekerade vävnaden innehållande både VTA och SNC med färskt HBSS på en separat del av petriskål.
OBS: I detta skede av mus hjärnans utveckling (E14), är regionen av intresse i ventrala mitthjärnan åtskilda av en kammare från zona incerta och andra hypotalamiska cellgrupper. Ju mer långsträckt struktur utveckla embryonala mushjärna gör skillnaden mellan dessa områden, som är belägna närmare varandra i den vuxna musen hjärnan. - Upprepa för alla återstående hjärnan segment.
- Efter alla hjärn segment har dissekeras, använd pincett och en nr 11 skalpell till kvartal each mitthjärnan avsnitt i bitar av ungefär samma storlek.
- Enzymatisk Behandling av celler
- Använd en bred borrning P1000 pipettspetsen att ta upp alla inkvarterade mitthjärnan segmenten i HBSS och placera dem i en 15 ml koniska rör. Låt segmenten sedimentera till botten av röret och ta bort HBSS som har tagits upp med styckad bitar.
- Tillsätt 500 mikroliter av papain-lösning till röret och placera i ett 37 ° C vattenbad i 15 min. Resuspendera celler genom finger ställa röret efter 7,5 minuter.
- Med användning av ett brett-bore P1000 spets, pipett endast de mitthjärnan segmenten in i en 1 ml alikvot av deoxiribonukleas I (DNas) lösning. Tillåta segmenten att sedimentera till botten av röret.
- Med hjälp av en bred borrning P1000 spets, överföra endast mitthjärnan segmenten till en 15 ml rör innehållande 1 ml kall stopplösning för att skölja. Låt segmenten sedimentera till botten av röret och upprepa sköljningen påce mer.
- Mekanisk Triturering av Cell Suspension
- Ersätta den sista sköljningen med 1 ml färsk stopplösning och pipettera upp och ner 7x med en P1000 pipettspets för att triturera celler. Undvik överdriven finfördelning för att minimera cellys.
- Låg bakom cellsuspensionen genom att långsamt pipettera 200 mikroliter av 4% BSA-lösning i botten av röret. Försiktigt dra tillbaka pipettspetsen att undvika att störa cellsuspensionen skiktet. Efter centrifugering vid 280 xg under 6 min, aspirera supernatanten med P1000 och återsuspendera cellerna i 1 ml plätering medium.
- Utför cellräkning med hjälp av en hemocytometer. Späd cellsuspensionen till 1000 celler / mikroliter, med plätering medium.
- Med hjälp av en vakuumsug, aspirera laminin från de belagda rätter i satser av högst tre rätter. Plattan 120 | il (1,2 x 10 5 celler / skål (78,5 mm 2
- Efter 1 timme, tillsätt försiktigt 3 ml odlingsmedium till en oympade område i odlingsskålen för att minimera störningar av celler.
- Utför en halv till full medel förändring på cellodlingsskålar på 3 d intervall under 3 veckor.
2. Skörd Odlade-dopaminerga nervceller för RNA Sequencing
ANMÄRKNING: En översikt av den cellskördning och encelliga RNA-sekvensering protokoll ges i figur 1.
- Åtgärder för att utföra Innan dagen för experimentet
- Rent borsilikatglas kapillärrör genom sonikering i 100% etanol under 15 min och sedan igen i destillerat H2O i 15 min. Dränera röret och baka över natten i en ugn vid 200 ° C för att inaktivera RNas.
- Använd nyöppnadRNas-fri pipettspetsar för att framställa en förrådslösning av 10 x reaktionsbuffert genom att blanda 19 ^ il 10 x lyseringsbuffert från sekvenseringskitet med en mikroliter av lösningen av RNas-inhibitor (20 | il total volym) i ett mikrocentrifugrör. Spinn ner blandningen kort med hjälp av en mikro-centrifug och hålla på is.
- Tillsätt 2 mikroliter av 10x reaktionsbuffert till varje enskild 0,2 ml PCR-rör (används för att samla de skördade nervceller). Märk rören med lämpliga taggar som identifierar neuroner som skall skördas och lagra fryst vid 4 ° C.
- Åtgärder för att utföra på dagen för experimentet
- Tillverkning av de Skörd Pipetter.
- Dra mikropipetter med stor spetsdiameter (2-8 um) från bakade kapillärröret med hjälp av en mikro avdragare och glasbelagda glödtråd av en microforge. Ställa in avdragare för att bilda mikropipetter med en lång avsmalning. Använda en microforge utrustad med en kalibrerad okularfokalplattan och en hög effekt obsubjektiva att bryta spetsen av mikropipett till önskad spetsstorlek (10-20 ^ m).
- Fäst mikropipett i microforge pipetten hållaren och montera hållaren på microforge. Föra spetsen av mikropipetten i fokus över glasbelagda glödtråd med den mekaniska manipulatorn av microforge och omkopplaren på ström till glödtråden för att värma den. Röra pipettspetsen till den upphettade glödtråden. Bryt strömmen när pipettspetsen har smält till lämplig diameter.
NOTERA. Avstängning av strömmen kommer att orsaka tråden att röra sig plötsligt nedåt och lossas från pipettspetsen, som producerar en stor, öppen spets pipetten med den önskade diametern. - Förvara de färdiga mikropipetter i en sluten låda tills det behövs.
- Skörd av nervceller.
NOTERA. Odlade neuroner skördades efter en modifierad version av en tidigare publicerad protokoll 6.- grundligt clean alla ytor på cellskörd rum som kommer i kontakt med de kulturer rätter och uppsamlingsrör som använder flytande desinfektionsmedel och vatten följt av en vattensköljning. Torka den desinficerade ytor med 80% etanol och sedan en RNas-inhibitor-infunderas torka.
- Fyll två isolerade behållare med is, en med regelbundna (vatten) is och en annan med torris. Placera 0,2 ml PCR-samling rör fyllda tidigare med 2 mikroliter av 10x reaktion buffert på den vanliga isen.
- Avlägsna odlingsskål innehållande nervceller från inkubatorn, dränera odlingsmediet från skålen, skölj med 2 ml RNas-fritt Dulbeccos PBS (DPBS) och ersätt med 1 ml DPBS för skörd.
- Identifiera fluorescerande, TH-positiva neuroner i de primära mitthjärnan kulturer med hjälp av en inverterad, epifluorescensmikroskop utrustat med en 40X fas mål en Hg-lampa och en GFP filter set.
- Placera pipetten över cellen soma med hjälp av en motordriven eller manuellt micromanipulator. Aspirera neuron i glaset mikropipett med hjälp av skonsam sugkraft appliceras genom munnen genom plaströr fäst vid sidoingången av mikropipetten hållaren. Omedelbart bort mikropipett innehållande cellen från badlösningen.
- Placera pipettspetsen inuti ett 0,2 ml PCR-rör samling som innehåller reaktionsbuffert, och bryta spetsen mot sidan av röret, nära botten. Driva ut kvarvarande vätska (0,5 - 1,5 | il) från den brutna spetsen av mikropipetten genom att placera en steril 21 G sprutnål på baksidan av mikropipett och anbringande utåtriktat tryck.
- Centrifugera provröret i 5 s med hjälp av en stationär mikrocentrifug och frysa den i torris. Lagra uppsamlingsrören innehållande de enskilda cellerna vid -80 ° C. Normalt är 5-celler skördas per skål under en tidsperiod på 1 timma vid rumstemperatur.
- Tillverkning av de Skörd Pipetter.
3. Single-cell-RNA-Seq bibliotek Generation
- <li> Generation av den första cDNA-strängen
- Ta nedan reagens på is till PCR skåpet. Förbered en första sträng huvudblandning plus 10% genom att kombinera följande reagens vid rumstemperatur i en PCR-skåp: 2 mikroliter 5x första strängen buffert, 1 mikroliter dNTP-blandning (10 mM), 1 pl oligonukleotid 0,25 mikroliter DTT (100 mM), ( 12 ^ M), 0,25 mikroliter RNas-inhibitor, och 1 mikroliter omvänt transkriptas (100 enheter). Detta är det omvända transkriptaset Master Mix (5,5 mikroliter total volym per reaktion).
- Ta prover från -80 C på torris och ta med till PCR skåpet. Lägg till följande till den enda cellprov: 1 mikroliter 3 'primer 1 och 1 mikroliter kvantifieras RNA spikar. Ta prover på en kylare block till en varm-lock termocykler förinställd vid 72 ° C.
- Inkubera rören i termo under 3 minuter vid 72 ° C, och sedan lägga proverna på en PCR svalare rack.Lägg 5,5 mikroliter av Master Mix (från steg 3.1.1) till varje reaktionsrör och blanda genom att pipettera försiktigt. Snurra 0,2 mikroliter rören i 5 s och inkubera i en termocykler enligt följande: 42 ° C under 90 min, 70 ° C under 10 min. Håll vid 4 ° C.
- Rening av Amplified First Strand cDNA.
OBS: PCR-förstärkta cDNA renas genom immobilisering på magnetiska pärlor. Använd en magnetisk separationsanordning i 0,2 ml rör.- Alikvot de magnetiska pärlorna i 1,5 ml rör. Före varje användning, ta pärla portioner till rumstemperatur under åtminstone 30 minuter och blanda väl för att skingra. Vortex magnetiska pärlor tills den är jämnt blandad.
- Tillsätt 25 mikroliter av magnetiska pärlor till varje prov. Blanda genom att pipettera hela volymen upp och ner åtminstone 10x att blanda väl. Inkubera vid RT under 8 min för att låta cDNA binder till pärlorna.
- Framställning av PCR Master Mix
- Förbered ds-cDNA förstärkning PCR Master Mix för alla reaktioner med en Additional 10% genom att blanda 5 | il 10 x PCR-buffert, 2 mikroliter dNTP-blandning (10 mM), 2 | il PCR-primer 2 (12 ^ M), 2 pl 50x 2 polymerasmixen och 39 mikroliter nukleas fritt-vatten (50 | il total volym / reaktion).
- Förstärkning av First Strand
- Placera proverna och magnetiska pärlor på den magnetiska separationsanordningen ≥5 min, tills vätskan är helt klar, och det finns inga kulor kvar i supernatanten.
- Att hålla proven på separeringsanordningen, pipett supernatanten och kassera. Snurra proverna i 5 s för att samla upp vätska från den sida av röret. Placera prov på den magnetiska separationsanordningen för 30 s, sedan ta bort alla kvarvarande supernatanten med en P10 pipett.
- Tillsätt 50 | il av PCR-masterblandningen till varje rör innehållande DNA bundet till pärlorna från föregående steg. Placera röret i en förvärmd termisk cykler (95 ° C) med en uppvärmd lock. Påbörja den termiska cykling genom att använda följande program: 95 ° C under 1 min, 26 cykler av 95 ° C under 15 s, 65 ° C under 30 s, 68 ° C under 6 min. Sedan 72 ° C 10 min. Håll vid 4 ° C.
OBS: Se sekvense instruktionsbok för mer information och för att optimera provinställningar.
- Rening av amplifierat dubbelsträngat cDNA
- Lägg 90 mikroliter av pärlor till varje prov. Blanda genom att pipettera hela volymen upp och ner åtminstone 10x att blanda väl. Inkubera vid RT under 8 min för att låta cDNA binder till pärlorna. Placera proverna plus pärlor på den magnetiska separationsanordningen för ≥5 min, tills vätskan är helt klar, och det finns inga kulor kvar i supernatanten.
- Medan proven är på den magnetiska separationsanordningen, avlägsna supernatanten och kasta. Håll proverna på den magnetiska separationsanordningen. Lägg 140 mikroliter av nybakade 85% etanol till varje prov utan att störa pärlorna. Vänta i 30 s. Pipettera bort supernatanten. cDNA förblir bunden till beads under tvättprocessen.
- Upprepa etanoltvätt gång till.
- snurra kort proverna för uppsamling av vätska från den sida av röret. Placera prov på den magnetiska separationsanordningen för 30 s, sedan ta bort alla kvarvarande etanol med en pipett. Placera proverna vid rumstemperatur i 2-2,5 min tills pelleten är torr och inte längre blanka (dvs. innan en spricka visas).
OBS: Torka pelleten bara tills det är bara torr. Pelleten ser matt utan glans. Om pelleten inte är torr, kommer etanol kvar i provbrunnarna, vilket kommer att minska den förstärkta cDNA återvinningsgraden och utbytet. Om pelleten är över-torr, kommer det att finnas sprickor i pelleten. Det kommer att ta längre tid än 2 min för att rehydrera och kan minska amplifierade cDNA återvinning och utbyte. - När pärlorna är torra, tillsätt 22,5 mikroliter elueringsbuffert för att täcka pärlan pelleten. Ta prover från den magnetiska separationsanordningen och blanda väl för att resuspendera kulorna. Icubate vid RT under 10 min för att rehydrera.
- Snurra proverna i 5 s för att samla upp vätska från den sida av röret. Placera proverna tillbaka på den magnetiska separationsanordningen för ≥1 min, tills lösningen är fullständigt klar.
OBS: En liten population av pärlor kan inte pelletera mot magneten under inkubation. Pipett dessa unpelleted pärlor upp och ned för att återsuspendera dem med supernatanten, och sedan pipettera dem mot magneten där resten av pärlorna redan har pelleterat (utan att störa den befintliga pellet). - Fortsätta inkubationen tills inga pärlor förblir i supernatanten. Överför klar supernatant innehållande renat cDNA från varje rör till en nukleasfritt, lågvidhäftande röret. Märk varje rör med prov information och förvara vid -20 ° C. Proverna kan förvaras vid -20 ° C på obestämd tid.
- Mätning av DNA-koncentration och Fragment storlek
- Genomför en kvalitetskontroll genom att kvantifiera en 1 mikroliter aliquot av cDNA på en fluorometer. Bedöma 1 il (3 ng) av ds-cDNA med användning av ett elektroforessystem (såsom beskrivs i 1).
- Fragmentering av DNA
OBS: Använd ett DNA-prov förberedelse kit.- Tillsätt 20 mikroliter av cDNA (35 ng totalt) till ett rör. Tillsätt 25 mikroliter av Tagment DNA (TD) buffert till röret innehållande cDNA.
- Tillsätt 5 | il av TDE1 (Tagment DNA enzym) till röret. Pipett upp och ner 10x att blanda. Använda en färsk spets för varje prov. Centrifugera vid 280 x g vid 20 ° C under 1 min.
- Placera proverna i en termocykler med en uppvärmd lock och köra den vid: 55 ° C, 5,5 min. Snabbt lägga till 50 mikroliter QG lösning (gelextraheringskit). Pipett upp och ner 10x att blanda. Fortsätt direkt till nästa steg.
- Rening av Fragmenterad DNA
- Lägg 170 mikroliter av pärlor, pipett upp och ner 10x att blanda. Låt det sitta i 10 min. Sätt rören på magneten. Låt rören sitta på magneten under 10 min.Medan proverna är på den magnetiska separationsanordningen, pipett supernatanten och kassera.
- Lämna röret på magneten och tillsätt 200 mikroliter av 85% etanol. Låt sitta i 30 sekunder, sedan avlägsna etanol. Upprepa etanoltvätt. Snurra röret 1000 xg vid rumstemperatur.
- Sätt tillbaka på magneten röret. Pipettera bort eventuell kvarvarande etanol. Låt proverna torka vid RT under 15 min.
- Lägg 21 mikroliter elueringsbuffert från gelextraheringskit. Låt röret sitta utanför magneten, pipett upp och ner 10x att blanda. Låt röret sitta vid RT under 15 min.
- Återgå röret till magneten under 5 min. Pipettera 20 | il av lösning (renat DNA) in i ett nytt rör.
- Taggning och PCR-förstärkning av det fragmenterade DNA
OBS: I detta steg det renade DNA: t amplifieras via en begränsad-cykel PCR-program. PCR-steget lägger även index 1 (i7) och index 2 (i5) samt gemensamma adaptrar (P5 och P7) (krävs för klusterbildning och sekvensering). Se till DNA sgott förberedelseguide för mer information.- I ett nytt rör tillsätt 5 mikroliter av index 2 primers (vit mössa). Med hjälp av en ny pipettspets tillsätt 5 mikroliter av index en primer (orange lock). Tillsätt 15 mikroliter av PCR-huvudblandning till varje rör.
- Tillsätt 5 | il av PCR-primer cocktail till varje rör. Tillsätt 20 mikroliter av renat DNA till röret. pipett försiktigt upp och ned 3 - 5 gånger.
- Utföra PCR med användning av följande program på en termocykler: 72 ° C under 3 min, 98 ° C under 30 s, 5 cykler av 98 ° C under 10 s, 63 ° C under 30 s, 72 ° C under 3 min. Håll vid 10 ° C. Fortsätt omedelbart till PCR sanering eller förvara provet vid 4 ° C i upp till 2 d.
- Rening av amplifierade DNA-fragment
- Bringa pärlorna till RT. Framställ färsk 85% etanol. Ta prover av PCR-maskin och spinn ner en kort stund.
- Tillsätt 30 mikroliter av pärlor till röret. Försiktigt pipett blanda upp och ned 10 gånger. Låt röret stå i rumstemperatur under 5 min. plats back på magneten under 5 min. Med röret på magneten använda en pipett för att kassera supernatanten.
- Tillsätt 200 mikroliter av 85% etanol till varje rör. Pipett etanol av efter 30 sekunder. Upprepa 85% etanol tvätt. Pipett etanol av efter 30 sekunder.
- Med rören fortfarande på magneten och locken öppna, tillåter pärlorna lufttorka under 15 minuter. Ta bort rören från magneten.
- Lägg 32,5 mikroliter elueringsbuffert. pipett försiktigt upp och ner 10 gånger. Inkubera av magnet för 10-15 min.
- Återgå rören till magneten i 2 minuter, eller tills supernatanten har försvunnit. Överför försiktigt 30 mikroliter av supernatanten till ett nytt rör.
- Mätning av DNA-koncentration och fragmentstorleken
- Genomför en kvalitetskontroll genom att kvantifiera DNA-koncentration av 1 mikroliter av cDNA på en fluorometer. Bestämma fragmentstorleken av DNA genom elektrofores. Bedöm 1 mikroliter (3 ng) av ds-cDNA.
- sekvensering
- Ta en enda cell RNA-Seq bibliotek till en sekvenseanläggning. Generera 100 bp sekvense läser på en sequencer efter en tidigare publicerat protokoll 4.
OBS: Varje sekvense bibliotek genererar> 20 miljoner unika kartläggning läser.
- Ta en enda cell RNA-Seq bibliotek till en sekvenseanläggning. Generera 100 bp sekvense läser på en sequencer efter en tidigare publicerat protokoll 4.
OBS: För följande steg använder reagenser från kommersiella sekvense kit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här rapporterar vi ett protokoll för odling ventrala mitthjärnan nervceller från en mus som uttrycker EGFP drivs av en tyrosinhydroxylas promotorsekvens, skörda enskilda fluorescerande nervceller från kulturerna, och mätning av deras RNA transkriptom med hjälp av RNA-punkter (Figur 1). Data visade att 100% av de TH-EGFP-positiva celler som skördades och sekvenser var dopaminerga neuroner, baserat på förekomsten av följande tre DA-relaterade gentranskript, TH, dopa-dekarboxylas (DDC), och dopamintransportören DAT (slc6a3). Alla TH-EGFP positiva celler uttryckte dessa tre gener som bedöms av RNA-Seq. I varje enkel-cell-RNA-Seq bibliotek 6000 - 8000 proteinkodande gener detekterades (Figur 2). De dopaminerga neuroner robust uttrycka dopaminrelaterade transkript förutom flera nikotinacetylkolinreceptor (nAChR) subenheter (Tabell 1). Vi observerade att ingent alla celler som var negativa för TH var GABAergic; Därför fastställde vi celler som GABAergic baserade på närvaron av Gad1 transkriptet som bedöms av RNA-punkter. Cellerna som vi definierade som GABAergic nervceller inte uttrycker dopaminrelaterade transkript men som nämnts uttrycker en stor gen för GABA-syntes, Gad1. biblioteken encelliga avslöjade också lång icke-kodande RNA, såväl som transkript som kodar för kanaler, receptorer, nukleära proteiner, histoner, organeller proteiner och transkriptionsfaktorer.
Figur 1. RNA-Seq i enskilda nervceller, som utförd i våra experiment på primära TH-EGFP mus hjärnan kulturer. (1) Kultur TH-EGFP mus ventrala neuroner i 3 veckor. (2) Identifiera fluorescerande enskilda neuroner genom spännande GFP hjälp av en Hg ljuskälla och FITC / GFP filter. (3) With samma 40X objektiv i fas optik, visualisera enskilda nervceller och korrekt placera pipetten. (4-5) Aspirera enda cell i glas mikropipett. Bilderna visar en cell efter skörd: (4) Fas 40X; (5) EGFP fluorescens. (6) Lysera celler med lysbuffert med oligo-dT-primer vid 72 ° C. (7) cDNA-syntes; 26 cykler amplifiering. (8) Transposon-medierad "tagmentation" cDNA. (9) Kontroll cDNA kvalitetskontroll och multiplex sekvensering. (10) Efter beräknings analys med hjälp av Tophat, Manschettknappar och Cuffdiff 7. Relativ överflöd av uttryckta gener mättes i enheter av fragment per kilobas av transkript per miljon mappade läser (FPKM). Målet med RNA-punkter är att tillhandahålla en lista över gener som uttrycks i en cell och deras utbredning. Bilder (2-4) är från den aktuella work, (6-10) ändras från en tidigare rapport 1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Numret av proteinkodande gener detekteras i singel dopaminerga RNA-Seq bibliotek genererade från TH-EGFP-positiva celler. 6000 - 8000 proteingener detekterades i biblioteken enda cell. FPKM: Fragment per kilobas av transkriptet per miljon mappas läser (FPKM). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| gener | DA enskilda celler n = 10 | GABAergic enskilda celler n = 7 |
| FPKM (Medelvärde ± SEM) | ||
| TH | 4714 ± 764 | 1,2 ± 0,14 |
| DDC | 779 ± 167 | 0,8 ± 0,1 |
| slc6a3 / DAT | 506 ± 144 | 0,5 ± 0,04 |
| DRD2 | 14 ± 8 | 0,1 ± 0,004 |
| chrna6 (α6) | 174 ± 57 | 0,0 |
| chrna4 (α4) | 17 ± 5 | 26,4 ± 2,3 |
| chrnb2 (β2) | 9 ± 3 | 17,3 ± 1,2 |
| chrnb3 (β3) | 38 ± 13 | 0,0 |
| Gad1 | 0,0 | 959,0 ± 70,0 |
| Htr3a | 0,0 | 0,6 ± 0,01 |
| Htr3b | 0,0 | 0,0 |
Tabell 1. Dopamin relaterade och nAChR gentranskript i dopaminerga och GABAergic nervceller vid dag 21 i VentrMidbrain kulturer. RNA-Seq data för TH-EGFP positiva och negativa nervceller visas. Enskilda celler skördades på kultur dag 21. RNA-Seq data visar att TH-EGFP positiva neuroner hade höga nivåer av DA-relaterade gentranskript, inklusive tyrosinhydroxylas (TH), dopadekarboxylas (DDC), dopamintransportören DAT (slc6a3) och nikotinacetylkolinreceptorn (nAChR) subenheter inklusive α6, α4, β2 och β3. Emellertid är dessa celler hade låga nivåer av den GABAergic markörgenen glutaminsyradekarboxylas 1 (Gad1) och serotonin 5-HT3-receptor A och B-subenheter (Htr3A och Htr3B). GABAerga neuron har låga till inga nivåerDA-relaterade gentranskript, chrna6, chrnb3 och Htr3A / B, men har höga halter av Gad1. uppgifter RNA-Seq (Cuffdiff) visas för dopaminrelaterade GABAergic, nikotinreceptor och serotonin transkript. FPKM: Fragment per kilobas av transkriptet per miljon mappas läser (FPKM).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här isolera vi enskilda celler från en heterogen population med hjälp av en fluorescerande tagg, sedan studera varje cell med encelliga RNA-punkter. Vi rapporterar att 100% av de levande TH-EGFP celler som vi skördade och sekvense var verkligen dopaminerga neuroner, baserat på förekomsten av följande tre DA-relaterade gentranskript, TH, DDC och slc6a3. Alla TH-EGFP positiva celler uttryckte dessa tre gener som bedöms av RNA-Seq. Detta var samstämmiga med elektrofysiologiska studier som visade att varje TH-EGFP cell visas också en repertoar av jonkanaler i samband med dopaminerga neuroner 8, 9. I detta protokoll används vi GENSAT tyrosinhydroxylas-EGFP musstam 10 som en tillförlitlig markör för levande dopaminerga neuroner. I WT kulturer finns det för närvarande inget tillförlitligt sätt att identifiera levande dopaminerga nervceller baserat på deras morfologi. Trots vår omfattande erfarenhet av idenfiera och inspelning från dopaminerga neuroner, i vildtyp kulturer endast tre av tio av de misstänkta dopaminerga celler skördade var dopaminerga neuroner. Dessutom observerade vi att inte alla de celler som var negativa för TH var GABAergic. Vi definierade celler som GABAergic baserat på närvaron av Gad1 utskriften och avsaknaden av DA-relaterade transkript som bedöms av RNA-punkter.
Eftersom dopaminerga neuroner utgör en liten minoritet av de nervceller som uttrycks i primär VM kulturer, kommer förmågan att på ett tillförlitligt sätt identifiera dessa nervceller i levande kulturer öka utbudet av tillgängliga encelliga studier. Protokollet kan användas för neuroprotektion, neurodegeneration, och farmakologiska analyser för att studera effekterna av olika behandlingar på dopaminerga transkriptom. Dessutom kan man använda detta protokoll för immunohistokemisk, elektrofysiologiska, BioPhotonic 11, och i princip proteomik analyser. DeSE-analyser är särskilt användbara för Parkinsons sjukdom och missbruk forskning. Men naturligtvis analoga protokoll, på GENSAT möss eller liknande märkta möss, skulle kunna användas för andra sjukdomstillstånd eller för celler som är sällsynta. Dessutom ger detta protokoll en framväxande syn på heterogenitet inom en given neuronal subtyp.
I tidigare studier, efter skörd av enda cell vi placerade den direkt i PBS; emellertid nu placerar vi den skördade enda cell direkt in i reaktionsbufferten. Detta resulterar i bättre RNA-Seq bibliotek kvalitet som bedöms av antalet gener upptäckts i varje bibliotek. En av de viktigaste begränsningarna hos tekniken är att fluorescensetiketterade celler erfordras. Som nämnts tidigare, finns det inget verkligt tillförlitlig sätt att identifiera en specifik celltyp i en blandad kultur baserad på morfologi. Det stora utbudet av cellspecifika fluorescerande eller Cre-uttryckande mus linjer nu ger korrekt märkta celler i många fall. Emellertid omsorg should vidtas när man väljer en lämplig fluorescerande mus linje, som en omfattande undersökning av transgen mus linjer fann att TH-Cre knock-in mus linjer uppvisar uttalad transgenexpression i nondopaminergic cellerna 12.
Dessutom, ytterligare ett steg som kan behöva optimeras i framtida experiment är den önskade spets storleken på mikropipett. Om framtida experiment innefattar användningen av celltyper andra än dopaminerga neuroner, kan mikropipett spetsstorlek måste optimeras för cellen av intresse.
RNA djup sekvensering är en mer kraftfull teknik än mikroarrayer. RNA-Seq ger god sikt till run reproducerbarhet. Det dynamiska området detekteras är jämförbar med den faktiska transkriptet överflöd inuti celler. Man kan upptäcka alternativa splitsformer och nya isoformer. De novo analys av prover utan en referens gen är möjligt; och om en ny referensgenen upptäcks data kan analyseras på nytt förspecifik gen (er) utan att behöva köra den våta arbete experimentet igen 13.
Sammanfattningsvis rapporterar vi att 100% av de levande TH-EGFP celler som skördades och sekvenserades var dopaminerga neuroner. Denna teknik förlänger andra rapporter som identifierar akut dissocierade eller långsiktiga odlade dopaminerga neuroner från GENSAT möss, 14, 15 och tekniken kommer att få omfattande tillämpningar inom neurovetenskap och molekylärbiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | |
| Hanks-balanced Salt Solution (HBSS), 1x | Gibco | 14175-095 | |
| Donor Equine Serum | Thermo Scientific | SH30074.03 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030-50G | |
| Medium: Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Culture media that contains a stabilized form of L-glutamine, L-alanyl-L-glutamine: GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 0.5 mM final concentration. |
| L-Ascorbic acid | Sigma | A7506 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | 50x stock solution, 1x final concentration. |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek | P35GC-1.5-10-C | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P4957 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | Stored at -20 °C in 20 µL aliquots |
| Deoxyribonuclease I (DNase) | Sigma | DN25 | |
| Blue pipette tips P1000 | Sorenson Bioscience | Inc. 10130 | |
| 10 mm shallow Petri dish | VWR | 25384-324 | |
| 37 °C Water bath | |||
| 37 °C, 5% humidity incubator | |||
| 16% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| Donkey serum | Equitech | SD-0100HI | 100% stock solution, 1% final concentration. |
| Standard Pattern surgical scissors | Fine Science Tools | 14000-14 | |
| Forceps - 2x3 teeth | Fine Science Tools | 11022-14 | |
| Forceps - Dumont #55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Forceps - Dumont #5 | Fine Science Tools | 11252-23 | |
| 10x PBS, pH 7.4 | Gibco | 70011-044 | |
| Dulbecco's Phosphate-buffered solution (DPBS) 1x | Gibco | 14190-144 | 500 mL |
| 21 G needle | BD PrecisionGlide Needle | 305167 | 100 needles |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | model P-87 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285 | |
| Sequencing Kit: SMARTer Ultra Low RNA Kit for Illumina Sequencing | Clontech | 634936 | 100 rnxs,incl Advantage2PCR Kit |
| oligonucleotide (12 µM): SMARTer IIA oligonucleotide (12 µM) | From the SMARTer Kit | ||
| Reverse transcriptase (100 units) | SMARTcribe reverse transcriptase | From the SMARTer Kit | |
| Primer 1 | 3’ CDSIIa primer | From the SMARTer Kit | |
| Primer 2 | IS PCR primer | From the SMARTer Kit | |
| 50x 2 polymerase mix | 50x Advantage 2 polymerase mix | From the SMARTer Kit | |
| 10x PCR buffer | 10x Advantage 2 PCR buffer | From the SMARTer Kit | |
| RNA Spikes | ThermoFisher | 4456740 | |
| PCR cooler rack | IsoFreeze PCR cooler rack | ||
| DNA Sample Preparation Kit | (Illumina/Nextera) Nexter | FC-121-1030 | 24 Samples |
| PCR master mix | Nextera PCR master mix (NPM) | From the Nextera Kit | |
| PCR primer cocktail (PPC) | Nextera PCR primer cocktail (PPC) | From the Nextera Kit | |
| Fluorometer | The Qubit ThermoFisher | Q33216 | |
| HS DNA BioAnalyzer kit | Agilent | 5067-4626 | 110 rxns |
| Electrophoresis system | Agilent 2100 Bioanalyzer. | G2938C | |
| Magnetic beads: Agencourt AMPure | Beckman Coulter | A63880 | 5 mL |
| RNAse wipe: RNAse Zap wipes | Ambion | AM9786 | Size 100 Sheets |
| Qubit ds HS Assay Kit | Molecular probes | Q32854 | 500 assays |
| Gel extraction kit: Qiaquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Glass capillary tubing | (Kimax-51, 1.5 - 1.8 mm o.d.) | ||
| Microforge | Narishige (or equivalent) | ||
| Sequencer | Illumina HiSeq instrument | ||
| GENSAT tyrosine hydroxylase-eGFP mouse strain | MMRRC stock number: 000292-UNC | Stock Tg(Th-EGFP)DJ76Gsat/Mutant Mouse Regional Research Center |
References
- Henley, B. M., et al. Transcriptional regulation by nicotine in dopaminergic neurons. Biochem Pharmacol. 86 (8), 1074-1083 (2013).
- Marinov, G. K., et al. From single-cell to cell-pool transcriptomes: stochasticity in gene expression and RNA splicing. Genome Res. 24 (3), 496-510 (2014).
- Kim, D. H., et al. Single-cell transcriptome analysis reveals dynamic changes in lncRNA expression during reprogramming. Cell Stem Cell. 16 (1), 88-101 (2015).
- Ramskold, D., et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nat Biotechnol. 30 (8), 777-782 (2012).
- Gertz, J., et al. Transposase mediated construction of RNA-seq libraries. Genome Res. 22 (1), 134-141 (2012).
- Morris, J., Singh, J. M., Eberwine, J. H.
- Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat Protoc. , 562-578 (2012).
- Srinivasan, R., et al. Smoking-Relevant Nicotine Concentration Attenuates the Unfolded Protein Response in Dopaminergic Neurons. The Journal of Neuroscience. 36 (1), 65-79 (2016).
- Henderson, B. J., et al. Menthol Alone Upregulates Midbrain nAChRs, Alters nAChR Subtype Stoichiometry, Alters Dopamine Neuron Firing Frequency, and Prevents Nicotine Reward. J Neurosci. 36 (10), 2957-2974 (2016).
- Gong, S., et al. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).
- Kim, J., Henley, B. M., Kim, C. H., Lester, H. A., Yang, C. Incubator embedded cell culture imaging system (EmSight) based on Fourier ptychographic microscopy. Biomed Opt Express. (8), 3097-3110 (2016).
- Lammel, S., et al. Diversity of transgenic mouse models for selective targeting of midbrain dopamine neurons. Neuron. 85 (2), 429-438 (2015).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Dryanovski, D. I., et al. Calcium entry and alpha-synuclein inclusions elevate dendritic mitochondrial oxidant stress in dopaminergic neurons. J Neurosci. 33 (24), 10154-10164 (2013).
- Kimm, T., Khaliq, Z. M., Bean, B. P. Differential Regulation of Action Potential Shape and Burst-Frequency Firing by BK and Kv2 Channels in Substantia Nigra Dopaminergic Neurons. J Neurosci. 35 (50), 16404-16417 (2015).
