Summary
我们提出了一个协议,以调查带电和不带电分子的横跨关节软骨与最近开发的实验和数值方法的帮助下运输。
Abstract
骨关节炎(OA)是与关节软骨和软骨下骨的退化相关联的令人衰弱的疾病。关节软骨的退化基本上损害其承载功能,因为它经历了巨大的化学降解, 即 ,蛋白多糖的损失和胶原纤维的破坏。 OA期间,调查化学损伤机制中的一种有前途的方法是将试样软骨暴露到外部溶质和监控分子的扩散。软骨损伤( 即浓度和基本大分子的构型)的程度与外部溶质的碰撞能量损失,同时跨越关节软骨移动相比健康软骨产生不同的扩散特性相关联。在这项研究中,我们引入一个协议,该协议包括几个步骤,并且基于先前开发的试验微-C14px的;“> omputedŤomography(微CT)和有限元建模使用微CT,随后是通过施加双相-溶质和多相有限元模型,以获得扩散系数首先被记录带电和不带电碘化分子的运输。固定跨软骨区的电荷密度。
Introduction
分子运输在铰接接头的内稳态中起着至关重要的作用,治疗剂递送至关节软骨和对比度增强软骨成像1,2,3。因素,如软骨整合和完整性,溶质电荷和大小以及重量渗透摩尔浓度,并与软骨可能影响传输速率4,5,6接触浴的浓度。溶质,无论是中性的或带电荷的传输,可以是关节软骨区域之间不同,因为每个区由不同浓度的和主要的细胞外基质分子的取向,即蛋白聚糖素(PGs)和II型胶原蛋白1,7,8,9,小姑娘=“外部参照”> 10,11。更重要的是,带电荷的溶质运输可以是高度依赖于包括横跨关节软骨8,9增加了的细胞外基质内负的固定电荷的蛋白聚糖的浓度。这些参数尤其是固定电荷密度(FCD),胶原原纤维和穿过软骨含水量变化的取向可经历改变为骨关节炎(OA)的进行,从而表示跨越软骨研究扩散的重要性。
在目前的研究中,协议基于先前建立的实验和计算研究6,8,9,提出了准确调查使用中性和带电溶质扩散的有限浴模型中的各种边界条件下扩散。 Ť他提出的方法是由包括软骨和由先进的双相 - 溶质和多相有限元模型支持的有限浴的系统的微型计算机断层扫描成像(微CT)的。这些模型使跨关节软骨的不同区域获得中性和带电分子以及FCDS的扩散系数。利用这些模型,可以更好地了解可用于研究软骨和覆盖有限浴之间的相互作用的扩散中性和带电分子的行为。
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Protocol
注意:这里介绍的协议是从最近的研究论文6,8,9,实验和计算程序通过。该协议是在图1中示出。
该尸体材料与乌得勒支大学的兽医学院的许可收集。
1.样品和浴的制备
- 使用定制的钻头( 图1),同时喷涂凉爽磷酸盐缓冲盐水(PBS),以防止过热和随后的软骨损伤钻出从尸体马股骨髁圆柱形骨软骨塞(8.5mm的直径)。
- 用塑料收缩套筒以最小化重叠浴的横向扩散热缩骨软骨塞。
- 安装骨软骨插头与日软骨E中的塑料收缩套内侧顶最初和通过吹送热空气到它跟随。加入软骨,防止热相关的损害表面湿棉片。
- 分别准备电荷的( 例如,650微升,420毫摩尔,碘克沙酸盐,分子量(Mw)= 1269道尔顿,电荷= -1)和中性(650μL,420毫米,碘克沙醇,MW = 1550道尔顿)溶质的有限浴。
- 加载使用注射器将软骨的表面上制备的有限浴并放置一个软木塞上包裹样品,以防止在实验过程中的蒸发在RT( 图2A)。为了研究中性溶质运移,将碘克沙醇浴,并研究带负电荷的溶质运移地方碘克酸浴到软骨表面。
2.成像和图像处理
- 将带有软木塞上附连到微CT的电动载物台定制的保持器中分离的包裹样品。地方Ť他取样所以覆盖有造影剂溶液朝上软骨表面。
- 扫描使用微CT(40×40×40微米的3体素尺寸,2分钟的扫描时间,90千伏的管电压和180μA管电流)的视图,包括软骨,软骨下板的领域,并且finite-浴在几个时间点,直到平衡状态(48小时)达到( 图2A)。当浓度值不随时间变化达到平衡状态。
- 注册在基于初始图像上使用制造商的软件,方便利息(ROI)的区域定位不同时间点的3D图像( 例如,分析)。
- 转换3D使用制造商的软件处理它们之前重建微CT图像为二维标记图像文件格式(TIFF)栈。
- 全局段(ImageJ的>调整>阈值)从软骨下骨和在软骨在软件躺在浴缸。
- 获得在不同时间点软骨的平均灰度值使用所生成的软骨掩模在前面的步骤(ImageJ的>分析>测量)。
- 鉴于该软骨的初始浴浓度和初始造影剂浓度,使用线性校准曲线的平均灰度值转换为溶质的实际浓度。以前的数据支持该灰度值保持与造影剂的浓度成线性关系这一事实。
- 剧情中的溶质浓度与实验的时间点。
3.计算建模
注意:在这个问题的扩散假设采取1D位置(沿着z轴),其与实验边界条件的要求。因此,几何形状可以任意创建。
- 构建基于有限浴软骨多区域模式:1)由软骨浅表区 (总软骨厚度的20%),中间区(总软骨厚度的50%)和深区(总软骨厚度的30%)12和2)在FEBio 13,14( 图2B有限浴)。
- 分配软骨和沐浴在FEBio的不同区域的机械和物理性能。杨氏模量(10MPa的)被假定为足够高以抵抗由覆浴施加的渗透压,因此保护软骨免受过度的变形。
- 使用的10 -3毫米的液压渗透性4 / Ns和泊松在模拟8,0。使用的浴的实际溶质扩散系数比9。
- 生成网格(8节点六面体三线性元素)和完善它的边界附近( 图2B)类=“外部参照”> 8,9。
- 双相溶质模型
- 在对应于它的浴和有效压力施加初始的溶质浓度。看的有效压力的说明在图9中 ,15。
- 运行瞬态模式模型根据在不同的区域软骨规定扩散系数,以获得溶质浓度对时间的曲线。
- 多相模型
注意:浴和组织之间的电波动可以通过添加两个单价抗衡离子的浴,将组织两者来规避。- 对于稳态模型:同时增加FCD到其期望值使用软骨和覆浴相同的有效流体压力和浓度。
- 对于瞬态模型:通过保持溶质扩散系数在浴中足够高的创建充分搅拌的有限浴。注入溶质从浴 - 空气界面到浴达到其期望的浓度值。
- 瞬态:除去在先前步骤中规定的溶质浓度的边界条件,并恢复有限浴的扩散系数其实际扩散系数。
- 运行模型,以获得基于施加FCDS和扩散系数在不同的软骨区溶质浓度 - 时间曲线。
- FEBio-MATLAB界面
- 开发一个MATLAB代码在FEBio和情节浓度-时间曲线(FEBio-MATLAB接口)8,9自动执行仿真。
- 改变扩散系数和FCDS使用FEBio-MATLAB界面软骨区。在FEBio运行模式和提取的溶质浓度-时间曲线8,9。
- 与实验进行比较所获得的溶质浓度 - 时间曲线基于最小根扩散系数的数据,并获取集和FCDS在不同软骨区均方误差(RMSE)8,9。
图1: 实验设置。 A)使用一个特制的钻头样品提取过程。 B)显微CT成像程序以监测扩散过程。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2: 示意图。A)实验设计。 B)多区域计算模型包括有限浴,软骨以及相关联的网格的浅,中,深区。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Representative Results
这里提供的代表性的结果是从先前的研究论文6,8,9,16日通过。
在OA中,关节软骨发生显著变化最重要的GAG损失,以及胶原纤维17的损坏,18个 ,19。这些变化可通过关节软骨20,21影响溶质的扩散行为。我们研究了两种碘化造影剂的轴向扩散, 即 ,碘克沙醇(电荷= 0)和碘克沙酸盐(电荷= -1),在使用显微CT尸体马骨软骨塞。为了定量的中性溶质(碘克沙醇),双相-溶质模型和带电SOLU的扩散过程 TE(碘克酸)多相模型中在FEBio所考虑软骨的纬向结构发达。将两相-溶质和多相模型可以预测碘克沙醇的扩散和整个关节软骨碘克沙酸盐( 图3)。启用这些模型在不同的软骨区8获得的碘克沙醇(双相-溶质)和扩散系数的扩散系数以及FCD(碘克沙酸盐),9。
图3: 计算上曲线拟合数据。 A)多区域双相-溶质(虚线)与实验数据和B)多相模型拟合(虚线)与实验数据(符号)8,9。://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54984/54984fig3large.jpg”目标=‘_空白’>点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
我们提出了一个实验方案用有限元建模程序组合来研究跨关节软骨中性和带电溶质的扩散。根据我们最近的研究,所提出的模型可以准确地描述这两种中性(双相溶质)的跨关节软骨8,9的不同区域的运输和带负电荷(多相)溶质。人们普遍认为,关节软骨变得通过其重要部件的损耗功能的限制,诸如OA进展21,22,23,24中带负电荷的大分子GAG以及胶原纤维。使用在本研究中提出的技术,可以潜在地检查关节软骨的健全性。中性溶质的运输可能在OA PRIMAR来扩充 ILY由于胶原的溶质之间的较低的相互作用以及聚糖和。在另一方面,带负电荷的溶质运输可以帮助获得相对于蛋白聚糖的固定收费浓度的信息,从而给OA发展水平的一些指示。
该双相溶质和多相模型基础上根据以前的研究有限浴概念的出现是被开发可以作为由可以提供关节软骨的纬向性的精确估计的平台。用造影剂,大浴相关的限制即可能射束硬化伪影,和分配单扩散系数关节软骨7,20,25,26,27,28,姑娘=“外部参照”> 29,30开车到开发当前研究的动机。在未来OA的研究,我们开发的车型可能会潜在地发现早期OA诊断中的应用。
有两个实验和计算机模拟所需的一些关键步骤。为了在实验过程中保持软骨完整性,一个将需要加入足够量的蛋白酶抑制剂,以防止后续的酶活性。在使用一个样本一个以上的实验的情况下,洗出时间为平衡后的渗透溶质约为48小时。洗出效率需要使用微CT进行检查。当使用我们的设置采用马软骨,上覆浴相当于无限浴的最小体积计算比软骨量的5倍。此外,为了进行扩散的有限元建模,重要的是应用实际溶质扩散coefficient以来从偏离洗澡可能会影响结果。
在底层的有限元模型,溶质尺寸效应并没有实现,因此无法进行研究。我们提出的有限浴模型提供了一定的优势,在铰接接头更恰当地理解,即扩散过程,并减少束硬化伪影。当应用带正电的造影剂我们所提出的技术相结合的实验和计算模型能使审议软骨的扩散属性。在洗澡的实际溶质扩散系数的知识似乎是关键,因为这可能影响显著跨关节软骨所获得的扩散系数的准确性。这将需要获得任一浴的扩散系数实验或容易地使用文献值。
总之,我们提出了包括实验的通用协议,计算研究带电和不带电的溶质的跨关节软骨的运输。使用协议,可以成功地获得扩散系数和固定带电密度在不同软骨层。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
作者想表达他们在乌得勒支UMC从开发力学组感谢的Jeroen先生范登贝尔赫和Matthijs Wassink先生为他们的包裹骨软骨插头的过程中提供帮助。这项工作是由来自荷兰关节炎基金会的资助。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Hexabrix | Guerbet | 15HX005D | Negatively-charged contrast agent |
Visipaque | GE healthcare | 12570511 | Nuetral contrast agent |
PBS (Phosphate-buffered Saline) | Life technologies | 10010023 | Medium |
micro-CT | Perkin Elmer | Monitoring diffusion | |
Freezing-point osmometer | Advanced instruments | Measuring solution osmolality |
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