Summary
Nous vous proposons un protocole d'enquêter sur le transport des molécules chargées et non chargées dans le cartilage articulaire à l'aide de méthodes expérimentales et numériques récemment mis au point.
Abstract
L'arthrose (OA) est une maladie débilitante qui est associée à la dégénérescence du cartilage articulaire et de l'os sous-chondral. La dégénérescence du cartilage articulaire altère sa fonction de support de charge sensiblement comme il subit une dégradation chimique considérable, à savoir la perte et la perturbation de fibrilles de collagène protéoglycane. Un bon moyen d'enquêter sur les mécanismes d'endommagement chimique au cours de l'arthrose est d'exposer les échantillons de cartilage à un soluté externe et contrôler la diffusion des molécules. Le degré de dégradation du cartilage ( à savoir la concentration et la configuration des macromolécules essentielles) est associée à la perte d'énergie de collision de solutés externes tout en se déplaçant à travers le cartilage articulaire crée différentes caractéristiques de diffusion par rapport à un cartilage sain. Dans cette étude, nous présentons un protocole, qui se compose de plusieurs étapes et est basée sur les micro-C expérimental développé précédemment14px; "> omputed T omography (micro-CT) et la modélisation par éléments finis Le transport des molécules iodées chargées et non chargées est d' abord enregistrée à l' aide de micro-CT, qui est suivie par l' application de modèles d'éléments biphasique-soluté et multiphasiques finis pour obtenir des coefficients de diffusion. et des densités de charge fixe à travers des zones de cartilage.
Introduction
Le transport moléculaire joue un rôle essentiel dans l'homéostasie des joints d' articulation, la livraison d'agents thérapeutiques pour le cartilage articulaire et de l' imagerie du cartilage contraste amélioré 1, 2, 3. Des facteurs tels que l' intégration du cartilage et intact, la charge du soluté et la taille ainsi que l' osmolalité et la concentration du bain en contact avec le cartilage peut influencer le taux de transport 4, 5, 6. Le transport de solutés, soit neutres ou chargés, peut être différente entre les zones de cartilage articulaire, parce que chaque zone est constituée de différentes concentrations et les orientations de grandes molécules de la matrice extracellulaire, à savoir les protéoglycanes (PG) et le collagène de type II 1, 7, 8, 9,lass = "xref"> 10, 11. Plus important encore , le transport des solutés charge peut être fortement dépendante de la concentration de protéoglycanes comportant des charges négatives fixes au sein de la matrice extracellulaire qui augmente à travers le cartilage articulaire 8, 9. Ces paramètres particulièrement la densité de charge fixe (FCD), l'orientation des fibrilles de collagène et de la variation de la teneur en eau dans le cartilage peuvent subir des altérations de l'arthrose (OA) progresse, signifiant ainsi l'importance d'étudier la diffusion à travers le cartilage.
Dans la présente étude, un protocole basé sur une enquête préalable des études expérimentales et informatiques établis 6, 8, 9 est proposé de précision diffusion dans différentes conditions aux limites en utilisant des solutés neutres et chargés dans un modèle bain fini de diffusion. Til a proposé des procédés de formation d'image sont composées de micro-tomographie par ordinateur (micro-CT) d'un système comprenant le cartilage et un bain-fini supporté par biphasique-soluté avancée et multiphasiques modèles d'éléments finis. Ces modèles permettent d'obtenir les coefficients de diffusion des molécules neutres et chargées, ainsi que dans diverses zones FCD du cartilage articulaire. L'utilisation de ces modèles, on peut acquérir une meilleure compréhension du comportement des molécules diffusantes neutres et chargées qui pourraient être utilisés pour étudier les interactions entre le cartilage et superposant bain fini.
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Protocol
NOTE: Le protocole présenté ici est adopté des procédures expérimentales et de calcul des travaux de recherche récents 6, 8, 9. Le protocole est illustré sur la figure 1.
Les matériaux cadavériques ont été recueillies avec la permission de faculté de médecine vétérinaire de l'Université d'Utrecht.
1. Préparation d'échantillon et Bain
- Percer des bouchons cylindriques ostéochondrales (diamètre de 8,5 mm) à partir de condyles fémoraux équins cadavériques à l' aide du foret sur mesure (figure 1) pendant la pulvérisation fraîche salée tamponnée au phosphate (PBS) afin d' empêcher une surchauffe et des lésions du cartilage ultérieur.
- Thermorétractables les bouchons ostéochondrales avec un manchon en matière plastique pour réduire au minimum le rétrécissement de la diffusion latérale du bain de superposition.
- Monter le bouchon ostéochondrale avec cartilage à ee initialement supérieure à l'intérieur du manchon en matière plastique et le rétrécissement suivi par soufflage d'air chaud à elle. Ajouter les morceaux de coton humide sur la surface du cartilage pour prévenir les dommages liés à la chaleur.
- Préparer des bains finies de charge (par exemple, 650 ul, 420 mM, ioxaglate, poids moléculaire (MW) = 1269 Da, la charge = -1) et de neutre (650 ul, 420 mM, iodixanol, MW = 1550 Da) solutés séparément.
- Charger le fini des bains préparés sur la surface du cartilage en utilisant une seringue et placer un bouchon de liège sur l'échantillon enveloppé pour empêcher l' évaporation au cours d' expériences à la température ambiante (Figure 2A). Pour étudier le transport de soluté neutre, placez le bain de iodixanol et d'étudier le bain de lieu de transport de soluté ioxaglate chargé négativement sur la surface du cartilage.
2. Imagerie et traitement d'image
- Placer les échantillons enveloppés isolé avec bouchon de liège sur un support sur mesure fixée à la platine motorisée d'un micro-CT. lieu til échantillon de telle sorte que la surface couverte de cartilage avec une solution d'agent de contraste est tourné vers le haut.
- Numériser à l' aide du micro-CT (taille de voxel de 40 x 40 x 40 pm 3, temps de cycle de 2 min, la tension de tube de 90 kV et un courant de tube de 180 uA) un champ de vision constitué de cartilage, la plaque sous - chondrale, et finie bain dans plusieurs points de temps jusqu'à ce que l' état d'équilibre (48 h) est atteinte (figure 2A). L'état d'équilibre est atteint lorsque les valeurs de concentration ne changent pas au fil du temps.
- Enregistrez les images 3D dans différents points de temps en fonction de l'image initiale pour faciliter le positionnement de la région d'intérêt (ROI) en utilisant le logiciel du fabricant (par exemple, Analyser).
- Convertir la 3D reconstruit des images micro-CT en 2D Tagged Image pile Format de fichier (TIFF) avant de les traiter en utilisant le logiciel du fabricant.
- Globalement segment (ImageJ> Régler> Threshold) le cartilage de l'os sous-chondral et plusbain couché dans le logiciel.
- Obtenir la valeur de gris moyenne de cartilage à différents points dans le temps (ImageJ> Analyse> Mesure) en utilisant le masque de cartilage généré à l'étape précédente.
- Compte tenu de la concentration du bain initial et la concentration initiale d'agent de contraste dans le cartilage, en utilisant une courbe d'étalonnage linéaire pour convertir les valeurs de gris moyennes de la concentration réelle de solutés. Des données antérieures soutiennent le fait que les valeurs de gris de maintenir une relation linéaire avec la concentration des agents de contraste.
- Tracer les concentrations de soluté par rapport à des points de temps expérimentaux.
3. Modélisation informatique
REMARQUE: La diffusion de ce problème est supposée avoir lieu en 1D (le long de l'axe z), qui est conforme à la condition de limite expérimentale. Par conséquent, la géométrie peut être arbitrairement créé.
- Construire le cartilage à base de bain fini modèles multi-zones: 1) le cartilage consistant zone superficielle (20% de l'épaisseur du cartilage totale), d'une zone médiane (50% de l'épaisseur du cartilage total) et zone profonde (30% de l'épaisseur du cartilage totale) 12 et 2) la baignoire finie dans Febio 13, 14 (figure 2B).
- Affecter les propriétés mécaniques et physiques des différentes zones du cartilage et bain Febio. le module de Young (10 MPa) a été supposée être suffisamment élevée pour résister à la pression osmotique exercée par le bain de recouvrement et donc de protéger le cartilage de déformations excessives.
- Utiliser une perméabilité hydraulique de 10 -3 mm 4 / Ns et le coefficient de Poisson de 0. Utilisation coefficient de diffusion du soluté réelle du bain dans les simulations 8, 9.
- Générer un maillage (éléments hexaédriques trilinéaire 8-node) et l' affiner près des limites (figure 2B)class = "xref"> 8, 9.
- modèle biphasé-soluté
- Appliquer la concentration initiale du soluté dans le bain et une pression efficace qui lui correspond. Regardez la description de la pression effective dans 9, 15.
- Exécuter le modèle en mode transitoire pour obtenir la concentration du soluté en fonction des courbes de temps en fonction des coefficients de diffusion prescrites dans les différentes zones du cartilage.
- modèle multiphasique
REMARQUE: La fluctuation électrique entre le bain et le tissu peut être contourné en ajoutant deux contre-ions monovalents à la fois le bain et le tissu.- Pour les modèles de régime permanent: utiliser les mêmes pressions et concentrations efficaces de fluide dans le cartilage et le bain sus-jacente tout en augmentant la FCD à sa valeur souhaitée.
- Pour les modèles transitoires: créer un bien agité bain fini en gardant le coefficient de diffusion du soluté dans le bain suffisamment élevé. injecter lasoluté à partir de l'interface bain-air dans le bain d'atteindre sa valeur de concentration souhaitée.
- Transient: supprimer la condition aux limites de concentration de soluté prescrite à l'étape précédente et rétablir le coefficient de diffusion du bain-fini à son coefficient de diffusion effective.
- Exécuter le modèle pour obtenir des courbes concentration-temps soluté à base de DCP appliqués et des coefficients de diffusion dans les différentes zones du cartilage.
- Interface Febio-Matlab
- Élaborer un code MATLAB pour effectuer automatiquement la simulation dans les courbes concentration-temps Febio et terrain (interface Febio-Matlab) 8, 9.
- Modifier les coefficients de diffusion et dans les zones de FCD cartilage en utilisant l'interface Febio-Matlab. Exécuter des modèles en Febio et extraire des courbes concentration-temps de soluté 8, 9.
- Comparer les courbes concentration-temps soluté obtenu à l'approche expérimentaledonnées et obtenir des ensembles de coefficients de diffusion et DCP dans différentes zones de cartilage à base de racine erreur quadratique moyenne minimale (RMSE) 8, 9.
Figure 1: Configuration expérimentale. A) la procédure d'extraction de l' échantillon à l' aide d' un foret sur mesure. B) procédure d'imagerie Micro-CT pour surveiller processus de diffusion. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: Schéma.A) La conception expérimentale. B) modèle informatique multi-zone constituée du bain fini, les zones superficielles, moyennes et profondes du cartilage et maillage associé. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Representative Results
Les résultats représentatifs fournis ici sont adoptés de documents de recherche précédents 6, 8, 9, 16.
Dans l' arthrose, le cartilage articulaire subit des changements importants surtout la perte GAG, et les dommages fibrillaire de collagène 17, 18, 19. Ces changements peuvent influer sur le comportement diffusif de solutés à travers le cartilage articulaire 20, 21. Nous avons étudié la diffusion axiale de deux agents de contraste iodés, à savoir l' iodixanol (frais = 0) et ioxaglate (frais = -1), dans les bouchons ostéochondrales équins cadavériques à l' aide de micro-CT. Pour quantifier le processus de diffusion d'un soluté neutre (iodixanol), un modèle biphasique-soluté et un solu chargé te (ioxaglate) modèle multiphasique ont été développés en Febio qui a examiné la structure zonale du cartilage. Les modèles biphasé-soluté et multiphasique pourraient prédire la diffusion de iodixanol et Ioxaglate à travers le cartilage articulaire (figure 3). Ces modèles ont permis l' obtention de coefficient de diffusion de l' iodixanol (biphasique-soluté) et le coefficient de diffusion, ainsi que FCD (ioxaglate) dans différentes zones de cartilage 8, 9.
Figure 3: Courbe-équipée plan informatique des données. A) biphasée-soluté multizone ( en pointillés) par rapport aux données expérimentales et B) modèles multiphasiques unique (pointillées) par rapport aux données expérimentales (symbole) 8, 9.: //ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54984/54984fig3large.jpg » target = « _ blank »> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Nous avons présenté un protocole expérimental associé à une procédure de modélisation par éléments finis pour étudier la diffusion de solutés neutres et chargés à travers le cartilage articulaire. Selon nos études récentes, les modèles proposés pourraient décrire avec précision le transport des deux solutés neutres (biphasé-soluté) et chargés négativement (multiphasique) dans les différentes zones du cartilage articulaire 8, 9. Il est largement admis que le cartilage articulaire devient fonctionnellement limitée par la perte de ses composants vitaux tels que macromolécules GAG chargés négativement ainsi que fibrilles de collagène au cours de la progression OA 21, 22, 23, 24. En utilisant la technique proposée dans cette étude, on peut examiner potentiellement la salubrité du cartilage articulaire. Le transport de soluté neutre peut être augmentée dans primar OA ily en raison d'interactions plus faibles entre le soluté ainsi que des GAG et des collagènes. D'autre part, le transport des solutés chargés négativement pourrait aider à acquérir des informations par rapport à la concentration des charges fixes de protéoglycanes, donnant ainsi une indication du niveau de progression OA.
Les modèles biphasé-soluté et multiphasique qui ont été élaborées en fonction de l'émergence de concept bain fini selon les études précédentes pourraient servir de plates-formes par lesquelles une estimation précise des propriétés zonal du cartilage articulaire pourrait être fournie. Limitations associées à de grands bains d'agents de contraste, notamment possible d' artefacts de durcissement par faisceau, et en attribuant un coefficient unique de diffusion de cartilage articulaire 7, 20, 25, 26, 27, 28,lass = "xref"> 29, 30 a conduit la motivation pour développer l'étude. Dans l'avenir recherche sur l'arthrose, nos modèles développés pourraient potentiellement trouver des applications pour le diagnostic d'arthrose précoce.
Il y a quelques étapes critiques nécessaires à la fois dans des expériences et des simulations de calcul. Afin de préserver l'intégrité du cartilage au cours des expériences, on aurait besoin d'ajouter des quantités suffisantes d'inhibiteurs de protéase pour empêcher les activités enzymatiques suivantes. En cas d'utilisation d'un échantillon pour plus d'une expérience, délavage temps pour les solutés pénétrés après équilibration était d'environ 48 h. L'efficacité de lavage-out doit être vérifiée à l'aide de micro-CT. Lorsque vous utilisez notre mise en place en utilisant le cartilage équine, le volume minimum de l'équivalent de bain sus-jacente à un bain infini a été calculé pour être cinq fois plus élevé que le volume du cartilage. De plus, pour effectuer la modélisation par éléments finis de diffusion, il est essentiel d'appliquer diffusion soluté réelle Coefficient dans le bain depuis écart par rapport à cela pourrait affecter les résultats.
Dans les modèles éléments finis sous-jacents, l'effet de la taille de soluté n'a pas été mis en œuvre et ne pouvait donc pas être étudié. Notre modèle proposé bain fini présente des avantages, à savoir processus de diffusion compréhension dans les articulations d'articulation de manière plus appropriée, et la réduction des artefacts de durcissement du faisceau. Notre technique proposée combinant expériences et modèles de calcul permet scrutant les attributs de diffusion du cartilage sont appliqués lorsque des agents de contraste chargés positivement. La connaissance du coefficient de diffusion de soluté réelle dans le bain semble être cruciale car cela pourrait affecter de manière significative la précision des coefficients de diffusion obtenus à travers le cartilage articulaire. Cela nécessiterait soit obtenir le coefficient de diffusion de bain expérimentalement ou facilement en utilisant des valeurs de la littérature.
En conclusion, nous avons proposé un protocole général composé d'expériences etcalculs pour étudier le transport de solutés chargées et non chargées sur le cartilage articulaire. En utilisant ce protocole, on peut obtenir avec succès des coefficients de diffusion et des densités fixes chargées dans les différentes couches de cartilage.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à exprimer leur gratitude à M. Jeroen van den Berg et M. Matthijs Wassink du groupe mécanique de développement à UMC Utrecht pour leur aide dans le processus d'emballage des bouchons ostéochondrales. Ce travail a été soutenu par une subvention de la Fondation néerlandaise de l'arthrite.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hexabrix | Guerbet | 15HX005D | Negatively-charged contrast agent |
| Visipaque | GE healthcare | 12570511 | Nuetral contrast agent |
| PBS (Phosphate-buffered Saline) | Life technologies | 10010023 | Medium |
| micro-CT | Perkin Elmer | Monitoring diffusion | |
| Freezing-point osmometer | Advanced instruments | Measuring solution osmolality |
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