En Experimental och Finite Element protokoll för att undersöka transport av neutrala och laddade Lösta ämnen över Ledbrosk

Summary

Vi föreslår ett protokoll för att undersöka transport av laddade och oladdade molekyler över ledbrosk med hjälp av nyutvecklade experimentella och numeriska metoder.

Abstract

Osteoartrit (OA) är en försvagande sjukdom som är associerad med degeneration av ledbrosk och subkondralt ben. Degeneration av ledbrosk försämrar dess bärande funktion väsentligen som den erfar enorm kemisk nedbrytning, dvs proteoglykan förlust och kollagen-fibrill störningar. Ett lovande sätt att undersöka kemiska skademekanismer under OA är att exponera de broskprover till en extern löst ämne och övervaka diffusionen av molekylerna. Graden av broskskada (dvs. koncentration och konfigurationen av väsentliga makromolekyler) är associerad med kollisionsenergiförlust av externa lösta ämnen medan den rör sig över ledbrosket skapar olika diffusionsegenskaper jämfört med friskt brosk. I denna studie, introducerar vi ett protokoll, som består av flera steg och är baserat på tidigare utvecklad experimentell mikro-C14px; "> omputed T omography (mikro-CT) och finita elementmodellering Transporten av laddade och oladdade joderade molekyler först registreras med användning av mikro-CT, vilket följs av applicering av bifasisk-lösta ämnet och flerfasiga finita elementmodeller för att erhålla diffusionskoefficienter. och fast avgift tätheter över brosk zoner.

Introduction

Molekylär transport spelar en viktig roll i homeostasen av ledade fogar, avgivning av terapeutika till ledbrosk och kontrastförstärkt brosk avbildning ^{1, 2, 3.} Faktorer såsom brosk integration och intakthet, lösta ämnet laddning och storlek samt osmolalitet och koncentration av badet i kontakt med brosk kan påverka transporthastigheten ^{4, 5, 6.} Transport av lösta ämnen, antingen neutrala eller laddade, kan vara olika mellan artikulära broskzoner, eftersom varje zon består av olika koncentrationer och orienteringar av stora extracellulära matrismolekyler, nämligen proteoglykaner (PG) och kollagen typ II ^{1, 7, 8, 9,}lass = "xref"> ^{10, 11.} Ännu viktigare, kan transporten av laddade lösta ämnen vara mycket beroende på koncentrationen av proteoglykaner innefattande negativa fasta laddningar inom den extracellulära matrisen som ökar över ledbrosk ^{8, 9.} Dessa parametrar särskilt fast laddningstäthet (FCD), kan orienteringen av kollagenfibriller och vattenhalt variation i hela brosk genomgå förändringar som osteoartrit (OA) fortskrider, och därmed ge uttryck vikten av att studera diffusion genom brosk.

I den aktuella studien, ett protokoll baserat på tidigare etablerade experimentella och beräknings studier ^{6, 8, 9} är föreslagna för att noggrant undersöka diffusionen under olika randvillkor som använder neutrala och laddade upplösta ämnen i en ändlig-bad modell av diffusion. Than föreslog metoder består av mikro-datortomografi bildåtergivning (mikro-CT) hos ett system innefattande brosk och en ändlig-bad som stöds av avancerad bifasisk-lösta ämnet och flerfasiga finita elementmodeller. Dessa modeller gör det möjligt att erhålla de diffusionskoefficienter av neutrala och laddade molekyler såväl som FCDs över olika zoner av ledbrosk. Med hjälp av dessa modeller kan man få bättre förståelse för beteendet hos de diffunderande neutrala och laddade molekyler som kan användas för att undersöka samspelet mellan brosk och överliggande ändlig-bad.

Protocol

OBS: Protokollet presenteras här antas från de experimentella och beräkningsförfaranden senaste forskningsrapporter ^{6, 8, 9.} Protokollet illustreras i figur 1.

De avlidna material samlades med tillstånd från veterinär fakultet Utrecht University.

1. Prov och Bath Framställning

1. Borra ut cylindriska osteokondrala pluggar (diameter 8,5 mm) från avlidna equine femorala kondyler använder skräddarsydda borrkronan (fig 1), medan sprutning kall fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för att förhindra överhettning och efterföljande broskskador.
2. Värme krympa osteokondrala pluggar med en plast krympande hylsan för att minimera den laterala diffusionen av överliggande badet.
   1. Montera osteokondrala kontakten med brosk på the toppen initialt inuti plasten krymper hylsan och följ genom att blåsa varm luft till den. Lägg våta bomulls bitar på ytan av brosk att förhindra värmerelaterade skador.
3. Förbereda ändliga-bad av laddade (t ex 650 | il, 420 mM, ioxaglat, molekylvikt (Mw) = 1269 Da, laddning = -1) och neutral (650 ul, 420 mM, iodixanol, MW = 1550 Da) lösta ämnen separat.
4. Ladda de framställda ändliga-bad på ytan av brosk med användning av en spruta och placera en kork plugg på den omlindade provet för att förhindra avdunstning under experiment vid RT (Figur 2A). För att studera den neutrala lösta transport, placera jodixanol badet och för att studera den negativt laddade lösta transport plats ioxaglat bad på broskytan.

2. Imaging och bildbehandling

1. Placera inslagna prover som isolerats med kork kontakten på en skräddarsydd hållare monterad på den motoriserade steget i en mikro-CT. plats than prov så att brosk yta täckt med kontrastmedel lösning är vänd uppåt.
2. Skanna med hjälp av mikro-CT (voxel storlek av 40 x 40 x 40 | im ^3, avsökningstid av 2 min, rörspänning av 90 kV och rörströmmen av 180 | iA) ett synfält som består av brosk, subkondrala plattan och finite- bad i flera tidpunkter tills jämviktstillstånd (48 tim) uppnås (Figur 2A). Den jämviktstillstånd uppnås när koncentrationsvärden inte förändras över tiden.
3. Registrera 3D-bilder i olika tidpunkter baserat på den initiala bilden för att underlätta positioneringen av regionen av intresse (ROI) med hjälp av tillverkarens programvara (t.ex. analysera).
4. Konvertera 3D rekonstruerade mikro CT-bilder i stacken 2D Tagged Image File Format (TIFF) innan bearbeta dem med hjälp av tillverkarens programvara.
5. Globalt segment (ImageJ> Justera> Tröskel) brosket från det subkondrala benet och överliggande bad i programvaran.
6. Erhålla det genomsnittliga gråvärdet av brosk vid olika tidpunkter (ImageJ> Analysera> Measure) med användning av den genererade brosk mask i det föregående steget.
7. Med tanke på den initiala badkoncentrationen och initial kontrastmedel koncentrationen i brosk, använda en linjär kalibreringskurva för att omvandla de genomsnittliga gråvärden till den verkliga koncentrationen av lösta ämnen. Tidigare data stöder det faktum att gråvärden upprätthålla ett linjärt samband med koncentrationen av kontrastmedel.
8. Plotta lösta koncentrationerna kontra experimentella tidpunkter.

3. Beräknings Modellering

OBS: diffusion i detta problem antas äga rum i 1D (längs z-axeln), som överensstämmer med experimentella randvillkoret. Därför kan geometrin godtyckligt skapas.

1. Bygga ändlig-bad baserade brosk flera zoner modeller: 1) brosk bestående av ytlig zon (20% av den totala brosktjockleken), mittzonen (50% av den totala brosktjockleken) och djupa zon (30% av den totala brosktjocklek) ¹² och 2) ändlig-bad i FEBio ^{13, 14} (figur 2B).
2. Tilldela de mekaniska och fysikaliska egenskaperna för olika zoner av brosk och bad i FEBio. Youngs modul (10 MPa) antogs vara tillräckligt hög för att motstå det osmotiska tryck som utövas av den överliggande badet och därför skydda brosket från alltför deformationer.
   1. Använda en hydraulisk permeabilitet av 10 ^-3 mm ⁴ / Ns och Poissons tal av 0. Använd faktiska löst ämne diffusionskoefficient av badet i simuleringarna ^{8, 9.}
3. Generera mesh (8-nod trilinjär sexsidiga element) och finjustera den nära gränserna (figur 2B)class = "xref"> ^{8, 9.}
4. Bifasisk-löst ämne-modellen
   1. Tillämpa initial koncentration av lösta ämnen i badet och effektivt tryck som motsvarar den. Titta på beskrivningen av effektiva trycket i ^{9, 15.}
   2. Köra modellen i transient läge för att erhålla koncentration av löst ämne mot tidkurvor enligt de föreskrivna diffusionskoefficienter i olika broskzoner.
5. multiphasic modell
   OBS: Den elektriska fluktuation mellan bad och vävnad kan kringgås genom tillsats av två monovalenta motjoner till både bad och vävnaden.
   1. För steady-state modeller: använda samma effektiva fluidtrycken och koncentrationer i brosk och överliggande badet och samtidigt öka FCD till dess önskade värde.
   2. För transienta modeller: skapa en väl omrörd ändlig-bad genom att hålla det lösta ämnet diffusionskoefficienten i badet tillräckligt hög. injiceralöst ämne från badet-luftgränssnittet i badet för att nå dess önskade koncentrationsvärde.
   3. Transient: ta bort den föreskrivna koncentrationen av löst ämne randvillkoret i föregående steg och återgå diffusionskoefficienten för den finita-badet till dess faktiska diffusionskoefficient.
   4. Köra modellen för att erhålla lösta koncentration-tid-kurvor baserade på tillämpade FCDs och diffusionskoefficienter i olika broskzoner.
6. FEBio-MATLAB gränssnitt
   1. Utveckla ett MATLAB-kod för att automatiskt utföra simulering i FEBio och plot-koncentration-tid-kurvor (FEBio-MATLAB gränssnitt) ^{8, 9.}
   2. Ändra diffusionskoefficienter och FCDs i broskzoner med FEBio-MATLAB gränssnitt. Kör modeller FEBio och extrahera lösta koncentrationstids kurvorna ^{8, 9.}
   3. Jämföra de erhållna lösta koncentration-tid-kurvor med den experimentelladata och erhålla uppsättningar av diffusionskoefficienter och FCDs i olika brosk zoner baserat på minsta root mean square error (RMSE) ^{8, 9.}

Figur 1: Experimental Setup. A) Prov extraktionsförfarande med användning av en skräddarsydd borr. B) Micro-CT avbildning förfarande för att övervaka diffusionsprocess. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: Schematisk.A) Experimentell design. B) Fler zon beräkningsmodell bestående av den ändliga bad, ytliga, mellersta och djupa zoner av brosk och tillhörande mesh. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Representative Results

De representativa resultat som här antas från tidigare forskningsrapporter ^{6, 8, 9, 16.}

I OA, genomgår ledbrosk betydande förändringar viktigast GAG förlust och kollagenfibrill skada ^{17, 18, 19.} Dessa ändringar kan påverka det diffusiva beteende av lösta ämnen genom ledbrosk ^{20, 21.} Vi studerade axiell diffusion av två joderade kontrastmedel, dvs jodixanol (laddning = 0) och ioxaglat (laddningen = -1), i avlidna equine osteokondrala pluggar som använder mikro-CT. Att kvantifiera diffusionsprocessen av en neutral löst ämne (jodixanol), en bifasisk-löst ämne-modellen och en laddad solu te (ioxaglat) multiphasic modell utvecklades i FEBio som anses vara den zonal struktur av brosk. Den tvåfasiga-lösta ämnet och flerfasiga modeller kunde förutsäga diffusionen av jodixanol och ioxaglat tvärs ledbrosk (Figur 3). Dessa modeller aktiverat erhålla diffusionskoefficienten för jodixanol (bifasisk-löst ämne) och diffusionskoefficienten samt FCD (ioxaglat) i olika broskzonerna ^{8, 9.}

Figur 3: Computationally Curve-fitted Data. A) Flera zoner bifasisk-löst ämne (streckad) jämfört med experimentella data och B) flerfasiga modeller passar (streckade) kontra experimentella data (symbol) ^{8, 9.}: //ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54984/54984fig3large.jpg" target = '_ blank'> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Vi presenterade en försöksprotokoll i kombination med en finit elementmodelleringsförfarande för att studera spridningen av neutrala och laddade lösta ämnen över ledbrosk. Enligt våra nya studier, kan de föreslagna modellerna korrekt beskriver transporten av både neutral (bifasisk-löst ämne) och negativt laddade (flerfasiga) lösta ämnen i olika zoner av ledbrosk ^{8, 9.} Det anses allmänt att ledbrosk blir funktionellt begränsad genom förlust av dess vitala komponenter såsom negativt laddade GAG makromolekyler såväl som kollagenfibriller under OA progression ^{21, 22, 23, 24.} Med hjälp av tekniken som föreslås i denna studie kan man eventuellt undersöka hur hälsosam ledbrosk. Transporten av neutral lösta kan förstärkas i OA Primar ily grund av lägre interaktioner mellan det lösta ämnet samt GAG och kollagener. Å andra sidan kan transporten av negativt laddade lösta ämnen hjälpa skaffa information avseende koncentrationen av fasta avgifter av proteoglykaner, vilket ger en indikation på graden av OA progression.

Den bifasiska-lösta och flerfasiga modeller som tagits fram baserat på uppkomsten av finita bad konceptet enligt tidigare studier skulle kunna fungera som plattformar genom vilka noggrann uppskattning av zonal egenskaper hos ledbrosk kan tillhandahållas. Begränsningar förknippade med stora bad av kontrastmedel, nämligen möjligt balk härdande artefakter, och tilldela en enda diffusionskoefficient ledbrosk ^{7, 20, 25, 26, 27, 28,}lass = "xref"> ^{29, 30} körde motivationen att utveckla den aktuella studien. I framtiden OA forskning kan våra utvecklade modeller potentiellt hitta program för tidig OA diagnos.

Det finns några viktiga steg som krävs både i experiment och beräknings simuleringar. Att bevara brosk integritet under experiment, skulle man kräva att lägga tillräckliga mängder av proteasinhibitorer för att förhindra efterföljande enzymatiska aktiviteter. I fallet med användning av ett prov med avseende på mer än ett experiment, tvätta-out tid för de penetrerade lösta ämnen efter ekvilibrering var cirka 48 timmar. Tvätt ut effektivitet måste kontrolleras med hjälp av mikro-CT. När du använder vår set up anställa häst brosk, var den minsta volymen av den överliggande badet motsvarar en oändlig bad beräknas till fem gånger högre än broskvolym. Dessutom, för att utföra finita element modellering av diffusion, är det viktigt att tillämpa aktuella lösta diffusion Coefficient i badet eftersom avvikelse från som kan påverka resultaten.

I den underliggande finita elementmodeller var lösta storlek effekten inte genomförts och därför inte kunde studeras. Vår föreslagna ändlig-bath modell erbjuder vissa fördelar, nämligen att förstå diffusionsprocess i de ledade lederna mer korrekt, och minska beam härdning artefakter. Vår föreslagna tekniken kombinerar experiment och beräkningsmodeller möjliggör granska de diffusion attribut brosk när positivt laddade kontrastmedel tillämpas. Kunskapen om faktiska lösta diffusionskoefficient i badet verkar vara avgörande som påtagligt kan påverka noggrannheten av de erhållna diffusionskoefficienter över ledbrosk. Detta skulle kräva antingen erhålla diffusionskoefficienten för badet experimentellt eller enkelt med hjälp av litteraturvärden.

Avslutningsvis, föreslog vi ett generellt protokoll som består av experiment ochberäkningar för att undersöka transport av laddade och oladdade lösta ämnen över ledbrosk. Med användning av protokollet, kan man framgångsrikt få diffusionskoefficienter och fasta laddade densiteter i olika broskskikt.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hexabrix	Guerbet	15HX005D	Negatively-charged contrast agent
Visipaque	GE healthcare	12570511	Nuetral contrast agent
PBS (Phosphate-buffered Saline)	Life technologies	10010023	Medium
micro-CT	Perkin Elmer		Monitoring diffusion
Freezing-point osmometer	Advanced instruments		Measuring solution osmolality