Summary
Мы предлагаем протокол исследовать перенос заряженных и незаряженных молекул через суставного хряща с помощью недавно разработанных экспериментальных и численных методов.
Abstract
Остеоартроз (ОА) является изнурительным заболеванием, которое связанно с дегенерацией суставного хряща и субхондральной костью. Дегенерации суставного хряща ухудшает свою функцию несущей , по существу , как он испытывает огромную химическую деградацию, т.е. протеогликанов и коллаген потери разрушения фибрилл. Одним из перспективных способов, чтобы исследовать механизмы химического повреждения во время ОА, чтобы выставить образцы хряща к внешнему растворенного вещества и контролировать диффузию молекул. Степень повреждение хряща (т.е. концентрации и конфигурация основных макромолекул) связана с коллизионной потерей энергии внешних растворенных веществ при перемещении через суставной хрящ создает различные характеристики диффузии по сравнению со здоровым хрящом. В этом исследовании мы вводим протокол, который состоит из нескольких этапов и основан на ранее разработанной экспериментальной микро-C14px; "> omputed Т omography (микро-КТ) и моделирование конечных элементов Перенос заряженных и незаряженных йодированных молекул сначала записываются с использованием микро-КТ, которая сопровождается применением двухфазного-растворенное вещество и многофазные конечные модели элемента для получения коэффициентов диффузии. и фиксированной плотности заряда по хрящевых зон.
Introduction
Молекулярный транспорт играет важную роль в гомеостазе Артикуляционных суставов, доставка терапевтических средств в суставном хрящ и контрастное усилением хрящ изображения 1, 2, 3. Такие факторы, как интеграция хрящевой и интактность, растворенное вещество заряд и размер, а также осмоляльность и концентрация ванны в контакте с хрящом может повлиять на скорости транспортировки 4, 5, 6. Перенос растворенных веществ, либо нейтральных или заряженного, может быть разным между суставными зонами хряща, так как каждая зона состоит из различных концентраций и ориентаций основных внеклеточных матричных молекул, а именно протеогликаны (PGS) и коллаген типа II , 1, 7, 8, 9,деваха = "Xref"> 10, 11. Что еще более важно, перенос заряженных растворенных веществ может быть в значительной степени зависят от концентрации протеогликанов , содержащих отрицательные заряды в пределах фиксированных внеклеточного матрикса , который увеличивает через суставной хрящ 8, 9. Эти параметры особенно фиксированная плотность заряда (FCD), ориентация коллагеновых фибрилл и изменений содержания воды через хрящ может подвергаться изменениям, как остеоартрит (ОА) прогрессирует, тем самым показывая важность изучения диффузии через хрящ.
В текущем исследовании, протокол , основанный на ранее установленных экспериментальных и расчетных исследований 6, 8, 9 Предлагается точно исследовать диффузию при различных граничных условиях с использованием нейтральных и заряженных растворенные в конечномерном ванной модели диффузии. Tон предложил методы состоят из микро-компьютерная томография (микро-КТ) системы, включая хрящи и конечную баню при поддержке передовым двухфазным-растворенным веществом и многофазными моделями конечных элементов. Эти модели позволяют получить коэффициенты диффузии нейтральных и заряженных молекул, а также FCDs в различных зонах суставного хряща. Используя эти модели, можно получить лучшее представление о поведении диффундирующих нейтральных и заряженных молекул, которые могут быть использованы для изучения взаимодействия между хрящом и перекрывающей конечной ванной.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Протокол , представленный здесь , заимствован из экспериментальных и расчетных процедур последних научных статей 6, 8, 9. Протокол показан на фиг.1.
В трупные материалы были собраны с разрешения ветеринарного факультета Утрехтского университета.
1. Образец и ванна Приготовление
- Высверлить цилиндрические остеохондральных пробки (диаметр 8,5 мм) от трупных лошадиных бедренных мыщелков с использованием заказной сверло (рисунок 1) во время распыления прохладного фосфатна-солевого буфер (PBS) , чтобы предотвратить перегрев и последующее повреждение хряща.
- Термоусадочный в остеохондральных пробки с пластиковой усадкой рукава, чтобы свести к минимуму бокового распространения покрывающей ванны.
- Установите костно пробку с хрящом в гое изначально сверху внутри пластиковый усадки рукава и последующая продувка горячего воздуха к нему. Добавить мокрые кусочки хлопка на поверхности хряща для предотвращения связанных с жарой повреждения.
- Подготовка конечно-ванны из заряженных (например, 650 мкл, 420 мМ, иоксаглат, молекулярная масса (ММ) = 1 269 Да, заряд = -1) и нейтрального (650 мкл, 420 мМ, иодиксанола, ММ = 1550 Да) растворенных веществ по отдельности.
- Загрузить подготовленную конечно-ванну на поверхность хряща с помощью шприца и поместите пробковую пробку на обернутом образце , чтобы предотвратить испарение в ходе экспериментов при комнатной температуре (рис 2А). Для изучения нейтрального растворенного вещества транспорта, поместите Йодиксанол ванну и изучить отрицательно заряженную растворенное вещество транспорта места иоксаглатой ванны на поверхность хряща.
2. Работа с изображениями и обработка изображений
- Поместите обернутые образцы, выделенные с пробкой пробкой на заказ держателя прикреплен к моторизованной стадии микро-КТ. Место тон образец так, чтобы поверхность хряща, покрытый раствор контрастного агента, обращен вверх.
- Сканирование с помощью микро-КТ (размер воксела 40 × 40 × 40 мкм 3, время сканирования 2 мин, напряжение трубки 90 кВ и ток трубки 180 мкИ) в поле зрения , состоящее из хряща, субхондральной пластинки, а конечномер ванна в нескольких временных точках вплоть до равновесного состояния (48 ч) достигается (фиг.2А). Равновесное состояние достигается, когда значение концентрации не изменяется с течением времени.
- Регистрация 3D - изображений в различные моменты времени на основе исходного изображения , чтобы облегчить позиционирование области интереса (ROI) с помощью программного обеспечения производителя (например, анализ).
- Преобразование 3D-реконструкция микро-КТ изображения в 2D Tagged Image File Format (TIFF) стек перед их обработкой с использованием программного обеспечения производителя.
- В мировом масштабе сегмент (ImageJ> Adjust> Порог) хрящ от субхондральной кости и надлежа ванну в программном обеспечении.
- Получить среднее значение серого хряща в различные моменты времени (ImageJ> Анализ> Измерение) с использованием сгенерированной маски хряща на предыдущей стадии.
- Учитывая начальную концентрацию ванны и начальную концентрацию контрастного агента в хряще, использует линейный калибровочный кривой, чтобы преобразовать средние значения серых к фактической концентрации растворенных веществ. Предыдущие данные подтверждают тот факт, что значения серых поддерживать линейную зависимость с концентрацией контрастных агентов.
- Участок концентрации растворенных веществ в сравнении экспериментальных точек времени.
3. вычислительного моделирования
Примечание: Диффузия в этой задаче предполагается провести в 1D (вдоль оси), что соответствует экспериментальному граничному условию. Таким образом, геометрия может быть произвольно создана.
- Построение моделей хрящ несколько зон на основе конечно-ванны: 1) хрящ, состоящие из поверхностного зоны (20% от общей толщины хряща), средняя зона (50% от общей толщины хряща) и глубокая зона (30% от общей толщины хряща) 12 и 2) конечно-ванна в FEBio 13, 14 (фигура 2В).
- Назначают механические и физические свойства различных зон хряща и ванны в FEBio. Предполагалось, модуль Юнга (10 МПа), чтобы быть достаточно высоким, чтобы противостоять осмотическое давление, оказываемое вышележащей ванну и, следовательно, защищает хрящ от чрезмерных деформаций.
- Используйте гидравлическую проницаемость 10 -3 мм 4 / N и коэффициент Пуассона 0. Использование коэффициента диффузии растворенного вещества фактической ванн при моделировании 8, 9.
- Генерация сетки (8-узла трилинейной шестигранные элементы) и уточнить его вблизи границ (фигура 2В)класс = "внешние ссылки"> 8, 9.
- Двухфазный-растворенное вещество модель
- Применить начальную концентрацию растворенного вещества в ванне и эффективного давления, соответствующего ему. Посмотрите на описание эффективного давления в 9, 15.
- Запуск модели в переходном режиме, чтобы получить концентрацию растворенного вещества в зависимости от времени в соответствии с заданными коэффициентами диффузии в разных зонах хряща.
- Multiphasic модель
Примечание: электрическое колебание между ванной и тканью может быть обойдено путем добавления два одновалентных противоионов как к ванне и ткани.- Для стационарных моделей: использовать те же самые эффективные давления жидкости и концентрацию в хряще и вышележащой ванне при одновременном повышении FCD до желаемой величины.
- Для переходных моделей: создать хорошо перемешиваемой конечную ванну, сохраняя коэффициент диффузии растворенного вещества в ванне достаточно высокой. впрыскиватьрастворенное вещество из интерфейса ванны воздуха в ванну, чтобы достичь желаемой величины концентрации.
- Переходный: удалить предписанную концентрацию растворенного вещества граничного условие в предыдущем шаге и вернуться коэффициентом диффузии конечной бани до его фактического коэффициента диффузии.
- Запустите модель, чтобы получить кривые концентрации растворенного вещества-время на основе применяемых FCDs и коэффициентах диффузии в различных зонах хряща.
- Интерфейс FEBio-MATLAB
- Разработка кода MATLAB для автоматического выполнения моделирования в FEBio и участок кривых концентрация-время (интерфейс FEBio-MATLAB) 8, 9.
- Изменение коэффициентов диффузии и FCDs в хрящевых зон с использованием интерфейса FEBio-MATLAB. Запуск модели в FEBio и извлечения растворенных веществ кривые концентрация-время 8, 9.
- Сравните кривые концентрации времени получены растворенного вещества с экспериментальнымданных и получить наборы коэффициентов диффузии и FCDs в различных зонах хряща на основе минимальной среднеквадратичной ошибки (СКО) 8, 9.
Рисунок 1: Экспериментальная установка. A) процедура экстракции образца с использованием заказных сверл. Б) Процедура Микро-КТ для контроля процесса диффузии. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Схема.А) Экспериментальный дизайн. Б) многозонная вычислительная модель , состоящая из конечных ванн, поверхностных, средних и глубоких зон хряща и связанные с сеткой. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Представительные результаты , приведенные здесь, взяты из предыдущих научных работ 6, 8, 9, 16.
В ОА, суставной хрящ претерпевает значительные изменения , что наиболее важно GAG потери и коллагена фибрилл повреждения 17, 18, 19. Эти изменения могут повлиять на диффузионное поведение растворенных веществ через суставной хрящ 20, 21. Мы изучали осевую диффузию двух йодированных контрастных агентов, т.е. иодиксанол (заряд = 0) и иоксаглат (заряд = -1), в трупных лошадиных пробках остеохондральных с использованием микро-КТ. Для количественной оценки процесса диффузии нейтрального растворенного вещества (иодиксанол), модели двухфазного-растворенного вещества и заряженный Солу т.й (иоксаглат) многофазная модель была разработана в FEBio, что считается зональной структурой хряща. Двухфазные-растворенные вещества и многофазные модели могут предсказать распространение иодиксанола и иоксаглат через суставной хрящ (рисунок 3). Эти модели позволили получить коэффициент диффузии иодиксанола (двухфазные-растворенных вещества) и коэффициент диффузии, а также FCD (иоксаглат) в различных зонах хрящевых 8, 9.
Рисунок 3: Кривая вычислительном-изготовителе данных. А) многозонное двухфазное-растворенное вещество (пунктир) по сравнению с экспериментальными данными и B) многофазные модели FITS (пунктирные) по сравнению с экспериментальными данными (символ) 8, 9.: //ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54984/54984fig3large.jpg»целевых =„_blank“> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы представили экспериментальный протокол в сочетании с процедурой конечных элементов моделирования для изучения диффузии заряженных и нейтральных растворов через суставной хрящ. По нашим последним исследованиям, предлагаемые модели могут точно описать перенос как нейтрального (двухфазного-растворенного вещества) и отрицательно заряженные (многофазные) растворенные через различные зоны суставного хряща 8, 9. Широко распространено мнение , что суставной хрящ становится функционально ограничен из- за потери своих жизненно важных компонентов , такие как отрицательно заряженных макромолекулы ГАГ, а также коллагеновые фибриллы в течение ОА прогрессии 21, 22, 23, 24. Используя методику, предложенную в данном исследовании, можно потенциально исследовать целительное суставного хряща. Перенос нейтрального растворенного вещества может быть увеличен в ОА Primar ILY из-за более низких взаимодействий между растворенным веществом, а также ГАГ и коллагены. С другой стороны, перенос отрицательно заряженных растворенных веществ может помочь получить информацию относительно концентрации основных зарядов протеогликанов, тем самым давая некоторое представление об уровне ОА прогрессии.
Двухфазные-растворенные вещества и многофазные модели, которые были разработано на основе концепции возникновения конечно-ванны в соответствии с предыдущими исследованиями могут служить в качестве платформы, с помощью которого может быть предоставлена точная оценка зональных свойств суставного хряща. Ограничения , связанные с большими ваннами контрастных агентов, а именно можно пучок упрочнение артефактов, и назначением одного коэффициента диффузии в суставном хряще 7, 20, 25, 26, 27, 28,деваха = «Xref»> 29, 30 доставил мотивацию для развития текущего исследования. В дальнейших исследованиях О.А., наши разработанные модели могут потенциально найти применение для ранней диагностики ОА.
Есть некоторые важные шаги, необходимые как в экспериментах, и вычислительных моделей. Для того, чтобы сохранить целостность хряща в ходе экспериментов, один потребует добавления достаточного количества ингибиторов протеазы, чтобы предотвратить последующие ферментативные активности. В случае использования одного образца в течение более одного эксперимента, вымывания время для проникших растворенных веществ после уравновешивания была приблизительно 48 ч. Вымывание эффективность должна быть проверена с помощью микро-КТ. При использовании нашего набора до применения лошадиного хряща, был рассчитан, чтобы быть в пять раз выше, чем объем хрящевого минимальный объем вышележащей ванна эквивалентна бесконечной ванну. Кроме того, для выполнения моделирования методом конечных элементов диффузии, очень важно, чтобы применить фактические диффузии растворенного вещества coefficдиентом в ванне, так как отклонение от, которые могли бы повлиять на результаты.
В базовых моделях конечных элементов, размер эффект растворенного вещества не был осуществлен, и, следовательно, не может быть изучен. Предлагаемые нами модель конечной ванны дает некоторые преимущества, а именно: понимание процессу диффузии в сочленовных суставах более целесообразных и восстанавливающее упрочнение артефакты пучка. Предлагаемый метод объединения экспериментов и вычислительные модели позволяет тщательный диффузионные свойства хряща, когда применяется положительно заряженные контрастные агенты. Знание фактического коэффициента диффузии растворенного вещества в ванне, как представляется, крайне важно, поскольку это может существенно повлиять на точность полученных коэффициентов диффузии через суставной хрящ. Это потребует либо получение коэффициента диффузии ванны экспериментально или легко, используя значения литературы.
В заключении, мы предложили общий протокол, состоящий из экспериментов ирасчеты для исследования переноса заряженных и незаряженных растворенных веществ через суставной хрящ. Использование протокола, можно успешно получить коэффициенты диффузии и фиксированные заряженные плотности в различных слоях хряща.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы выразить свою признательность г-ну Йерун ван ден Берг и г-н Matthijs Wassink из группы механики развития в УМС Утрехте за помощь в процессе из хрящевых пробок упаковки. Эта работа была поддержана грантом от голландского артрита Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hexabrix | Guerbet | 15HX005D | Negatively-charged contrast agent |
| Visipaque | GE healthcare | 12570511 | Nuetral contrast agent |
| PBS (Phosphate-buffered Saline) | Life technologies | 10010023 | Medium |
| micro-CT | Perkin Elmer | Monitoring diffusion | |
| Freezing-point osmometer | Advanced instruments | Measuring solution osmolality |
References
- Arkill, K. P., Winlove, C. P. Solute transport in the deep and calcified zones of articular cartilage. Osteoarthritis Cartilage. 16 (6), 708-714 (2008).
- Chin, H. C., Moeini, M., Quinn, T. M. Solute transport across the articular surface of injured cartilage. Arch Biochem Biophys. 535 (2), 241-247 (2013).
- Leddy, H. A., Guilak, F. Site-specific effects of compression on macromolecular diffusion in articular cartilage. Biophys J. 95 (10), 4890-4895 (2008).
- Leddy, H. A., Guilak, F. Site-Specific Molecular Diffusion in Articular Cartilage Measured using Fluorescence Recovery after Photobleaching. Annals of Biomedical Engineering. 31 (7), 753-760 (2003).
- Gu, W. Y., Yao, H. Effects of hydration and fixed charge density on fluid transport in charged hydrated soft tissues. Ann Biomed Eng. 31 (10), 1162-1170 (2003).
- Pouran, B., Arbabi, V., Zadpoor, A. A., Weinans, H. Isolated effects of external bath osmolality, solute concentration, and electrical charge on solute transport across articular cartilage. Medical Engineering and Physics. 38 (12), 1399-1407 (2016).
- Kulmala, K. A. M., et al. Diffusion coefficients of articular cartilage for different CT and MRI contrast agents. Medical Engineering & Physics. 32 (8), 878-882 (2010).
- Arbabi, V., Pouran, B., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Transport of Neutral Solute Across Articular Cartilage: The Role of Zonal Diffusivities. Journal of Biomechanical Engineering. 137 (7), 071001-071001 (2015).
- Arbabi, V., Pouran, B., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Multiphasic modeling of charged solute transport across articular cartilage: Application of multi-zone finite-bath model. J Biomech. 49 (9), 1510-1517 (2016).
- Arbabi, V., Pouran, B., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Combined artificial neural networks for robust estimation of the diffusion coefficients across cartilage. 22nd Congress of the European Society of Biomechanics, Lyon, France, , (2016).
- Arbabi, V., Pouran, B., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Combined inverse-forward artificial neural networks for fast and accurate estimation of the diffusion coefficients of cartilage based on multi-physics models. Journal of Biomechanics. , (2016).
- Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. The Basic Science of Articular Cartilage: Structure, Composition, and Function. Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).
- Holzapfel, G. A., Kuhl, E. Ch. 17. Computer Models in Biomechanics. , Springer. Netherlands. 231-249 (2013).
- Ateshian, G. A., Maas, S., Weiss, J. A. Multiphasic Finite Element Framework for Modeling Hydrated Mixtures With Multiple Neutral and Charged Solutes. Journal of Biomechanical Engineering. 135 (11), 111001-111001 (2013).
- Arbabi, V., Pouran, B., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Transport of neutral solute across articular cartilage and subchondral plate. 22nd Congress of the European Society of Biomechanics, Lyon, France, , (2016).
- Pouran, B., Arbabi, V., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Application of multiphysics models to efficient design of experiments of solute transport across articular cartilage. Comput Biol Med. 78, 91-96 (2016).
- Hosseini, S. M., Wu, Y., Ito, K., Donkelaar, C. C. The importance of superficial collagen fibrils for the function of articular cartilage. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 13 (1), 41-51 (2013).
- Alexopoulos, L. G., Williams, G. M., Upton, M. L., Setton, L. A., Guilak, F. Osteoarthritic changes in the biphasic mechanical properties of the chondrocyte pericellular matrix in articular cartilage. Journal of Biomechanics. 38 (3), 509-517 (2005).
- Felson, D. T., et al. Osteoarthritis: new insights. Part 1: the disease and its risk factors. Ann Intern Med. 133 (8), 635-646 (2000).
- Kokkonen, H. T., Jurvelin, J. S., Tiitu, V., Toyras, J. Detection of mechanical injury of articular cartilage using contrast enhanced computed tomography. Osteoarthritis Cartilage. 19 (3), 295-301 (2011).
- Raya, J. G., et al. Diffusion-tensor imaging of human articular cartilage specimens with early signs of cartilage damage. Radiology. 266 (3), 831-841 (2013).
- Tavakoli Nia, H., et al. Aggrecan Nanoscale Solid-Fluid Interactions Are a Primary Determinant of Cartilage Dynamic Mechanical Properties. ACS Nano. 9 (3), 2614-2625 (2015).
- Arbabi, V., Campoli, G., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Estimation of cartilage properties using indentation tests, finite element models, and artificial neural networks. 11th World Congress on Computational Mechanics & 5th European Conference on Computational Mechanics, Barcelona, Spain, , (2014).
- Arbabi, V., Pouran, B., Campoli, G., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Determination of the mechanical and physical properties of cartilage by coupling poroelastic-based finite element models of indentation with artificial neural networks. Journal of Biomechanics. 49 (5), 631-637 (2016).
- Kokkonen, H. T., et al. Computed tomography detects changes in contrast agent diffusion after collagen cross-linking typical to natural aging of articular cartilage. Osteoarthritis and Cartilage. 19 (10), 1190-1198 (2011).
- Decker, S. G., Moeini, M., Chin, H. C., Rosenzweig, D. H., Quinn, T. M. Adsorption and Distribution of Fluorescent Solutes near the Articular Surface of Mechanically Injured Cartilage. Biophysical Journal. 105 (10), 2427-2436 (2013).
- Silvast, T. S., Jurvelin, S. J., Tiitu, V., Quinn, T. M., Töyräs, J. Bath Concentration of Anionic Contrast Agents Does Not Affect Their Diffusion and Distribution in Articular cartilage In Vitro. Cartilage. 4 (1), 42-51 (2013).
- Silvast, T. S., Jurvelin, J. S., Lammi, M. J., Töyräs, J. pQCT study on diffusion and equilibrium distribution of iodinated anionic contrast agent in human articular cartilage - associations to matrix composition and integrity. Osteoarthritis and Cartilage. 17 (1), 26-32 (2009).
- Pouran, B., Arbabi, V., Villamar, J., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Contrast agent's transport across healthy articular cartilage under various bath conditions. Orthopaedic Research Society Annual Meeting, Las Vegas, Nevada, , (2015).
- Arbabi, V., Pouran, B., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Application of a biphasic-solute model in predicting diffusive properties of osteochondral interface. International Workshop on Osteoarthritis Imaging (IWOAI), Oulo, Finland, , (2016).
