Summary
Proponemos un protocolo para investigar el transporte de moléculas cargadas y descargadas a través del cartílago articular con la ayuda de métodos numéricos y experimentales desarrollados recientemente.
Abstract
La osteoartritis (OA) es una enfermedad debilitante que está asociada con la degeneración del cartílago articular y el hueso subcondral. Degeneración del cartílago articular deteriora su función de soporte de carga sustancialmente como se experimenta tremenda degradación química, es decir, proteoglicanos y colágeno pérdida de fibrillas de interrupción. Una forma prometedora para investigar mecanismos de daño químico durante OA es exponer los especímenes de cartílago a un soluto externo y controlar la difusión de las moléculas. El grado de daño del cartílago (es decir, la concentración y la configuración de las macromoléculas esenciales) se asocia con la pérdida de energía de colisión de solutos externos mientras se mueve a través de cartílago articular crea diferentes características de difusión en comparación con el cartílago sano. En este estudio, se introduce un protocolo, que consta de varios pasos y se basa en desarrollado previamente experimental micro-C14px; "> omputed T omography (micro-CT) y la modelización de elementos finitos el transporte de moléculas yodadas cargadas y no cargadas se registra primero utilizando micro-CT, que es seguido por la aplicación de modelos de elementos finitos multifásicas para obtener coeficientes de difusión bifásica-soluto y. y fija densidades de carga a través de zonas de cartílago.
Introduction
Transporte molecular juega un papel vital en la homeostasis de juntas de articulación, la entrega de la terapéutica para el cartílago articular y el cartílago de formación de imágenes de contraste mejorado 1, 2, 3. Factores tales como la integración del cartílago y integridad, la carga de soluto y tamaño, así como la osmolalidad y la concentración de baño en contacto con el cartílago puede influir en la velocidad de transporte 4, 5, 6. El transporte de solutos, ya sea neutros o con carga, puede ser diferente entre las zonas de cartílago articular, debido a que cada zona se compone de diferentes concentraciones y orientaciones de las principales moléculas de la matriz extracelular, es decir, los proteoglicanos (PGs) y colágeno de tipo II 1, 7, 8, 9,lass = "xref"> 10, 11. Más importante aún, el transporte de solutos cargados puede ser dependiente de la concentración de proteoglicanos que comprenden cargas fijas negativas dentro de la matriz extracelular que aumenta a través de cartílago articular 8, 9 altamente. Esos parámetros densidad de carga particularmente fija (FCD), orientación de las fibrillas de colágeno y variación del contenido de agua a través de cartílago pueden sufrir alteraciones como osteoartritis (OA) progresa, significando con ello la importancia de estudiar la difusión a través del cartílago.
En el estudio actual, un protocolo basado en estudios experimentales y computacionales previamente establecidos 6, 8, 9 se propone investigar con precisión de difusión en diversas condiciones de contorno utilizando solutos neutros y cargados en un modelo finito baño de difusión. Tpropuso métodos están compuestos de formación de imágenes micro-tomografía computarizada (micro-CT) de una sistema incluyendo el cartílago y una finito baño de apoyo de avanzada modelos de elementos finitos multifásicas bifásica-soluto y. Estos modelos permiten la obtención de los coeficientes de difusión de las moléculas neutras y cargadas, así como DME a través de varias zonas de cartílago articular. El uso de estos modelos, se puede obtener una mejor comprensión del comportamiento de las moléculas neutras y cargadas de difusión que podrían ser utilizados para investigar las interacciones entre cartílago y superponiendo finita baño.
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Protocol
NOTA: El protocolo que aquí se presenta se adoptó a partir de los procedimientos experimentales y computacionales de los últimos trabajos de investigación 6, 8, 9. El protocolo se ilustra en la Figura 1.
Los materiales de cadáveres fueron recogidos con el permiso de la Facultad de Veterinaria de la Universidad de Utrecht.
1. La muestra y Bath Preparación
- Taladrar tapones osteocondrales cilíndricos (diámetro de 8,5 mm) de cóndilos femorales equino de cadáver utilizando broca a medida (Figura 1) durante la pulverización tamponada con fosfato fría Saline (PBS) para evitar el sobrecalentamiento y el subsiguiente daño del cartílago.
- De termocontracción los tapones osteocondrales con un plástico contracción de la manga para reducir al mínimo la difusión lateral de la bañera superposición.
- Montar el tapón osteocondral de cartílago en el the superior inicialmente dentro del manguito de contracción plástica y seguir soplando aire caliente a la misma. Agregar los trozos de algodón húmedo en la superficie del cartílago para evitar daños relacionados con el calor.
- Preparar finitos-baños de (por ejemplo, 650 ml, 420 mM, el ioxaglato de peso molecular (MW) = 1.269 Da, carga = -1) solutos cargados y neutral (650! L, 420 mM, iodixanol, MW = 1550 Da) por separado.
- Cargar las finitos-baños preparados en la superficie del cartílago usando una jeringa y colocar un tapón de corcho en la muestra envuelta para evitar la evaporación durante los experimentos a temperatura ambiente (Figura 2A). Para estudiar el transporte de solutos neutra, colocar el baño de iodixanol y estudiar el lugar el transporte de solutos cargados negativamente baño ioxaglato sobre la superficie del cartílago.
2. Imágenes y Procesamiento de Imágenes
- Colocar las muestras envueltos aislados con el tapón de corcho en un soporte hecho a medida unido a la platina motorizada de un micro-CT. lugar tque muestra de manera que la superficie de cartílago cubierto con una solución de agente de contraste se enfrenta hacia arriba.
- Escanear con el micro-CT (tamaño de vóxel de 40 × 40 × 40 m 3, tiempo de exploración de 2 min, voltaje del tubo de 90 kV y la corriente del tubo de 180 μA) un campo de visión que consta de cartílago, la placa subcondral, y finita baño en varios puntos de tiempo hasta el estado de equilibrio (48 h) se alcanza (Figura 2A). El estado de equilibrio se alcanza cuando los valores de concentración no cambian con el tiempo.
- Registrar las imágenes en 3D en diferentes puntos de tiempo sobre la base de la imagen inicial para facilitar el posicionamiento de la región de interés (ROI) utilizando el software del fabricante (por ejemplo, analizar).
- Convertir el 3D reconstruido imágenes de micro-CT en 2D Tagged Image File Format (TIFF) pila antes de procesarlos utilizando el software del fabricante.
- Globalmente segmento (ImageJ> Ajustar> Umbral) el cartílago del hueso subcondral y más dementira baño en el software.
- Obtener el valor medio gris del cartílago en diferentes puntos temporales (ImageJ> Análisis> Medida) usando la máscara de cartílago generado en el paso anterior.
- Dada la concentración del baño inicial y la concentración inicial de agente de contraste en el cartílago, utilizar una curva de calibración lineal para convertir los valores de gris promedio de la concentración real de solutos. Los datos anteriores apoyan el hecho de que los valores de gris mantienen una relación lineal con la concentración de agentes de contraste.
- Trazar las concentraciones de soluto en comparación con los puntos de tiempo de experimentación.
3. Modelización Computacional
NOTA: La difusión en este problema se supone que tendrá lugar en 1D (a lo largo del eje z), que cumple con la condición de contorno experimental. Por lo tanto, la geometría se podría crear de forma arbitraria.
- Construir modelos cartílago multizona basados finito-Bath: 1) el cartílago que consiste en zona superficial (20% del espesor total del cartílago), zona media (50% del espesor total del cartílago) y zona profunda (30% del espesor total del cartílago) 12 y 2) finita baño en Febio 13, 14 (Figura 2B).
- Asignar las propiedades mecánicas y físicas de las diferentes zonas del cartílago y baño en Febio. el módulo de Young (10 MPa) se supone que es lo suficientemente alta para resistir la presión osmótica ejercida por el baño de suprayacente y por lo tanto proteger el cartílago de deformaciones excesivas.
- Utilice una permeabilidad hidráulica de 10 -3 mm 4 / Ns y la relación de Poisson de 0. Uso coeficiente de soluto difusión real del baño en las simulaciones 8, 9.
- Generar malla (elementos 8-nodo trilineal hexaedros) y refinarlo cerca de los límites (Figura 2B)class = "xref"> 8, 9.
- modelo bifásico-soluto
- Aplicar concentración inicial de soluto en el baño y eficaz de presión correspondiente a la misma. Mira la descripción de presión efectiva en 9, 15.
- Ejecutar el modelo en modo transitorio para obtener la concentración de soluto frente a curvas de tiempo de acuerdo con los coeficientes de difusión prescritos en diferentes zonas del cartílago.
- modelo multifásico
NOTA: La fluctuación eléctrica entre el baño y el tejido se puede evitar mediante la adición de dos monovalentes contra-iones tanto para el baño y el tejido.- Para los modelos de estado estacionario: utilizar las mismas presiones de fluido eficaces y las concentraciones en el cartílago y baño suprayacente al tiempo que aumenta FCD a su valor deseado.
- Para los modelos transitorios: crear un finito baño bien agitada, manteniendo el coeficiente de difusión de solutos en el baño suficientemente alta. inyectar elsoluto desde la interfaz de aire del baño en el baño para alcanzar su valor de concentración deseado.
- Transient: eliminar la condición de contorno concentración de soluto prescrito en el paso anterior y revertir el coeficiente de difusión de la finita baño a su coeficiente de difusión real.
- Ejecutar el modelo para obtener soluto curvas de concentración-tiempo basado en DME aplicadas y los coeficientes de difusión en diferentes zonas del cartílago.
- Interfaz Febio-MATLAB
- Desarrollar un código MATLAB para realizar automáticamente la simulación en Febio y la trama curvas de concentración-tiempo (interfaz Febio-MATLAB) 8, 9.
- Cambiar los coeficientes de difusión y los DME en las zonas de cartílago utilizando la interfaz Febio-MATLAB. Ejecutar modelos en Febio y extraer curvas de soluto de concentración-tiempo 8, 9.
- Comparar el soluto obtenido las curvas de concentración-tiempo con el experimentaldatos y obtener conjuntos de coeficientes de difusión y los DME en diferentes zonas del cartílago basado en la raíz error cuadrático medio mínimo (RMSE) 8, 9.
Figura 1: Configuración Experimental. A) procedimiento de extracción de la muestra usando una broca de taladro a medida. B) procedimiento de imágenes micro-CT para supervisar el proceso de difusión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Representación esquemática.A) Diseño experimental. B) modelo computacional multizona que consiste en el baño finita, las zonas superficiales, medias y profundas de cartílago y de malla asociado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Representative Results
Los resultados representativos que aquí se adoptan a partir de los trabajos de investigación anteriores 6, 8, 9, 16.
En la OA, el cartílago articular sufre cambios significativos más importante la pérdida de la mordaza, y fibrillas de colágeno daño 17, 18, 19. Esos cambios pueden afectar el comportamiento difusivo de solutos a través del cartílago articular 20, 21. Estudiamos la difusión axial de dos agentes de contraste yodados, es decir, iodixanol (carga = 0) y ioxaglato (carga = -1), en tapones osteocondrales equino de cadáver utilizando micro-CT. Para cuantificar el proceso de difusión de un soluto neutro (iodixanol), un modelo bifásico-soluto y una solu cargada te (ioxaglato) modelo multifásico se desarrollaron en Febio que considera la estructura zonal del cartílago. El modelos multifásicos bifásica-soluto y podían predecir la difusión de iodixanol y ioxaglato a través del cartílago articular (Figura 3). Estos modelos permitieron la obtención de coeficiente de difusión de iodixanol (bifásica-soluto) y coeficiente de difusión, así como FCD (ioxaglato) en diferentes zonas del cartílago 8, 9.
Figura 3: Computacionalmente ajuste de curva de datos. A) Multi-zona bifásica-soluto (discontinua) frente a los datos y B) modelos encaja multifásicos (discontinuas) frente a los datos experimentales (símbolo) 8, 9 experimentales.: //ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54984/54984fig3large.jpg" target = '_ blank'> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Nosotros presentamos un protocolo experimental combinado con un procedimiento de modelado de elementos finitos para estudiar la difusión de solutos neutros y cargadas a través de cartílago articular. De acuerdo con nuestros estudios recientes, los modelos propuestos podrían describir con precisión el transporte de ambos neutral (bifásica-soluto) y solutos (multifásicos) cargados negativamente a través de diferentes zonas de cartílago articular 8, 9. Se cree ampliamente que el cartílago articular se vuelve funcionalmente limitada por la pérdida de sus componentes vitales como macromoléculas de GAG cargadas negativamente, así como las fibrillas de colágeno durante OA progresión 21, 22, 23, 24. Utilizando la técnica propuesta en este estudio, uno potencialmente puede examinar la salubridad del cartílago articular. El transporte de soluto neutro puede ser aumentada en la OA primar ily debido a las interacciones menores entre el soluto, así como GAGs y colágenos. Por otro lado, el transporte de solutos cargados negativamente podría ayudar a adquirir la información con respecto a la concentración de cargas fijas de proteoglicanos, lo que da una indicación del nivel de progresión de la OA.
Los modelos multifásicos bifásica-soluto y que fueron desarrollados basa en la aparición de concepto finito baño de acuerdo con los estudios previos podrían servir como plataformas por que se preste una estimación precisa de las propiedades de zona de cartílago articular. Limitaciones asociadas con grandes baños de agentes de contraste, a saber posible haz de endurecimiento artefactos, y la asignación de un único coeficiente de difusión al cartílago articular 7, 20, 25, 26, 27, 28,lass = "xref"> 29, 30 condujo la motivación para desarrollar el estudio actual. En el futuro la investigación OA, nuestros modelos desarrollados podrían potencialmente encontrar aplicaciones para el diagnóstico precoz de OA.
Hay algunos pasos críticos necesarios tanto en experimentos y simulaciones computacionales. Para preservar la integridad del cartílago durante los experimentos, se podría requerir la adición de cantidades suficientes de inhibidores de la proteasa para prevenir actividades enzimáticas subsiguientes. En caso de utilizar una muestra por más de un experimento, tiempo de lavado de salida para los solutos penetrado tras el equilibrado fue de aproximadamente 48 h. La eficiencia de lavado de salida necesita ser comprobada mediante micro-CT. Al utilizar nuestro conjunto hasta el empleo de cartílago equino, el volumen mínimo de la bañera suprayacente equivalente a un baño de infinito se calculó que era cinco veces mayor que el volumen del cartílago. Por otra parte, para llevar a cabo la modelización de elementos finitos de la difusión, es fundamental para aplicar soluto real difusión Coefficient en el baño desde desviación de esa podría afectar los resultados.
En los modelos de elementos finitos subyacentes, efecto del tamaño del soluto no se implementó y por lo tanto no podía ser estudiada. Nuestro modelo finito baño propuesto ofrece algunas ventajas, a saber, proceso de difusión comprensión en las articulaciones articulares más apropiadamente, y la reducción de artefactos de endurecimiento del haz. Nuestra técnica propuesta la combinación de los experimentos y los modelos computacionales permite escrutar los atributos de difusión de cartílago cuando se aplican los agentes de contraste cargados positivamente. El conocimiento del coeficiente de difusión de solutos real en el baño parece ser crucial, ya que podría afectar significativamente la exactitud de los coeficientes de difusión obtenidos a través del cartílago articular. Esto requeriría ya sea obtenido el coeficiente de difusión de baño experimentalmente o utilizando fácilmente valores de la literatura.
En conclusión, hemos propuesto un protocolo general que consiste en experimentos ycálculos para investigar el transporte de solutos cargados y no cargados a través del cartílago articular. Utilizando el protocolo, se puede obtener con éxito los coeficientes de difusión y densidades cargadas fijos en diferentes capas de cartílago.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean expresar su agradecimiento al Sr. Jeroen van den Berg y el Sr. Matthijs Wassink del grupo de desarrollo de la mecánica en UMC Utrecht por su ayuda en el proceso de los tapones osteocondrales de envolver. Este trabajo fue apoyado por una beca de la Fundación holandesa artritis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hexabrix | Guerbet | 15HX005D | Negatively-charged contrast agent |
| Visipaque | GE healthcare | 12570511 | Nuetral contrast agent |
| PBS (Phosphate-buffered Saline) | Life technologies | 10010023 | Medium |
| micro-CT | Perkin Elmer | Monitoring diffusion | |
| Freezing-point osmometer | Advanced instruments | Measuring solution osmolality |
References
- Arkill, K. P., Winlove, C. P. Solute transport in the deep and calcified zones of articular cartilage. Osteoarthritis Cartilage. 16 (6), 708-714 (2008).
- Chin, H. C., Moeini, M., Quinn, T. M. Solute transport across the articular surface of injured cartilage. Arch Biochem Biophys. 535 (2), 241-247 (2013).
- Leddy, H. A., Guilak, F. Site-specific effects of compression on macromolecular diffusion in articular cartilage. Biophys J. 95 (10), 4890-4895 (2008).
- Leddy, H. A., Guilak, F. Site-Specific Molecular Diffusion in Articular Cartilage Measured using Fluorescence Recovery after Photobleaching. Annals of Biomedical Engineering. 31 (7), 753-760 (2003).
- Gu, W. Y., Yao, H. Effects of hydration and fixed charge density on fluid transport in charged hydrated soft tissues. Ann Biomed Eng. 31 (10), 1162-1170 (2003).
- Pouran, B., Arbabi, V., Zadpoor, A. A., Weinans, H. Isolated effects of external bath osmolality, solute concentration, and electrical charge on solute transport across articular cartilage. Medical Engineering and Physics. 38 (12), 1399-1407 (2016).
- Kulmala, K. A. M., et al. Diffusion coefficients of articular cartilage for different CT and MRI contrast agents. Medical Engineering & Physics. 32 (8), 878-882 (2010).
- Arbabi, V., Pouran, B., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Transport of Neutral Solute Across Articular Cartilage: The Role of Zonal Diffusivities. Journal of Biomechanical Engineering. 137 (7), 071001-071001 (2015).
- Arbabi, V., Pouran, B., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Multiphasic modeling of charged solute transport across articular cartilage: Application of multi-zone finite-bath model. J Biomech. 49 (9), 1510-1517 (2016).
- Arbabi, V., Pouran, B., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Combined artificial neural networks for robust estimation of the diffusion coefficients across cartilage. 22nd Congress of the European Society of Biomechanics, Lyon, France, , (2016).
- Arbabi, V., Pouran, B., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Combined inverse-forward artificial neural networks for fast and accurate estimation of the diffusion coefficients of cartilage based on multi-physics models. Journal of Biomechanics. , (2016).
- Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. The Basic Science of Articular Cartilage: Structure, Composition, and Function. Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).
- Holzapfel, G. A., Kuhl, E. Ch. 17. Computer Models in Biomechanics. , Springer. Netherlands. 231-249 (2013).
- Ateshian, G. A., Maas, S., Weiss, J. A. Multiphasic Finite Element Framework for Modeling Hydrated Mixtures With Multiple Neutral and Charged Solutes. Journal of Biomechanical Engineering. 135 (11), 111001-111001 (2013).
- Arbabi, V., Pouran, B., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Transport of neutral solute across articular cartilage and subchondral plate. 22nd Congress of the European Society of Biomechanics, Lyon, France, , (2016).
- Pouran, B., Arbabi, V., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Application of multiphysics models to efficient design of experiments of solute transport across articular cartilage. Comput Biol Med. 78, 91-96 (2016).
- Hosseini, S. M., Wu, Y., Ito, K., Donkelaar, C. C. The importance of superficial collagen fibrils for the function of articular cartilage. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 13 (1), 41-51 (2013).
- Alexopoulos, L. G., Williams, G. M., Upton, M. L., Setton, L. A., Guilak, F. Osteoarthritic changes in the biphasic mechanical properties of the chondrocyte pericellular matrix in articular cartilage. Journal of Biomechanics. 38 (3), 509-517 (2005).
- Felson, D. T., et al. Osteoarthritis: new insights. Part 1: the disease and its risk factors. Ann Intern Med. 133 (8), 635-646 (2000).
- Kokkonen, H. T., Jurvelin, J. S., Tiitu, V., Toyras, J. Detection of mechanical injury of articular cartilage using contrast enhanced computed tomography. Osteoarthritis Cartilage. 19 (3), 295-301 (2011).
- Raya, J. G., et al. Diffusion-tensor imaging of human articular cartilage specimens with early signs of cartilage damage. Radiology. 266 (3), 831-841 (2013).
- Tavakoli Nia, H., et al. Aggrecan Nanoscale Solid-Fluid Interactions Are a Primary Determinant of Cartilage Dynamic Mechanical Properties. ACS Nano. 9 (3), 2614-2625 (2015).
- Arbabi, V., Campoli, G., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Estimation of cartilage properties using indentation tests, finite element models, and artificial neural networks. 11th World Congress on Computational Mechanics & 5th European Conference on Computational Mechanics, Barcelona, Spain, , (2014).
- Arbabi, V., Pouran, B., Campoli, G., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Determination of the mechanical and physical properties of cartilage by coupling poroelastic-based finite element models of indentation with artificial neural networks. Journal of Biomechanics. 49 (5), 631-637 (2016).
- Kokkonen, H. T., et al. Computed tomography detects changes in contrast agent diffusion after collagen cross-linking typical to natural aging of articular cartilage. Osteoarthritis and Cartilage. 19 (10), 1190-1198 (2011).
- Decker, S. G., Moeini, M., Chin, H. C., Rosenzweig, D. H., Quinn, T. M. Adsorption and Distribution of Fluorescent Solutes near the Articular Surface of Mechanically Injured Cartilage. Biophysical Journal. 105 (10), 2427-2436 (2013).
- Silvast, T. S., Jurvelin, S. J., Tiitu, V., Quinn, T. M., Töyräs, J. Bath Concentration of Anionic Contrast Agents Does Not Affect Their Diffusion and Distribution in Articular cartilage In Vitro. Cartilage. 4 (1), 42-51 (2013).
- Silvast, T. S., Jurvelin, J. S., Lammi, M. J., Töyräs, J. pQCT study on diffusion and equilibrium distribution of iodinated anionic contrast agent in human articular cartilage - associations to matrix composition and integrity. Osteoarthritis and Cartilage. 17 (1), 26-32 (2009).
- Pouran, B., Arbabi, V., Villamar, J., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Contrast agent's transport across healthy articular cartilage under various bath conditions. Orthopaedic Research Society Annual Meeting, Las Vegas, Nevada, , (2015).
- Arbabi, V., Pouran, B., Weinans, H., Zadpoor, A. A. Application of a biphasic-solute model in predicting diffusive properties of osteochondral interface. International Workshop on Osteoarthritis Imaging (IWOAI), Oulo, Finland, , (2016).
