Abstract
Global opvarmning og eutrofiering foretage nogle akvatiske økosystemer opfører sig som sande bioreaktorer, der udløser en hurtig og massiv cyanobakteriel vækst; dette har relevant sundhedsmæssige og økonomiske konsekvenser. Mange cyanobakterielle stammer er toksin producenter, og kun nogle få celler er nødvendige for at inducere uoprettelig skade på miljøet. Derfor vand-body myndigheder og forvaltninger kræver hurtige og effektive varslingssystemer, der leverer pålidelige data til at støtte deres forebyggende eller helbredende beslutninger. Dette manuskript rapporterer en forsøgsprotokol for i marken påvisning af toksin-producerende cyanobakterielle stammer ved anvendelse af et antistof microarray chip med 17-antistoffer (ABS) med taksonomiske opløsning (CYANOCHIP). Her en multiplex fluorescerende sandwich microarray immunassay (FSMI) til samtidig overvågning af 17 cyanobakterielle stammer ofte findes blomstrende i ferskvandsøkosystemer, nogle af dem toksin producenter, er beskrevet. En mikroarray med multipel identiske gentagelser (op til 24) af CYANOCHIP blev trykt på et enkelt objektglas til samtidig teste et lignende antal prøver. Flydende prøver kan testes enten ved direkte inkubering med antistoffer (Abs) eller efter cellekoncentration ved filtrering gennem en 1- til 3-um filter. Faste prøver, såsom sedimenter og jord klipper, først homogeniseres og dispergeres ved en håndholdt ultralydsapparat i en inkubationsbuffer. De er derefter filtreret (5 - 20 um) til fjernelse af groft materiale, og filtratet inkuberes med Abs. Immunreaktioner afsløres ved en endelig inkubation med en blanding af 17 fluorescens-mærkede Ab'er og læses af en bærbar fluorescensdetektor. Hele processen tager omkring 3 timer, det meste af det, der svarer til to 1-h perioder med inkubation. Outputtet er et billede, hvor lyspunkter svarer til den positive detektion af cyanobakterielle markører.
Introduction
Den afsløring og overvågning af mikroorganismer i komplekse naturlige mikrobielle samfund er afgørende i mange områder, herunder biomedicin, miljømæssig økologi, og astrobiologi. Cyanobakterier er prokaryote mikroorganismer velkendte for deres evne til at danne blomstrer (overdreven spredning) af celler i ferskvand. De er allestedsnærværende, og mange arter er i stand til at producere toksiner, hvilket ikke kun en potentiel risiko for menneskers sundhed, men også til en økologisk effekt. I denne forbindelse er det vigtigt at udvikle hurtige og følsomme metoder til tidlig påvisning af cyanobakterier og / eller deres toksiner i jord og vand. Til dette formål har en multiplex fluorescerende sandwich microarray immunassay (FSMI) er udviklet som et redskab til vand ledere til at hjælpe dem med at træffe beslutninger og dermed at gennemføre ordentlige vand management programmer.
En bred vifte af metoder er blevet udviklet til at opdage og identificere cyanobacterial celler og ALGEGIFT i jord og vand, herunder optisk mikroskopi, molekylær biologi, og immunologiske teknikker. Disse metoder kan variere meget i de oplysninger, de giver. Mikroskopiske teknikker er baseret på cellemorfologi og påvisning af in vivo-fluorescens fra cyanobakterielle pigmenter, såsom phycocyanin eller klorofyl a 1. Selv om de er hurtige og billige metoder til real-time og hyppig kontrol der informerer om typen og antallet af cyanobakterier til stede i en prøve, de ikke giver oplysninger om den potentielle toksicitet. Desuden kræver de en vis grad af ekspertise, i betragtning af at det ofte er meget svært at skelne mellem nært beslægtede arter 2. For at overvinde disse begrænsninger, skal lysmikroskopi ledsages af både biologiske og biokemiske screening assays og fysisk-kemiske metoder til identifikation og kvantificering af ALGEGIFT.
Er blevet anvendt Molekylære-baserede metoder i årtier at påvise, identificere og kvantificere cyanobakterier og deres tilsvarende ALGEGIFT takket være de oplysninger sekvens offentliggjort i genomdatabaser (fx National Center for Biotechnology Information, NCBI). Blandt disse metoder er sådanne baseret på polymerasekædereaktion (PCR), hvori der kræves udformning af sæt af primere for DNA-amplifikation og afhænger af forudgående kendskab til DNA-sekvenser af forskellige cyanobakterielle arter. Mens gen afsløring, ligesom phycocyanin operon, fører til præcis identifikation på slægten niveau, nogle arter eller stammer er uopdaget meddenne metode. Men toksin gener, såsom dem, der tilhører den microcystin operon, lette identifikationen af toksiner i prøver, hvor producenterne er knappe 5. Alligevel gør påvisningen af toksin markører ved PCR ikke nødvendigvis toksicitet i miljøet. Desuden sæt primere, der er udviklet til at analysere hele spektret af arter af cyanobakterier og toksinvåben producenter til stede i en prøve er stadig ufuldstændig, og yderligere undersøgelser skal gøres for at identificere ukendte arter. Andre molekylære teknikker er ikke-PCR-baseret, såsom fluorescens in situ hybridisering (FISH) og DNA microarrays.
I de sidste to årtier har microarray teknologi fået større betydning i mange anvendelsesområder, især i miljøovervågning. Mikromatrice mulighed for forskelsbehandling mellem arter og analytter 4, 6, 7 sup>, 8, 9, 10, men de betragtes meget omstændelig og tidskrævende opgaver, der involverer flere trin (f.eks microarray ydeevne, DNA ekstraktion, PCR-amplifikation og hybridisering). Af denne grund, mindre tidskrævende assays baseret på antistoffer, såsom sandwich og konkurrencedygtige immunologiske mikroarrays, er blevet et vigtigt og pålidelig høj kapacitet til påvisning af multiple miljømæssige analytter 11, 12, 13. Evnen af antistoffer til specifikt at genkende deres målforbindelser og at detektere små mængder af analytter og proteiner, sammen med muligheden for at fremstille antistoffer mod næsten ethvert stof, gør antistof-mikroarrays en kraftfuld teknik til miljømæssige formål. Desuden evnen til at opnå multiple analyser somIngle assay med detektionsgrænser spænder fra ppb til PPM, er en af de vigtigste fordele ved denne metode 14.
Antistofbaserede biosensorer har vist sig at være følsomme og hurtige værktøjer til påvisning af en lang række patogener og toksiner i miljøovervågning 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21. Mens DNA-metoder involverer flere trin, kun de antistof-baserede mikroarrays kræver en lille prøve forberedelse, der primært er baseret på en kort lyse skridt i en passende løsning buffer. Delehanty og Ligler 15 rapporterede samtidig påvisning af proteiner og bakterielle analytter i komplekse blandinger på basis af et antistof sandwich immunoassay stand til at detektere en proteinkoncentration på 4 ppb end 10 4 cfu / ml celler. Szkola et al. 21 har udviklet en billig og pålidelig multiplex microarray til samtidig påvisning af proteotoxins og små toksiner, forbindelser, der kan anvendes i biologisk krigsførelse. De opdages koncentrationer af ricin toksin, med en detektionsgrænse på 3 ppb, på mindre end 20 min. For nylig er CYANOCHIP, et antistof microarray-baseret biosensor til in situ detektion af giftige og ikke-toksisk cyanobakterier, blevet beskrevet 22. Denne microarray muliggør identifikation af potentielle cyanobakterielle blooms, mest i vandmiljøer, som er vanskelige at identificere mikroskopisk. Detektionsgrænsen af microarray er 10 Marts 2-10 celler for de fleste arter, dreje denne biosensor til et omkostningseffektivt redskab til multiplex detektion og identifikation af cyanobakterier, selv på artsniveau. Alle disse egenskaber gør Antibody microarray teknik, og især den fremgangsmåde præsenteres i dette arbejde, en hurtigere og enklere metode i forhold til de førnævnte teknikker.
Dette arbejde viser to eksempler på forsøg, der anvender et antistof microarray-baseret biosensor til påvisning af tilstedeværelsen af cyanobakterier i jord- og vandprøver. Det er en enkel og pålidelig metode baseret på en sandwich immunoassay format, som kræver meget små prøvevolumener og meget grundlæggende prøveforberedelse. Metoden kræver en kort tid og kan let udføres i marken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af immunogenerne
- Grow hver cyanobakteriel stamme i den tilsvarende dyrkningsmedium under betingelser beskrevet i tabel 1.
BEMÆRK: vækstmedium og dyrkningsbetingelser for hver cyanobakterier stamme er anført i tabel 1. Alle cyanobakterielle stammer, med undtagelse af K17, tilhører Antonio Quesada gruppe fra Autonoma University (Madrid, Spanien). Antistoffet mod Planktothrix rubescens blev genereret fra en naturlig prøve af monospecifikke flor af denne cyanobakterien fra Vilasouto reservoir (nordlige Spanien). - Kvantificere antallet af celler under anvendelse af en celletælling kammer ved optisk mikroskopi for at opnå cirka 10 8 celler / ml fra en sen eksponentiel eller stationær vækstfase kultur.
- Harvest celler fra 5 ml kultur ved centrifugering ved 2000 xg i 5 min.
- Supernatanten fjernes, og cellerne resuspenderes i 10 ml tube med 5 ml 1x phosphatpufret saltvand (1x PBS) for at opnå omkring 10 8 celler / ml.
- Homogeniseres og lysere cellerne i suspensionen ved sonikering i 5 cykler, 30 s hver, med en 30- til 60-s pause på is under anvendelse af en bærbar, håndholdt ultrasonisk processor eller ved at dyppe røret i vandbad på en celle disruptor ved maksimal amplitude (30 kHz).
- Gentag trin 1.3 - 1,5 for hver stamme af cyanobakterien.
BEMÆRK: Sonikering producerer celle forstyrrelser og cellulære indhold udgivelse. Mens proteiner og polysaccharider er gode immunogener, specifikke molekyler, såsom lipider og nukleinsyrer, inducerer ikke en humoral immunogen respons af sig selv. Derfor skal de binder til bærere, såsom polysaccharider eller proteiner, for at forøge den molekylære kompleksitet. Desuden lydbehandling frigiver intracellulært materiale, der kan udløse antistofproduktion.
2. Produktion af polyklonale antistoffer
- Forbered første immunogen dosis ved blanding 0,5 ml af den ultralydbehandles cellelysat opnået i trin 1.5 med 0,5 ml komplet Freunds adjuvans. Levere den til operatøren af et dyr facilitet for polyklonale kanin antistof produktion.
- Forbered tre flere doser som før til yderligere anvendelse som memory boosts i antistoffet produktionsprocessen ved blanding 0,5 ml af den samme homogenat / lysat opnået i trin 1,5 med 0,5 ml ukomplet Freunds adjuvans. Give dem til dyret mulighed for at opfylde antistoffet produktionsprocessen.
- Gentag trin 2.1 og 2.2 for hver ny antistof produktionsproces.
BEMÆRK: Normalt antistofproduktion overladt til specialiserede dyrefaciliteter eller virksomheder, fordi passende licenser og uddannelse er nødvendig for at arbejde med dyr. Selskaberne levere en relativ enzymkoblet immunosorbentassay (ELISA) måling af mængden af antigen-specifikke antistoffer til stede i serumprøven.
3. Antistof Purifgement
- Oprens immunoglobulin G (IgG) -fraktion fra både immune og præimmune serum opsamlet i trin 2 ved protein-A-affinitetskromatografi. Nogle kommercielle rensning kits, baseret på patron systemer fungerer godt; Følg udbyder anvisninger.
- Når oprensningskit ikke giver et afsaltning system ændre bufferen efter elueringen af de oprensede antistoffer mod 0,1X PBS, enten ved dialyse eller ved hjælp centrifugale filterindretninger med en 100-kDa (eller lavere) membranporestørrelse.
- Bestemme koncentrationen antistof ved at måle absorbansen ved 280 nm eller ved anvendelse af kolorimetriske fremgangsmåder, såsom Bradford 23, Lowry 24 eller bicinchoninsyre (BCA) 25.
BEMÆRK: Det er vigtigt at undgå at medtage amingrupper i elueringsbufferen (f.eks Tris-buffere), fordi de konkurrerer med antistoffet om binding til faste overflader aktiveret med epoxygrupper. efter purification, er det vigtigt at teste antistoffet aktivitet med ELISA.
4. Fluorescens Antibody Mærkning
- Mærke de oprensede antistoffer opnået i afsnit 3 med et fluorochrom (fx en langt-rødt fluorescerende farvestof) ved opløsning af en kommerciel hætteglas indeholdende farvestof til mærkning 1 mg protein i 100 pi dimethylsulfoxid (DMSO). Tilsæt 2 pi af det opløste farvestof til hver antistofpræparat i en koncentration på 2 mg / ml i et slutvolumen på 50 pi i 50 mM phosphat-bufret saltvand (pH 8,5).
- Vedligehold mærkningsreaktionerne under kontinuerlig omrøring i 1 time ved omgivelsestemperatur og 1.200 rpm på en vibrerende platform.
- Oprens de mærkede antistoffer ved størrelsesudelukkelseskromatografi (fx under anvendelse af en gel med en fraktionering mellem 1,5 og 30 kDa fanget i en søjle), efter leverandørens anbefalinger.
- Absorbansen ved 280 nm og ved 650 nm i eluater og beregne labeLing effektivitet efter leverandørens anbefalinger.
BEMÆRK: Up to 50 x 50-pi reaktioner antistof-mærkning kan gøres med et enkelt hætteglas af det fluorescerende farvestof for mærkning 1 mg protein. Det anbefales at dække rørene med aluminiumsfolie eller alternativt at bruge uigennemsigtige 0,5-ml rør for at undgå quenching processer efter trin 4.3. For IgG-antistoffer, er optimal mærkning opnås med 3-7 mol af farvestoffet pr mol antistof.
5. CYANOCHIP Produktion
- Antistoffer og kontroller i printløsning
- Forbered 30 pi af hver oprensede antistof i printløsning ved blanding hvert antistof ved 1 mg / ml i en kommerciel 1x protein trykning puffer med 0,01% (v / v) Tween 20 (et ikke-ionisk detergent), alle som slutkoncentrationer.
BEMÆRK: Alternativt kan et antistof opløsning indeholder 20% glycerol, 1% (vægt / volumen) saccharose (eller trehalose, som et konserveringsmiddel) og 0,01% (v / v) Tween 20 i carbonatbuffer (pH 8,5). - Forbered 30 pi af printløsning som kontroller: (a) 1x protein trykning puffer med 0,01% (v / v) Tween 20, (b) protein-A oprenset præimmunserum ved 1 mg / ml i 1 x protein trykning buffer med 0,01% (v / v) Tween 20, og (c) bovint serumalbumin (BSA) ved 1 mg / ml i 1x protein trykning puffer med 0,01% (v / v) Tween 20.
- Forbered 30 pi af en fluorescens-mærket, oprenset præimmunserum ved forskellige koncentrationer (f.eks fra 50 ug / ml til 1 pg / ml) i 1x protein trykning buffer med Tween 20, som i trin 5.1.1. Disse prøver vil blive brugt som fluorescerende ramme markører og for relativ fluorescens kvantificering efter spotting.
- Tilføj 30 uL per brønd af printløsninger udarbejdet i trin 5.1.1, 5.1.2 og 5.1.3 til den højeste kvalitet 384-godt mikroplader for microarray produktion, såsom polypropylen.
BEMÆRK: Protein trykning buffer øger kvaliteten og stabiliteten af antistofferne, og Tween 20 homogeniserer spot morphology og opbygger proteinkobling op. Det anbefales at opretholde 384-brønds mikroplade ved 4 ° C før brug. Opbevare det ved -20 ° C i længere tid. Polypropylen har lav DNA, protein, celleekstrakt, og små-molekyle iboende binding.
- Forbered 30 pi af hver oprensede antistof i printløsning ved blanding hvert antistof ved 1 mg / ml i en kommerciel 1x protein trykning puffer med 0,01% (v / v) Tween 20 (et ikke-ionisk detergent), alle som slutkoncentrationer.
- Antistof udskrivning på et objektglas
BEMÆRK: Udskriv antistofferne onto aktiverede objektglas ved hjælp af forskellige array-platforme, ligesom kontakt, split-nål, eller ikke-kontakt-enheder, såsom piezoelektriske printere eller "inkjet" teknologier. I dette arbejde har CYANOCHIP rutinemæssigt blevet trykt ved kontakt under anvendelse af et robotsystem (arrayer) i stand til at spotte nL mængder af antistofferne på um skala.- Indstil de miljømæssige forhold trykkeriet til 20 ° C og 40 - 50% relativ fugtighed.
- Opsæt slide substrater (f.eks 75- x 25 mm epoxy-aktiverede mikroskop objektglas) til at udføre flere identiske antistof arrays på hver slide.
- Spot hver oprensede antistof, herunder kontrol og referenceramme, i en tredobbelt spot mønster; under disse betingelser, pletterne er 180 - 200 um i diameter.
- Efter trykning forlade objektglassene i mindst 30 minutter ved omgivelsestemperatur for at lade dem tørre, og derefter opbevares ved 4 ° C; til arbejde i marken, kan objektglassene transporteres og opbevares ved omgivelsestemperatur i adskillige måneder.
BEMÆRK: CYANOCHIP udskrives i tredobbelt spot microarray-format med 3 x 8 identiske mikroarrays pr dias eller 9 identiske arrays i en 1 x 9 microarray-format. Hver array-størrelse må ikke være højere end reaktionskammeret dimensioner for en 24-brønds pakning (sædvanligvis 7,5 x 6,5 mm i et 3 x 8 hybridisering kammer). - Før du bruger microarray at analysere miljøprøver, bruge FSMI til at bestemme den fortynding for hvert antistof i en titreringskurve. For hvert antistof, bruge en standard koncentration af den tilsvarende immunogen (10 3 - 10 4 celler / ml) og serielle fortyndinger af det fluorescerende antistof (mellem 1: 500 og 1: 32.000). Den optimale koncentration antistof svarer til 50% af det maksimale signal intensitet, der opnås i titreringskurven. Desuden skal sensitivitet og specificitet for hvert antistof bestemmes som beskrevet i Blanco et al. 22.
6. Udarbejdelse af Environmental Multianalyte Ekstrakter til den Fluorescent Sandwich Microarray Immunoassay (FSMI)
- Multianalyte ekstrakt fra en flydende prøve
- Tag 1 - 100 ml af den flydende prøve med en steril sprøjte (f.eks vand fra bredden af et vandreservoir); mængden af prøve er meget afhængig af den potentielle koncentration af målene.
- Koncentrer cellerne ved at lede vandet ledes gennem en 3-um porestørrelse, 47-mm polycarbonat diameter filter; en cellulær koncentrationmellem 10 3 - 10 8 Cells / mL er ønskeligt for positiv detektion, men den faktiske koncentration er ukendt.
- Recover biomassen opsamles i filteret med 1 ml af en modificeret Tris-bufret saltvand, Tween 20-forstærket buffer (TBSTRR; 0,4 M Tris-HCl (pH 8), 0,3 M NaCl og 0,1% Tween 20) ved at skrabe det med en spatel i et 15-ml rør.
- Homogeniseres og disaggregere ved anvendelse af en håndholdt ultralyds-processor, som beskrevet i trin 1.5, eller blot ved pipettering op og ned flere gange; dette forbereder prøven til analyse fra microarray.
- Multianalyte ekstrakt fra en solid stikprøve
- Veje op til 0,5 g af den faste prøve (f.eks, rock, jord eller sedimenter) i en 10-ml rør og tilføje op til 2 ml TBSTRR.
- Soniker ved at nedsænke sonikator sonde i røret, ved at dyppe røret i vandbad på en kraftfuld sonikator horn, eller ved anvendelse af en håndholdt sonikator. Udføre mindst 5 x 30-scyklusser ved 30 kHz, stop for 30 s, mens på is.
- Filtrer for at fjerne sand, ler og andre grove materiale med en 10-ml sprøjte koblet til en 10- til 12-mm diameter, 5- til 20-um porestørrelse nylonfilter holder. Skub prøven gennem filteret i et 1,5-ml rør. Hvis filteret mættede fedtsyrer, agitere suspensionen i sprøjten og tage det til en ny; dette forbereder filtratet materiale til immunassay (trin 7).
BEMÆRK: bufferkapacitet TBSTRR afhænger af typen af prøven. Det er vigtigt at udføre immunoassayet umiddelbart efter fremstillingen af de miljømæssige ekstrakt for at undgå virkningen af enzymatisk nedbrydning på analytter. Alternativt tilsættes proteaseinhibitorer i de miljømæssige ekstrakt og fryse ved -80 ° C indtil det næste trin.
7. Fluorescerende Sandwich Microarray Immunoassay (FSMI)
- Blokering af CYANOCHIP
BEMÆRK: Umiddelbart før brug, behandle pTrykt glider til at blokere alle frie epoxygrupper på objektglasset og at fjerne overskuddet af ikke-kovalent bundne antistoffer.- Fordybe mikroarrayet i 0,5 M Tris-HCI (pH 9) med 5% (w / v) BSA-opløsning på en ren overflade (f.eks petriskål eller en 50-ml rør) med mild omrøring fra en vippeplatform i 5 min. Alternativt lægge glide ned på en 100- til 200-ul dråbe af den ovennævnte løsning med microarray pletter står over for. Lad til stillingen 3 - 5 min og derefter gå videre.
- afhente forsigtigt ad slisken ved hjælp af plast-tippes pincet; forsøge at undgå at røre microarray zoner. Fjernes overskuddet af væske ved sagte banke slide på et stykke køkkenrulle. Nedsænkes i 0,5 M Tris-HCl (pH 8) med 2% (vægt / volumen) BSA-opløsning i 30 minutter med forsigtig omrøring fra en rocker platform.
- Tør objektglasset ved at udføre en kort centrifugering (200 - 300 xg i 1 min) under anvendelse af et kommercielt mikrocentrifuge tilpasset til mikroskopobjektglas. Alternativt, tørre dias ved sagte banke ontoa køkkenrulle.
- Inkubation af multianalyte prøveekstrakt med mikroarrayet
- Opstil dias i en kommerciel microarray hybridisering kassette med 24 brønde til flere microarrays; Følg udbyder anvisninger.
- Efter dias og kassette forsamling, pipette op til 50 pi af prøven ekstrakt eller en fortynding af det i TBSTRR i hver brønd af kassetten.
- Gentag trin 7.2.2 for hver prøve, der skal analyseres.
- Som en blank kontrol, pipette 50 pi TBSTRR buffer i mindst to separate brønde i kassetten.
- Inkuber ved stuetemperatur i 1 time med blanding ved pipettering hver 15 min eller ved at lade det under mild omrystning. Alternativt inkuberes i 12 timer ved 4 ° C.
BEMÆRK: Brug andre inkubation pakninger som en funktion af microarray mønster. Tiden og temperaturen af inkubationen i trin 7.2.5 er empiriske parametre, der afhænger normalt affinitet og bindende kikokinetik af hver sammenkoblet antigen-antistof.
- Vask
- Fjern prøverne ved at sætte kassetten ned og forsigtigt bankede det på en ren, absorberende papir.
- Vask brøndene ved at tilsætte 150 pi TBSTRR til hver enkelt, og fjerne pufferen, som ovenfor.
- Gentag trin 7.3.2 tre gange mere.
- Inkubation med fluorescerende detektor antistoffer
- Tilsæt 50 pi af et antistof blanding indeholdende 17 anti-cyanobakteriel-strain-antistoffer, der hver er mærket med fluorokrom i TBSTRR med 1% (vægt / volumen) BSA. Bestemme koncentrationen af hvert fluorescerende antistof i blandingen (fra 0,7 til 2 g / ml) ved at udføre titreringsforsøg af hvert antigen / antistof par 22.
- Der inkuberes i 1 time ved stuetemperatur, som beskrevet i trin 7.2.5, eller i 12 timer ved 4 ° C.
- Udvaskning af fluorescerende antistoffer </ Strong>
- Fjern de fluorescerende ubundne antistoffer, som i trin 7.3.
- Skil kassetten og fordybe slide i 0,1 x PBS (fx i en 50-ml rør) til en hurtig skylning.
- Tør dias som i trin 7.1.3.
8. Scanning for Fluorescence
- Scan dias til fluorescens ved den maksimale emission fluorescens peak for langt rødt fluorescerende farvestof i en scanner til fluorescens. Tage flere billeder af mikroarrays ved forskellige scanningsparametre, generelt ved at sænke laseren gain værdi.
BEMÆRK: Undgå mættede pletter (> 65.000 fluorescens tæller) -de er ude af skala og kan indføre kvantificering fejl.
9. Billedbehandling og dataanalyse
- Brug en kommerciel software til billedanalyse og kvantificering; softwaren giver målinger af fluorescensintensiteten (FI; median eller gennemsnit af alle pixel fra en enkelt plet) til ever stedet af hele microarray. Træk den lokale baggrund omkring pletterne: FI = FI spot - FI lokal baggrund.
- Gem FI data og åbne dem ved hjælp af et regnearksprogram.
- Brug værdierne opnået for de blanke arrays som den negative kontrol til at identificere og kassere de falske positiver. Påfør følgende ligning til at beregne FI for hvert antistof stedet: FI = (FI prøve - FI blank), hvor FI prøve = FI spot - FI lokal baggrund i mikroarrays køre med prøveekstrakter og FI blank = FI spot - FI lokal baggrund de tomme mikroarrays.
- Anvende en yderligere afskæring tærskel på 2- til 3-fold gennemsnittet af FI af hele mikroarray at minimere sandsynligheden for falske positiver; dette er især relevant for dårlig kvalitet microarray billeder og lave signal-til-støj-forhold.
- Opret plots og / eller udføre yderligere analyse efter behov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dette arbejde beskriver en multiplex immunoassay test til samtidig identifikation af de mest relevante ferskvands cyanobakterielle arter (tabel 1) ved hjælp af CYANOCHIP antistof microarray. Mikroarrayet kan være en 3 x 8 mikroarrayformat trykt på mikroskopobjektglas. Hvert mikroarray består af et sæt af 17 antistoffer trykt i tredobbelt prikmønster, deres tilsvarende præimmune antistoffer og BSA som negative kontroller. Mikroarrayene omfatter også en fluorescerende ramme, ved hjælp af en fluorescens-mærket præimmune antistof til let lokalisere microarray mønster 22 (figur 1).
Den microarray blev testet i marken for in situ analyse af vandprøver indsamlet på kysten af ferskvand Lozoya Reservoir, der forsyner byen Madrid. Prøver blev behandlet som beskrevet ovenfor, ogvigtigste positive immunreaktioner svarede til antistoffer mod planktoniske cyanobakterier, såsom Microcystis spp. (K4 og K5), og at Benthic Oscillatoriales, såsom Leptolyngbya spp. (K10 og K15). Lavere fluorescenssignaler opnåedes fra Nostocales (K6 og K12, to planktoniske Aphanizomenon spp.), Bentiske Rivularia sp. (K8), Anabaena sp. (K1), og planktoniske Microcystis flos-aquae sp. (K3). Optisk mikroskop observationer (ikke vist) viste et mangfoldigt cyanobakteriel samfund inden rigelige terrigenous vragrester fra kysten. Flere arter af Anabaena domineret samfundet, men Microcystis spp. og Pseudanabaena spp. var også til stede.
Derudover blev microarray også valideres ved at analysere en tør, næsten 1000-årige mikrobiel måtte opsamles i McMurdo Ice Shelf i Antarktis for at teste for tilstedeværelsen af cyanobakteriel markers. Figur 1 viser meget fluorescerende, positive reaktioner i antistoffer produceret til bundlevende cyanobakterier isoleret fra andre Antarktis måtter, herunder Anabaena sp. og Leptolyngbya spp. (K14 og K15, henholdsvis). Yderligere positive immunreaktioner blev påvist med antistoffer mod planktoniske cyanobakterier, såsom Microcystis spp. (K4 og K5), Aphanizomenon spp. (K6 og K12), og Planktothrix rubescens sp. (K17). Lave signaler blev opnået fra antistoffer mod andre bentiske arter isoleret i en Antarktis mat, herunder Tolypothrix sp. (K16) og Anabaena sp. (K1). Fluorescerende optisk mikroskopi afslørede tilstedeværelsen af celler strukturelt ligner cyanobakterier og grønalger (ikke vist). Ingen trådformede cyanobakterier blev identificeret. Alligevel blev påvist multiple amorfe fluorescerende strukturer på ca. 1 um i størrelse og rigelige diffus fluorescens, which kunne tilskrives tilstedeværelsen af celle- rester (brudt og døde celler) og ekstracellulære polymere stoffer (EPS), hhv. Derfor viste biokemiske analyser, at måtten bestod af rigelig mængder af biopolymerer og celle rester (kompleks biologisk stof), der kunne være mål for antistofferne i microarray.
Figur 1: Hurtig og pålidelig Multiplex Microarray Immunoassay til påvisning Cyanobakterier. A) Scheme viser de vigtigste trin i FSMI til analyse af multi-target prøver med en CYANOCHIP. B) Skematisk af et trykkeri mønster layout (ved tre eksemplarer) af det anti-cyanobakterier antistof samling: (0) BSA, bovint serumalbumin; (X) kun udskrivning buffer; (1-17) hver af antistoffer som i tabel 1 i BLanco et al. 2015 (K1 til K17). Fra P1 til P17, de tilsvarende præimmune antistoffer virker som kontroller. De gule rektangler svarer til en fluorescerende plet gradient som ramme reference. C og D) Billede, der viser den øverste del af en 1000 år gammel tør mikrobiel måtte fra McMurdo Ice Shelf (Antarktis) og CYANOCHIP billedet detektering cyanobakterier i denne måtten hhv. E) Panoramaudsigt over Lozoya Reservoir viser gennemsigtig vand uden synlige grønne partikler på tidspunktet for prøveudtagningen. F) microarray billede efter in situ analyse af vandprøven (modificeret fra henvisning 22).
| ab kode | Immunogen (stamme) | Bestille | Habitat | | dyrkningsbetingelser | |
| K1 | Anabaena sp. | Nostocales | ukendt | BG11 og nitrat | 30 ºC, konstant lys |
| K2 | Anabaena sp. | Nostocales | ukendt | BG11o | 30 ºC, konstant lys |
| K3 | Microcystis flos-aquae | Chroococcales | planktoniske | BG11 | 28 ºC, konstant lys |
| K4 | Microcystis novacekii | Chroococcales | planktoniske | BG11 | 28 ºC, konstant lys |
| K5 | Microcystis aeruginosa | Chroococcales | planktoniske | BG11 | 28 ºC, konstant lys |
| K6 | Aphanizomenon ovalisporum | Nostocales | planktoniske | BG11o | 28 ºC, konstant lys |
| K7 | Phormidium sp. | Oscillatoriales | bentiske | BG11 | 18 ºC, 16-8 lysperiode |
| K8 | Rivularia sp. | Nostocales | bentiske | CHU-D | 18 ºC, 16-8 lysperiode |
| K9 | Chamaesiphon sp. | Chroococcales | bentiske | BG11 | 18 ºC, 16-8 lysperiode |
| K10 | Leptolyngbya Boryana | Oscillatoriales | bentiske | BG11 | 18 ºC, 16-8 lysperiode |
| K11 | Tolypothrix distorta | Nostocales | bentiske | BG11o | 18 ºC, 16-8 lysperiode |
| K12 | Aphanizomenon aphanizomenoides | Nostocales | planktoniske | BG11o | 28 ºC, konstant lys |
| K13 | Nostoc sp. (Antarktis) | Nostocales | bentiske | BG11o | 13 ºC, 16-8 lysperiode |
| K14 | Anabaena sp. | Nostocales | bentiske | BG11o | 13 ºC, 16-8 lysperiode |
| K15 | Leptolyngbya sp. | Oscillatoriales | bentiske | BG11 | 13 ºC, 16-8 lysperiode |
| K16 | Tolypothrix sp. | Nostocales | bentiske | BG11 | 13 ºC, 16-8 lysperiode |
| K17 | Planktothrix rubescens | Oscillatoriales | planktonic | ingen | ingen |
Tabel 1. Liste af antistofferne (ABS) og cyanobakteriel stammer anvendt til at producere de CYANOCHIP 22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her er en multiplex fluorescerende sandwich immunassay med anvendelse af CYANOCHIP, en 17-antistof microarray til påvisning og identifikation af en bred vifte af cyanobakteriel slægter, beskrevet 22. Disse cyanobakterier udgør den hyppigste bentiske og planktoniske slægter i ferskvandsområder, nogle af dem er toksin producenter. For nylig er det fluorescerende sandwich-immunassay-format blevet anvendt til at identificere mikroorganismer og / eller bioanalytes i miljømæssige anvendelser 26, 27, 28. Protokollen er primært baseret på to trin: (i) immobilisering eller indfange antistoffer til specifikt at binde analytter fra en testprøve og (ii) påvisning analyt-antistof par ved hjælp af fluorescens-mærkede antistoffer (tracer eller detektor antistoffer). Fordi sandwich-assay kræver mindst to tilgængelige antistof-bindingssteder (epitoper) i analyt forreaktionen kan finde sted, ethvert positivt fluorescerende signal indikerer tilstedeværelsen af relativt store og komplekse oligo- eller multimere analytter, der er identisk eller meget lig dem, der anvendes til at producere registreringsmidlet antistoffer.
Selvom denne metode kræver små mængder og grundlæggende prøveforberedelse, uden behov for særlig ekspertise eller viden, kan flere ulemper ødelægge analysen. Lave fluorescerende signaler eller en fuldstændig mangel deraf kan skyldes dårlig antistof oprensning eller dårlig mærkningseffekt. Til isolering af kanin-IgG, protein A er det bedste valg, fordi det specifikt binder med høj effektivitet til Fc-regionen af immunglobuliner. Som nævnt i afsnit 4, skal fluorescerende antistoffer med en mærkning på mellem 3-7 mol af farvestof per mol antistof anvendes. Endvidere kan en mangel på fluorescerende pletter forklares med koncentrationen af analytter liggende under detektionsgrænserne. I dette tilfælde kan prøven være koncentrated før inkubering med mikroarrayet, eller større mængder kan anvendes til en ny ekstraktion. Høje fluorescerende baggrunde er resultatet af ineffektive chip blokering og / eller vasketrin og ekstrakter fra prøver, der består af mineraler og komplekse organiske stof, der klæber på chippen. Når der anvendes komplekse prøver som analytter, er det ønskeligt at forøge salt og / eller detergentkoncentrationen at favorisere den specifikke interaktion mellem analyt-antistof par.
I de senere år har antistof microarray teknologi blevet udviklet til miljømæssige anvendelser. Ikke desto mindre, er brugen af denne teknik indebærer nogle begrænsninger. Polyklonale antistoffer er hurtigere og billigere at fremstille og, endnu vigtigere, mulighed for at binde ethvert mål epitop i et komplekst miljø prøve teoretisk højere end med monoklonale antistoffer. Den omstændighed, at de kan genkende forskellige epitoper øger antallet af krydsreaktioner i MFSI. For at opnå høj specificitet, kan anvendes metoder at udrede disse krydsreaktivitet begivenheder fra de sande sammenhørende antigen-antistof-reaktioner ved anvendelse af dekonvolvering metoder 26, 27, for eksempel, er meget ønskeligt. Grundlæggende er mikroarrayet betragtes som en kvalitativ biosensor for den multiple påvisning og klassificering af cyanobakterier. I denne forbindelse er det vigtigt at bestemme detektionsgrænsen for hvert antistof en efter en til at bruge deres optimale arbejdsforhold koncentrationer i assayet. Selv om denne microarray, sammen med FSMI, er ikke tænkt som en kvantitativ metode, biosensoren indebærer høj følsomhed, fordi den nedre detektionsgrænse fleste af antistofferne indeholdt i CYANOCHIP 22 er fra 10 2 til 10 3 celler / ml.
Trods disse begrænsninger, denne metode har flere fordele i forhold til andre teknikker, der anvendes i miljømæssigt mVERVÅGNING. Antistof-biosensorer tillader muligheden for at anerkende forskellige molekyler samtidigt i en enkelt analyse, muligheden for at detektere lav koncentration af analytter, og muligheden for at producere antistoffer imod næsten ethvert stof. Endvidere kan microarray opnå op til 24 analyser i en enkelt assay, med detektionsgrænser fra 10 2 celler / ml. I sammenligning med andre metoder, kan antistoffer detektere levende eller døde celler, ekstracellulært materiale og cellerester. Selv om det tager mindst 4 timer at fuldføre hele assayet, er det hurtigere end andre analytiske metoder, der anvendes til overvågning af miljøet. Den CYANOCHIP var oprindeligt tænkt til identifikation af cyanobakterielle stammer. Denne biosensor er ikke formelt beregnet til dette formål, så det kan identificere potentielle toksin producenter og kunne forbedres i fremtiden ved at tilføje antistoffer mod en bred vifte af nye stammer. Biokemiske assays, såsom ELISA, PPIA, og neurokemisketests i mus, er muligt at identificere ALGEGIFT, men de er begrænset til nogle få kendte toksiner og kan give falske positiver. Desuden ved hjælp af CYANOCHIP ikke kræver særlig uddannelse, mens optisk mikroskopi og mus bioassays kræver uddannet personale eller arbejdskrævende arbejde med levende dyr, og de giver ikke oplysninger om, hvilken type toksiner til stede i en prøve. ALGEGIFT kan også identificeres og kvantificeres ved andre analytiske fremgangsmåder, såsom HPLC, GC-MS, eller MALDI-TOF. I disse metoder, skal prøven renses, og manglen på referencestandarder begrænser identifikation af ALGEGIFT. Desuden analysemetoder kræver dyrt udstyr og forsyninger og specialiseret uddannelse. Molekylære metoder er baseret på DNA-ekstraktion fra prøverne, mens FSMI kun kræver en miljømæssig ekstrakt fremstillet i et par meget enkle trin, uden cyanobakterier rensning.
Den høje ydeevne CYANOCHIP forin situ detektion af cyanobakterier i ferskvand reservoirer gør det til et nyt værktøj til tidlig varsling af vand administratorer. Desuden mikroarrayet er også interessant for området astrobiologi, især for at lede efter mikrobielle markører som tegn på liv. Studiet af extremofiler kan hjælpe os med at forstå oprindelsen af liv på Jorden, og hvordan livet kunne overleve i de ekstreme miljøer til stede i vores solsystem og videre. Som flere miljøer på Jorden er meget lig steder på andre planeter, såsom Mars, kan det være muligt at finde rester af fotosyntetiske prokaryoter som beviser på uddøde liv. Den microarray var i stand til at identificere cyanobakterielle markører fra levende eller ikke levende celler; fra befolkningen stadig og / eller ekstracellulært materiale i gamle mikrobielle måtter (figur 1); og fra vand, jord og sten indsamlet i ekstreme miljøer, såsom Antarktis, Atacama, Andes søer, det højarktiske, ellerRio Tinto område i Spanien (ikke vist). I betragtning af at cyanobakterier er ur mikroorganismer på Jorden, er der grund til at tro, at de engang kunne have levet på andre planeter.
Afslutningsvis, at CYANOCHIP-FSMI kan identificere in situ cyanobakterielle markører og kan endda knytte dem til forskellige phylotypes eller grupper, og at microarray dækker en bred vifte af levesteder, herunder plankton, bundfauna og endoliths, viser, at dette teknik kunne et værktøj til miljøovervågning. Fremtidige forbedringer af microarray kunne være at øge antallet af antistoffer til nye stammer, således at relevante fylogenetiske grupper stadig verserende er inkluderet. Derudover kan chippen implementeres med antistoffer mod specifikke cyanobakterielle forbindelser, såsom toksiner eller cyanophicin polymer. Dette er især relevant for overvågningen ferskvand reservoirer, rør og installationer i menneskelige anlæg. Den aktuelle MICRoarray og fremtidige versioner vil være meget nyttigt med hensyn til astrobiologi, enten til påvisning liv eller til overvågning af menneskelige rum faciliteter (f.eks overvågning vandreservoirer eller livsbevarende systemer). Faktisk vi rutinemæssigt bruge microarray i feltkampagner til ekstreme miljøer som en metode til påvisning af liv "on-site" forbliver. Den microarray er en del af den såkaldte Life Detector Chip (LDChip), en microarray med mere end 300 antistoffer på søgeordet for livet i planeternes udforskning missioner 29, 30. Den microarray alene eller som en del af LDChip vil blive gennemført i de tegn på liv Detector (SOLID) instrument 29 for at validere SOLID-LDChip koncept for planetarisk efterforskning i flere feltkampagner til terrestriske analoger. Den microarray vil give nyttige oplysninger ved at identificere cyanobakterier og / eller deres toksiner. Ved at bestemme stammerne, vil det give oplysninger om miljøer og levesteder, som de har udviklet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Antonio Quesada fra Universidad Autónoma de Madrid for at give cyanobakterielle stammer. Dette arbejde blev finansieret af Subdirección General de Proyectos de Investigación for det spanske Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO), giver ingen. AYA2011-24803 og ESP2014-58494-R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 mm pore diameter filters | Millipore | GSWP04700 | For preparation of immunogens |
| Eppendorf 5424R microcentrifuge | Fisher Scientific | For preparation of immunogens | |
| Phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 (10x) | Thermo Fisher Scientific | 70011036 | 50 mM potassium phosphate, 150 mM NaCl, pH 7.4 |
| Ultrasonic processor UP50H | Hielscher | For preparation of immunogens | |
| Complete Freund's adjuvant | Sigma-Aldrich | F5881 | Immunopotentiator |
| Incomplete Freud's adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | For boost injections |
| Protein A antibody purification kit | Sigma-Aldrich | PURE1A | For isolation of IgG |
| Centrifugal filter devices MWCO<100 kDa | Millipore | UFC510096-96K | For isolation of IgG |
| Dialysis tubings, benzoylated | Sigma-Aldrich | D7884-10FT | For isolation of IgG |
| Illustra Microspin G-50 columns | GE-HealthCare | GE27-5330-02 | For isolation of IgG |
| Bradford reagent | Sigma-Aldrich | B6916-500 mL | To quantify the antibody concentration |
| MicroBCA protein assay kit | Thermo Scientific | 23235 | To quantify the antibody concentration |
| Protein arraying buffer 2x | Whatman (Sigma Aldrich) | S00537 | Printing buffer; 30 - 40% glycerol in 1x PBS with 0.01% Tween 20 |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | Non-ionic detergent |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | Control for printing; blocking reagent |
| 384-wells microplate | Genetix | X6004 | For antibody printing |
| Robot arrayer for multiple slides | MicroGrid II TAS arrayer from Digilab | For antibody printing | |
| Epoxy substrate glass slides | Arrayit corporation | VEPO25C | Solid support for antibody printing |
| Alexa Fluor-647 Succinimidyl-ester | Molecular probes | A20006 | Fluorochrome |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | Fluorochrome dissolvent |
| Heidolph Titramax vibrating platform shaker | Fisher Scientific | For antibody labeling | |
| Illustra Microspin G-50 columns | Healthcare | 27-5330-01 | For purification of labeled antibodies |
| Safe seal brown 0.5 mL tubes | Sarstedt | 72,704,001 | For labeled antibodies storage |
| Nanodrop 1000 spectrophotometer | Thermo Scientific | To quantify antibody concentration and labeling efficiency | |
| 3 µm pore size polycarbonate 47 mm diameter filter | Millipore | TMTP04700 | To concentrate cells |
| 1 M Trizma hydrochloride solution pH 8 | Sigma-Aldrich | T3038 | For TBSTRR preparation; to block slides |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | For TBSTRR preparation |
| 20 µm nylon filters | Millipore | NY2004700 | For environmental extract preparation |
| 10 - 12 mm filter holders | Millipore | SX0001300 | For environmental extract preparation |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | For environmental extract storage |
| 1 M Trizma hydrochloride solution pH 9 | Sigma-Aldrich | T2819 | To block slides |
| Heidolph Duomax 1030 rocking platform shaker | VWR | To block slides; for incubation processes | |
| VWR Galaxy miniarray microcentrifuge | VWR | C1403-VWR | To dry slides |
| Multi-Well microarray hybridization cassette | Arrayit corporation | AHC1X24 | Cassette for 24 assays per slide |
| GenePix 4100A microarray scanner | Molecular Devices | Scanner for fluorescence | |
| GenePix Pro Software | Molecular Devices | Software for image analysis and quantification |
References
- Simis, S. G. H., Peters, S. W. M., Gons, H. J. Remote sensing of the cyanobacterial pigment phycocianin in turbid inland water. Limnol. Oceanogr. 50 (1), 237-245 (2005).
- Zamyadi, A., McQuaid, N., Prevost, M., Dorner, S. Monitoring of potentially toxic cyanobacteria using an online multi-probe in drinking water sources. J. Environ. Monit. 14, 579-588 (2012).
- Msagati, T. A. M., Siame, B. A., Shushu, D. D. Evaluation of methods for the isolation, detection and quantification of cyanobacterial hepatotoxins. Aquat. Toxicol. 78 (4), 382-397 (2006).
- Weller, M. G. Immunoassays and biosensors for the detection of cyanobacterial toxins in water. Sensors. 13 (11), 15085-15112 (2013).
- Baker, J. A., Neilan, B. A., Entsch, B., McKay, D. B. Identification of cyanobacteria and their toxigenicity in environmental samples by rapid molecular analysis. Environ. Toxicol. 16 (6), 472-482 (2001).
- Li, H., Singh, A. K., McIntyre, L. M., Sherman, L. A. Differential gene expression in response to hydrogen peroxide and the putative PerR regulon of Synechocystis sp. Strain PCC 6803. J. Bacteriol. 186 (11), 3331-3345 (2004).
- Anderson, D. M., Cembella, A. D., Hallegraeff, G. M. Progress in understanding harmful algal blooms: paradigm shifts and new technologies for research, monitoring, and management. Ann. Rev. Mar. Sci. 4, 143-176 (2012).
- Dittami, S. M., Pazos, Y., Laspra, M., Medlin, L. K. Microarray testing for the presence of toxic algae monitoring programme in Galicia (NW Spain). Environ. Sci. Pollut. Res. Int. 20, 6778-6793 (2013).
- Kegel, J. U., Del Amo,, Medlin, Y., K, L. Introduction to Project MIDTAL: its methods and samples from Arcachon Bay, France. Environ. Sci. Pollut. Res. Int. 20 (10), 6690-6704 (2013).
- Marcheggiani, S., et al. Detection of emerging and re-emerging pathogens in surface waters close to an urban area. Int. J. Environ. Res. Public Health. 12 (5), 5505-5527 (2015).
- Fernández-Calvo, P., Näke, C., Rivas, L. A., García-Villadangos, M., Gómez-Elvira, J., Parro, V. A multi-array competitive immunoassay for the detection of broad-range molecular size organic compounds relevant for astrobiology. Planet. Space Sci. 54 (815), 1612-1621 (2006).
- Parro, V. Antibody microarrays for environmental monitoring. Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg, Germany. 2699-2710 (2010).
- Fan, Z., Keum, Y. S., Li, Q. X., Shelver, W. L., Guo, L. H. Sensitive immunoassay detection of multiple environmental chemicals on protein microarrays using DNA/dye conjugate as a fluorescent label. J. Environ. Monit. 14 (5), 1345-1352 (2012).
- Rivas, L. A., García-Villadangos, M., Moreno-Paz, M., Patricia Cruz-Gil, P., Gómez-Elvira, J., Parro, V. A 200-Antibody microarray biochip for environmental monitoring: Searching for universal microbial biomarkers through immunoprofiling. Anal. Chem. 80 (21), 7970-7979 (2008).
- Delehanty, J. B., Ligler, F. S. A microarray immunoassay for simultaneous detection of proteins and bacteria. Anal. Chem. 74 (21), 5681-5687 (2002).
- Ligler, F. S., Taitt, C. R., Shriver-Lake, L. C., Sapsford, K. E., Shubin, Y., Golden, J. P. Array biosensor for detection of toxins. Anal. Bioanal. Chem. 377 (3), 469-477 (2003).
- Rucker, V. C., Havenstrite, K. L., Herr, A. E. Antibody microarrays for native toxin detection. Anal. Biochem. 339 (2), 262-270 (2005).
- Kang, J., Kim, S., Kwon, Y. Antibody-based biosensors for environmental monitoring. Toxicol. Environ. Health. Sci. 1 (3), 145-150 (2009).
- Herranz, S., Marazuela, M. D., Moreno-Bondi, M. C. Automated portable array biosensor for multisample microcystin analysis in freshwater samples. Biosens. Bioelectron. 33 (1), 50-55 (2012).
- Shlyapnikov, Y., et al. Rapid simultaneous ultrasensitive immunodetection of five bacterial toxins. Anal. Chem. 84 (13), 5596-5603 (2012).
- Szkola, A., et al. Rapid and simultaneous detection of ricin, staphylococcal enterotoxin B and saxitoxin by chemiluminescence-based microarray immunoassay. Analyst. 139, 5885-5892 (2014).
- Blanco, Y., Quesada, A., Gallardo-Carreño, I., Jacobo Aguirre,, Parro, J., V, CYANOCHIP: An antibody microarray for high-taxonomical-resolution cyanobacterial monitoring. Environ. Sci. Technol. 49 (3), 1611-1620 (2015).
- Bradford, M. M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Anal. Chem. 72, 248-254 (1976).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J.
- Smith, P. K., et al.
- Rivas, L. A., Aguirre, J., Blanco, Y., González-Toril, E., Parro, V. Graph-based deconvolution analysis of multiplex sandwich microarray immunoassays: applications for environmental monitoring. Environ. Microbiol. 13 (6), 1421-1432 (2011).
- Blanco, Y., et al. Deciphering the prokaryotic community and metabolisms in south african deep-mine biofilms through antibody microarrays and graph theory. PloS One. 9 (2), e114180 (2014).
- Gas, F., Baus, B., Queré, J., Chapelle, A., Dreanno, C. Rapid detection and quantification of the marine toxic algae, Alexandrium minutum, using a super-paramagnetic immunochromatographic strip test. Talanta. 147, 581-589 (2016).
- Parro, V., et al. SOLID3: a multiplex antibody microarray-based optical sensor instrument for in situ life detection in planetary exploration. Astrobiology. 11, 15-28 (2011).
- McKay, C. P., et al. The Icebreaker Life Mission to Mars: a search for biomolecular evidence for life. Astrobiology. 13, 334-353 (2013).
