Abstract
Opwarming van de aarde en eutrofiëring maak wat aquatische ecosystemen gedragen als echte bioreactoren die een snelle en massale cyanobacteriën groei leiden; Dit heeft relevante gezondheids- en economische gevolgen. Veel stammen zijn cyanobacterial toxine producenten en slechts weinig cellen nodig om onherstelbare schade aan het milieu veroorzaken. Daarom, water-body overheden en administraties vereisen snelle en efficiënte systemen voor vroegtijdige waarschuwing verstrekken van betrouwbare gegevens om hun preventieve of curatieve beslissingen te ondersteunen. Dit manuscript meldt een experimenteel protocol voor de in het veld detectie van toxine-producerende cyanobacteriën stammen met behulp van een antilichaam microarray chip met 17 antilichamen (ABS) met taxonomische resolutie (CYANOCHIP). Hier, een multiplex fluorescerende sandwich microarray immunoassay (FSMI) voor de gelijktijdige bewaking van 17 cyanobacteriën stammen vaak gevonden bloeien in zoetwater ecosystemen, sommigen van hen toxine producenten, beschreven. Een microarray met multiple identieke herhalingen (maximaal 24) van de CYANOCHIP werd op een objectglaasje gedrukt gelijktijdig eenzelfde aantal monsters getest. Vloeibare monsters kunnen worden getest, hetzij door directe incubatie met de antilichamen (Abs) of na celconcentratie door filtratie door een 1- tot 3-um filter. Vaste monsters, zoals sedimenten en gemalen rotsen, eerst gehomogeniseerd en gedispergeerd met een handbediende ultrasonicator per incubatiebuffer. Zij worden dan gefilterd (5-20 pm) waardoor het ruwe materiaal te verwijderen en het filtraat wordt geïncubeerd met Abs. Immuunreacties worden onthuld door een uiteindelijke incubatie met een mengsel van de 17 fluorescentie gelabelde Abs en worden gelezen door een draagbare fluorescentiedetector. Het hele proces duurt ongeveer 3 uur, het meeste overeenkomt met twee 1-uur incubatie perioden. De uitvoer is een beeld, waarbij heldere vlekken corresponderen met de positieve detectie van cyanobacteriën markers.
Introduction
De detectie en monitoring van micro-organismen in complexe natuurlijke microbiële gemeenschappen zijn van cruciaal belang op vele gebieden, met inbegrip van medische biologie, ecologie van het milieu, en astrobiology. Cyanobacteriën zijn prokaryotische micro- organismen bekend om hun vermogen om bloemen (excessieve proliferatie) van cellen vormen in zoet water. Ze zijn alomtegenwoordig en vele soorten kunnen toxinen produceren, wat niet alleen een risico betekent voor de gezondheid, maar ook een ecologische impact. In dit verband is het essentieel om snelle en gevoelige methode voor de vroege detectie van cyanobacteriën en / of toxinen in grond en water te ontwikkelen. Voor dit doel is een multiplex fluorescerende sandwich microarray immunoassay (FSMI) is ontwikkeld als instrument voor waterbeheerders om hen te helpen bij het maken van beslissingen en, bijgevolg, bij de uitvoering van de juiste water management programma's.
Een breed scala aan methoden ontwikkeld voor het opsporen en identificeren van cyaanobacterial cellen en cyanotoxines in grond en water, zoals optische microscopie, moleculaire biologie, en immunologische technieken. Deze methoden kunnen sterk variëren in de informatie die zij verstrekken. Microscopische technieken zijn gebaseerd op celmorfologie en de detectie van in vivo fluorescentie van cyanobacteriën pigmenten, zoals phycocyanin of chlorofyl a 1. Hoewel ze zijn snelle en goedkope methoden voor real-time en frequente controle die informeren over de aard en het aantal cyanobacteriën aanwezig is in een monster, hebben ze geen informatie over de mogelijke toxiciteit geven. Bovendien vereisen zij een bepaald niveau van deskundigheid, aangezien het vaak moeilijk om onderscheid te maken tussen nauw verwante soorten 2. Om deze beperkingen te overwinnen, moet lichtmicroscopie worden begeleid door zowel biologische en biochemische screeningstesten en fysisch-chemische methoden voor de identificatie en kwantificatie van cyanotoxines.
Moleculair gebaseerde methoden zijn toegepast voor de komende decennia op te sporen, te identificeren en te kwantificeren cyanobacteriën en de bijbehorende cyanotoxines dankzij de sequentie-informatie gepubliceerd in het genoom databases (bv, National Center for Biotechnology Information, NCBI). Onder deze werkwijzen zijn op basis van de polymerasekettingreactie (PCR), waarbij het ontwerp van primersets voor DNA amplificatie vereist en afhankelijk voorkennis van DNA-sequenties van verschillende soorten cyanobacteriën. Terwijl gen detectie, zoals de phycocyanin operon, leidt tot een nauwkeurige identificatie op genus niveau, sommige soorten of stammen zijn onopgemerkt metdeze methode. Echter, toxine-coderende genen, bijvoorbeeld die welke behoren tot de microcystine operon, vergemakkelijken de identificatie van toxines in monsters waar de producenten schaars 5. Niettemin heeft de detectie van toxine markers door PCR niet noodzakelijkerwijs toxiciteit in het milieu. Bovendien is de set van primers ontwikkeld om het hele scala van soorten cyanobacteriën en toxine producenten aanwezig zijn in een monster te analyseren is nog onvolledig, en verder onderzoek moet worden gedaan om onbekende soorten te identificeren. Andere moleculaire technieken niet PCR-gebaseerde, zoals fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) en DNA microarrays.
In de laatste twee decennia heeft microarray technologie aan belang gewonnen op vele toepassingsgebieden, met name in het milieu monitoring. DNA microarrays mogelijk maken onderscheid tussen soorten en analyten 4, 6, 7 sup>, 8, 9, 10, maar ze worden beschouwd als zeer omslachtig en tijdrovend taken die meerdere stappen (bijvoorbeeld microarray prestaties, DNA extractie, PCR amplificatie en hybridisatie) omvatten. Daarom minder tijdrovend assays op basis van antilichamen, zoals sandwich en competitieve immunologische microarrays, een essentieel en betrouwbare high-throughput werkwijze voor de detectie van meerdere analyten milieu 11, 12, 13 worden. Het vermogen van antilichamen om specifiek herkennen de doelverbindingen en kleine hoeveelheden analyten en eiwitten te detecteren, samen met de mogelijkheid van het produceren van antilichamen tegen vrijwel alle stoffen, maak antilichaam microarrays een techniek om milieuredenen. Bovendien is de mogelijkheid van het bereiken meerdere analyses alsingle assay, met detectiegrenzen variërend van ppb tot ppm, is een van de belangrijkste voordelen van deze methode 14.
Antilichamen gebaseerde biosensoren bleken gevoelige en snelle instrumenten voor de detectie van een breed scala van pathogenen en toxinen in milieucontrole 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 zijn. Terwijl DNA werkwijzen omvatten verschillende stappen, het op antilichaam gebaseerde microarrays vereisen slechts een kleine steekproef preparaat dat hoofdzakelijk gebaseerd is op een korte lysisstap in een geschikte buffer oplossing. Delehanty en 15 League Meeste meldde de gelijktijdige detectie van eiwitten en bacteriële analyten in complexe mengsels van een antilichaam sandwich immunoassay voor het opsporen van een eiwitconcentratie van een 4 ppbd 10 4 cfu / ml cellen. Szkola et al. 21 is een voordelige en betrouwbare multiplex microarray voor de simultane detectie van proteotoxins en kleine toxines verbindingen die kunnen worden gebruikt als biologisch wapen ontwikkeld. Het gedetecteerde concentraties ricine toxine, met een detectiegrens van 3 ppb, in minder dan 20 minuten. Onlangs heeft de CYANOCHIP een antilichaam microarray-gebaseerde biosensor voor de in situ detectie van toxische en toxische cyanobacteriën beschreven 22. Dit microarray maakt de identificatie van potentiële cyanobacteriënbloeien, meestal in waterige omgevingen die moeilijk microscopisch identificeren. De detectiegrens van de microarray is 10 februari - 10 maart cellen voor de meeste soorten, het draaien van deze biosensor in een kosteneffectief instrument voor de multiplex detectie en identificatie van cyanobacteriën, zelfs op het niveau van soorten. Al deze eigenschappen maken de AntiboDY microarray techniek, met name de methode die in dit werk, sneller en eenvoudiger methode dan de bovengenoemde technieken.
Dit werk toont twee voorbeelden van experimenten die een antilichaam microarray gebaseerde biosensor om de aanwezigheid van cyanobacteriën in bodem- en watermonsters te detecteren. Het is een eenvoudige en betrouwbare methode gebaseerd op een immunoassay format dat zeer kleine monsterhoeveelheden en zeer eenvoudige monstervoorbereiding vereist. De werkwijze vereist een korte tijd en kan gemakkelijk worden uitgevoerd in het veld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van immunogenen
- Cyanobacterial groeien elke stam in het overeenkomstige kweekmedium onder in Tabel 1 beschreven omstandigheden.
OPMERKING: groeimedium en kweekomstandigheden voor elke cyanobacteriën stam zijn weergegeven in tabel 1. Alle cyanobacteriële stammen, met uitzondering van K17, behoren tot de groep Antonio Quesada uit Autonoma University (Madrid, Spanje). Het antilichaam tegen Planktothrix rubescens werd gegenereerd uit een natuurlijke steekproef van de monospecifieke bloei van deze cyanobacterie van Vilasouto reservoir (Noord-Spanje). - Kwantificeren van het aantal cellen met een cel telkamer door optische microscopie ongeveer 10 8 cellen / ml van een late exponentiële of stationaire groeifase verkrijgen.
- Oogst cellen van 5 ml kweek door centrifugatie bij 2000 xg gedurende 5 minuten.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in een 10-mL tube met 5 ml 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (1x PBS) tot ongeveer 10 8 cellen te verkrijgen / ml.
- Meng en lyseren de cellen van de suspensie door sonicatie gedurende 5 cycli, 30 s elk, met 30 tot 60-s pauze op ijs, een draagbare, handbediende ultrasone processor of door dompelen van de buis in het waterbad van cel disruptor op maximale amplitude (30 kHz).
- Herhaal stap 1,3-1,5 voor elke stam van de cyanobacterie.
LET OP: Sonicatie produceert cel verstoring en cellulaire inhoud release. Terwijl proteïnen en polysacchariden goede immunogenen specifieke moleculen, zoals lipiden en nucleïnezuren, kan een humorale immunogene respons zelf opwekken. Daarom moeten ze binden aan dragers, zoals polysacchariden of eiwitten, de moleculaire complexiteit verhogen. Bovendien, sonicatie brengt intracellulaire materiaal antilichaamproductie kan leiden.
2. Productie van polyklonale antilichamen
- Bereid de eerste immunogen dosis door het mengen van 0,5 ml van het ultrasoon cellysaat verkregen in stap 1,5 met 0,5 ml compleet Freund's adjuvans. Leveren aan de exploitant van een dier faciliteit voor het polyklonale konijn antilichaam productie.
- Bereid drie doses zoals eerder voor verder gebruik als geheugen verhoogt de antilichaamproductie proces mengen 0,5 ml van dezelfde homogenaat / lysaat verkregen in stap 1,5 met 0,5 ml onvolledig Freund's adjuvans. Geef ze aan het dier mogelijk om de antilichaamproductie kunnen voldoen.
- Herhaal de stappen 2,1 en 2,2 voor elke nieuwe antilichamen productieproces.
LET OP: Normaal gesproken, de productie van antilichamen wordt toevertrouwd aan gespecialiseerde dier faciliteiten of bedrijven, omdat de juiste licenties en opleiding nodig zijn om te werken met dieren. Het bedrijf levert een relatieve enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) meting van de hoeveelheid antigeen-specifieke antilichamen aanwezig in het serummonster.
3. Antibody Purificatie
- Zuiver het immunoglobuline G (IgG) fractie uit zowel de immuun- en pre-immuunserum in stap 2 verzameld door proteïne-A affiniteitschromatografie. Sommige commerciële zuivering kits, gebaseerd op de cartridge systemen goed werken; volg de instructies provider.
- Wanneer de zuivering kit biedt geen ontzouting systeem wijzigt de buffer na de elutie van de gezuiverde antilichamen tegen PBS 0,1x, hetzij door dialyse of door centrifugale filterinrichtingen met een 100-kDa (of lager) membraan poriegrootte.
- Bepaal de antilichaamconcentratie door meting van de absorptie bij 280 nm of met colorimetrische werkwijzen, zoals 23 Bradford, Lowry 24 of bicinchoninezuur (BCA) 25.
Opmerking: Het is belangrijk om te voorkomen waaronder aminegroepen in de elutiebuffer (bijvoorbeeld Tris buffers) omdat ze concurreren met het antilichaam voor binding aan vaste oppervlakken geactiveerd met epoxygroepen. na purification, is het belangrijk om de antilichaam activiteit met ELISA testen.
4. Fluorescentie antilichaam Labeling
- Label de gezuiverde antilichamen verkregen gedeelte 3 met een fluorochroom (bijvoorbeeld een ver-rode fluorescerende kleurstof) door het oplossen van een commerciële flesje met kleurstof etikettering 1 mg eiwit in 100 gl dimethylsulfoxide (DMSO). Voeg 2 pi van de opgeloste kleurstof elk antilichaam preparaat bij een concentratie van 2 mg / ml in een uiteindelijk volume van 50 ul in 50 mM fosfaatgebufferde zoutoplossing (pH 8,5).
- Handhaaf de labelingsreacties onder voortdurend roeren gedurende 1 uur bij omgevingstemperatuur en 1200 rpm op een trilplaat.
- Zuiver het gemerkte antilichamen door gelpermeatiechromatografie (bijvoorbeeld met behulp van een gel met een fractionering bereik tussen 1,5 en 30 kDa opgesloten in een kolom), na van de leveranciers.
- Meet de absorptie bij 280 nm en bij 650 nm in eluaten en bereken het labeleng efficiëntie volgende leverancier aanbevelingen.
OPMERKING: tot 50 x 50-pl-antilichaam labeling reacties kunnen worden uitgevoerd met een enkele flacon van de fluorescerende kleurstof voor het merken 1 mg eiwit. Het wordt aanbevolen om de buizen met aluminiumfolie of, als alternatief bedekken, ondoorzichtige 0,5 ml buizen om doofprocessen voorkomen na stap 4,3. IgG antilichamen wordt optimale labeling bereikt met 3-7 mol van de kleurstof per mol antilichaam.
5. CYANOCHIP Production
- Antilichamen en controles in printoplossing
- Bereid 30 pi van elk gezuiverd antilichaam in printoplossing door het mengen van elk antilichaam bij 1 mg / mL in een commercieel 1x eiwit printing buffer met 0,01% (v / v) Tween 20 (een niet-ionogeen detergens), allen als eindconcentraties.
Opmerking: Als alternatief kan een antilichaam-oplossing 20% glycerol, 1% (w / v) sucrose (of trehalose als conserveermiddel) en 0,01% (v / v) Tween 20 in carbonaatbuffer (pH 8,5) bevatten. - Bereid 30 pi van de printoplossing als controles: (a) 1x eiwit printing buffer met 0,01% (v / v) Tween 20, (b) proteïne-A gezuiverde pre-immune serum bij 1 mg / mL in 1x eiwit printing buffer 0,01% (v / v) Tween 20, en (c) runderserumalbumine (BSA) bij 1 mg / mL in 1x eiwit printing buffer met 0,01% (v / v) Tween 20.
- Bereid 30 pi van een fluorescent gemerkte gezuiverde pre-immune serum bij verschillende concentraties (bijvoorbeeld van 50 ug / ml tot 1 ug / ml) in 1x eiwit printing buffer met Tween 20, zoals in stap 5.1.1. Deze monsters zullen worden gebruikt als fluorescerende merkers kader en relatieve fluorescentie na kwantificatie spotten.
- Voeg 30 ul per putje van de printing oplossingen bereid in stappen 5.1.1, 5.1.2 en 5.1.3 van de hoogste kwaliteit 384-putjes voor microarray fabricage, zoals polypropyleen.
OPMERKING: Eiwit printing buffer verhoogt de kwaliteit en stabiliteit van de antilichamen en Tween 20 homogeniseert spot morphology en bouwt eiwitkoppeling up. Het wordt aanbevolen de 384-well microplaat bij 4 ° C voor gebruik te houden. Bewaar bij -20 ° C voor langere tijd. Polypropyleen heeft een lage DNA, eiwitten, celextract, en kleine moleculen intrinsieke binding.
- Bereid 30 pi van elk gezuiverd antilichaam in printoplossing door het mengen van elk antilichaam bij 1 mg / mL in een commercieel 1x eiwit printing buffer met 0,01% (v / v) Tween 20 (een niet-ionogeen detergens), allen als eindconcentraties.
- Antilichaam printen op een microscoopglaasje
LET OP: Druk de antilichamen op geactiveerd microscoopglaasjes met behulp van verschillende array-platforms, zoals contact, split-naald, of non-contact apparaten, zoals piëzo-elektrische printers of "inkjet" technologieën. In dit werk is de CYANOCHIP routinematig gedrukt door contact met behulp van een robotsysteem (Arrayer) in staat spotten nL hoeveelheden van de antilichamen op de micrometer schaal.- Stel de omgevingsomstandigheden van de drukkerij tot 20 ° C en 40-50% relatieve vochtigheid.
- Stel de schuif substraten (bv 75- x 25-mm-epoxy geactiveerde microscoop glasplaatjes) meerdere identieke antilichaam arra voerenys op elke dia.
- Spot elk gezuiverd antilichaam, met inbegrip van controles en de referentie-frame, in een drievoud vlekpatroon; onder deze omstandigheden, de vlekken 180-200 urn in diameter.
- Na het afdrukken verlaat de dia ten minste 30 minuten bij omgevingstemperatuur te laten drogen en bewaar ze bij 4 ° C; voor het werken in het veld, kan de dia worden getransporteerd en opgeslagen bij omgevingstemperatuur gedurende verscheidene maanden.
OPMERKING: De CYANOCHIP wordt gedrukt in een drievoud plek microarray formaat met 3 x 8 identieke microarray per objectglaasje of 9 identieke arrays in een 1 x 9 microarray-formaat. Elke array grootte niet groter dan de reactiekamer afmetingen voor een 24-well pakking (gewoonlijk 7,5 x 6,5 mm in een 3 x 8 hybridisatiekamer) zijn. - Voordat u de microarray milieu monsters te analyseren, gebruiken FSMI aan de werkende verwatering voor elk antilichaam in een titratie curve te bepalen. Voor elk antilichaam, een standaard concentratie van het overeenkomstige immunogen (10 maart - 10 april cellen / ml) en seriële verdunningen van de fluorescerende antilichaam (tussen 1: 500 en 1: 32.000). De optimale antilichaamconcentratie overeen met 50% van de maximale signaalintensiteit verkregen in de titratiecurve. Ook moet de gevoeligheid en specificiteit voor elk antilichaam bepaald zoals beschreven in Blanco et al. 22.
6. Voorbereiding van de Environmental Multianalyte Extracten voor de TL-Sandwich Microarray Immunoassay (FSMI)
- Multianalyte uittreksel uit een vloeibaar monster
- Neem 1 - 100 ml van het vloeibare monster met een steriele injectiespuit (bijvoorbeeld water uit de kust van een waterreservoir); de hoeveelheid monster is sterk afhankelijk van de potentiële concentratie van het doelwit.
- Concentreer de cellen door het passeren van het watermonster door een 3 urn poriegrootte, 47 mm diameter polycarbonaatfilter; een celconcentratietussen 10 maart - 10 augustus cellen / ml is wenselijk positieve detectie, maar de werkelijke concentratie onbekend.
- Herstel de in het filter met 1 ml van een gemodificeerde Tris-gebufferde zoutoplossing Tween 20 versterkt buffer (TBSTRR; 0,4 M Tris-HCl (pH 8), 0,3 M NaCl en 0,1% Tween 20) biomassa door schrapen met een spatel in een 15-mL buis.
- Homogeniseren en te splitsen met behulp van een draagbare ultrasone processor, zoals beschreven in stap 1,5, of gewoon door en neer te pipetteren meerdere malen; Dit bereidt het monster voor analyse door de microarray.
- Multianalyte uittreksel uit een vast monster
- Weeg tot 0,5 g van de vaste monster (bijvoorbeeld, rock, de bodem of sedimenten) in een 10-mL buis en optellen tot 2 ml TBSTRR.
- Ultrasone trillingen door onderdompeling van de sonicator probe in de buis, door dompelen van de buis in het waterbad van een krachtige sonicatorhoorn, of door een handbediende sonicator. Voer ten minste 5 x 30-scycli bij 30 kHz, stoppend voor 30 s terwijl op ijs.
- Filter zand, klei en andere grof materiaal te verwijderen met een 10 ml spuit gekoppeld met een diameter 10 tot 12 mm, 5- tot 20-um poriegrootte nylon filterhouder. Schuif de monsterhouder door de filter in een 1,5 ml buis. Als het filter verzadigde vetzuren, schudden de suspensie in de injectiespuit en breng het naar een nieuwe; Dit bereidt het filtraat materiaal van de immunoassay (stap 7).
OPMERKING: De buffercapaciteit van TBSTRR afhankelijk van het type monster. Het is belangrijk om de immunoassay onmiddellijk na de bereiding van het milieu extract dragen naar het effect van enzymatische afbraak van de analyten voorkomen. Alternatief voeg proteaseremmers in het milieu extract en bevriezen bij -80 ° C tot de volgende stap.
7. Fluorescerende Sandwich Microarray Immunoassay (FSMI)
- Het blokkeren van de CYANOCHIP
OPMERKING: Vlak voor het gebruik, de behandeling van de pEDRUKT glijdt alle vrije epoxygroepen op het schuifblok en de overmaat van niet-covalent gebonden antilichamen te verwijderen.- Dompel de microarray in 0,5 M Tris-HCl (pH 9) met 5% (w / v) BSA oplossing op een schoon oppervlak (bijvoorbeeld petrischaal of een 50 ml buis) onder zacht roeren van een tuimelschakelaar platform 5 min. Als alternatief, leg de glijbaan naar beneden op een 100- tot 200-ul druppel van de bovenstaande oplossing met de microarray plekken waarvoor zij staat. Verlof voor 3-5 min en dan verder.
- pick voorzichtig op de dia met behulp van plastic getipt pincet; proberen te raken microarray zones te vermijden. Elimineer de overtollige vloeistof door zachtjes kloppen de glijbaan op een papieren handdoek. Ondergedompeld in 0,5 M Tris-HCl (pH 8) met 2% (w / v) BSA oplossing gedurende 30 minuten onder zacht roeren van een rocker platform.
- Droog de slede door het uitvoeren van een korte centrifugatie (200-300 g gedurende 1 minuut) met een commercieel microcentrifuge aangepast voor microscoopglaasjes. Als alternatief, droog de dia door zacht ont kloppeno een papieren handdoek.
- Incubatie van de multianalyte monsterextract met de microarray
- Stel de schuif in een commerciële microarray hybridisatie cassette met 24 putten voor meerdere microarrays; volg de instructies provider.
- Na preparaat en cassette montage pipet tot 50 pl van het monster of extract een verdunning in TBSTRR in elk putje van de cassette.
- Herhaal stap 7.2.2 voor elk monster te analyseren.
- Als een blanco controle Pipetteer 50 ul buffer TBSTRR in ten minste twee afzonderlijke putjes van de cassette.
- Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur onder mengen door pipetteren elke 15 minuten of door het verlaten onder mild schudden. Alternatief incubeer gedurende 12 uur bij 4 ° C.
OPMERKING: Gebruik andere incubatie pakkingen als functie van de microarray patroon. De tijd en temperatuur van de incubatie in stap 7.2.5 empirische parameters die gewoonlijk afhankelijk zijn van de affiniteit en binding kimet be- trekking van elke gekoppelde antigeen-antilichaam.
- het wassen
- Verwijder de monsters door de invoering van de cassette naar beneden en voorzichtig kloppen op een schone, absorberend papier.
- Was de putjes door het toevoegen van 150 pi van TBSTRR een ieder, en verwijderen van de buffer, zoals hierboven.
- Herhaal stap 7.3.2 drie keer.
- Incubatie met fluorescerende detector antilichamen
- Voeg 50 ul van een mengsel dat het antilichaam 17 tegen cyanobacteriën-stam antilichamen, elk gelabeld met het fluorochroom in TBSTRR met 1% (w / v) BSA. Bepaal de concentratie van elk fluorescerend antilichaam in het mengsel (0,7-2 ug / ml) door het uitvoeren titratie experimenten van elk antigeen / antilichaam pair 22.
- Incubeer gedurende 1 uur bij omgevingstemperatuur, zoals beschreven in stap 7.2.5, of 12 uur bij 4 ° C.
- Uitwassen van de fluorescerende antilichamen </ Strong>
- Verwijder de ongebonden fluorescente antilichamen, zoals in stap 7,3.
- Demonteer de cassette en dompel de dia in 0.1x PBS (bijvoorbeeld in een 50-mL buis) voor een snelle spoelen.
- Droog de dia als in stap 7.1.3.
8. Scannen op Fluorescentie
- Scan de glijbaan voor fluorescentie op emissiemaximum fluorescentiepiek voor ver-rode fluorescerende kleurstof in een scanner voor fluorescentie. Haal een paar beelden van de microarrays bij verschillende scanning parameters, in het algemeen door het verlagen van de laser gain-waarde.
LET OP: Vermijd verzadigde vlekken (> 65.000 fluorescentie tellingen) -ze zijn uit de schaal en kunnen kwantificeren fouten te introduceren.
9. Beeldverwerking en data-analyse
- Gebruik een commerciële software voor het analyseren en kwantificeren; De software levert metingen van de fluorescentie-intensiteit (FI, mediaan of gemiddelde van alle pixels van een enkele spot) voor each spot van de hele microarray. Trek de lokale achtergrond rond de spots: FI = FI spot - FI lokale achtergrond.
- Sla de FI data en open ze met behulp van een spreadsheet-programma.
- Gebruik de waarden verkregen voor de lege arrays als de negatieve controle om de valse positieven te identificeren en te verwijderen. Pas de volgende vergelijking om de FI voor elk antilichaam spot te berekenen: FI = (FI monster - FI blanco), waarbij FI monster = FI spot - FI lokale achtergrond in de microarrays uitgevoerd met monsterextracten en FI blank = FI spot - FI lokale achtergrond in het lege microarrays.
- Breng een extra uitschakeldrempel van 2- tot 3-maal de gemiddelde van de FI van de gehele microarray om de kans op valse positieven te minimaliseren; Dit is met name relevant voor slechte kwaliteit microarray beelden en een lage signaal-ruis verhoudingen.
- Maak percelen en / of het uitvoeren van verdere analyse als dat nodig is.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het beschrijft een multiplex immunoassay voor gelijktijdige identificatie van de meest relevante zoetwater cyanobacteriën soorten (Tabel 1) met de CYANOCHIP antilichaam microarray. De microarray kan een 3 x 8 microarray-formaat gedrukt op microscoopglaasjes zijn. Elke microarray bestaat uit een reeks 17 antilichamen gedrukt een drievoud vlekpatroon hun overeenkomstige pre-immune antistoffen en BSA als negatieve controles. De microarrays ook een fluorescerende frame met een fluorescent gelabelde pre-immuun antilichamen gemakkelijk lokaliseren de microarray patroon 22 (Figuur 1).
De microarray werd getest in het veld voor de in situ analyse van watermonsters verzameld op de oever van het zoetwater Lozoya Reservoir, die de stad van Madrid levert. Monsters werden verwerkt zoals hierboven beschreven, en debelangrijkste positieve immuunreacties kwam overeen met antilichamen tegen plankton cyanobacteriën, zoals Microcystis spp. (K4 en K5), en Oscillatoriales, zoals Leptolyngbya spp Benthic. (K10 en K15). Lagere fluorescentiesignalen werden verkregen van Nostocales (K6 en K12, twee planktonische Aphanizomenon spp.), Benthische Rivularia sp. (K8), Anabaena sp. (K1) en planktonic Microcystis flos-aquae sp. (K3). Optische microscoop observaties (niet getoond) toonde een divers cyanobacteriën community binnen overvloedige terrigene puin van de kust. Verschillende soorten van Anabaena domineerde de gemeenschap, maar Microcystis spp. en Pseudanabaena spp. waren ook aanwezig.
Daarnaast werd de microarray ook gevalideerd door het testen van een droge, bijna 1000 jaar oude microbiële mat verzameld in de McMurdo Ice Shelf in Antarctica om te testen op de aanwezigheid van cyanobacteriën markers. Figuur 1 toont zeer fluorescerende, positieve reacties in antilichamen die aan cyanobacteriën geïsoleerd van andere Antarctische matten, met inbegrip van Anabaena sp Benthic. en Leptolyngbya spp. (K14 en K15, respectievelijk). Extra positief immuunreacties werden gedetecteerd met antilichamen tegen plankton cyanobacteriën, zoals Microcystis spp. (K4 en K5), Aphanizomenon spp. (K6 en K12) en Planktothrix rubescens sp. (K17). Lage signalen werden verkregen van antilichamen tegen andere bodemdieren soorten geïsoleerd in een Antarctische mat, met inbegrip van Tolypothrix sp. (K16) en Anabaena sp. (K1). Fluorescerende optische microscopie toonde de aanwezigheid van cellen structureel vergelijkbaar met cyanobacteriën en groene algen (niet getoond). Geen draadvormige cyanobacteriën werden geïdentificeerd. Niettemin, verschillende fluorescerende amorfe structuren van ongeveer 1 urn groot en uitgebreid diffuse fluorescentie gedetecteerd, whilech kon worden toegeschreven aan de aanwezigheid van cellen blijft (gebroken en dode cellen) en extracellulaire polymere stoffen (EPS), respectievelijk. Dienovereenkomstig, de biochemische analyse toonde dat de mat bestaat uit overvloedige hoeveelheden biopolymeren en cellen blijft (complexe biologische materie) die kunnen worden de doelstellingen van de antilichamen in de microarray.
Figuur 1: Snel en betrouwbaar Multiplex Microarray Immunoassay voor het opsporen van Cyanobacteriën. A) Schema toont de belangrijkste stappen van de FSMI voor de analyse van multi-doelsteekproef met CYANOCHIP. B) Schematische voorstelling van een drukpatroon weergave (door drievoud) van het anti-antilichaam cyanobacteriën collectie: (0) BSA, runderserumalbumine; (X) alleen afdrukken buffer; (1-17) elk van de antilichamen zoals in tabel 1 in BLanco et al. 2015 (K1 tot K17). Van p1 tot p17, de overeenkomstige pre-immune antilichamen fungeren als controles. De gele rechthoeken komen overeen met een fluorescerende spot verloop als een referentiekader. C en D) Foto toont het bovenste deel van een 1000-jaar-oude droge microbiële mat van het CYANOCHIP beeld detecteren van cyanobacteriën in deze mat, respectievelijk de McMurdo Ice Shelf (Antarctica) en. E) Panoramisch uitzicht op de Lozoya Reservoir tonen transparant water zonder zichtbare groene deeltjes op het moment van de bemonstering. Image microarray na de in situ analyse van het watermonster F) (gemodificeerd uit referentie 22).
| Ab code | Immunogeen (stam) | Bestellen | Habitat | | kweekomstandigheden | |
| K1 | Anabaena sp. | Nostocales | onbekend | BG11 en nitraat | 30 ºC, continu licht |
| K2 | Anabaena sp. | Nostocales | onbekend | BG11o | 30 ºC, continu licht |
| K3 | Microcystis flos-aquae | Chroococcales | plankton | BG11 | 28 ºC, continu licht |
| K4 | Microcystis novacekii | Chroococcales | plankton | BG11 | 28 ºC, continu licht |
| K5 | Microcystis aeruginosa | Chroococcales | plankton | BG11 | 28 ºC, continu licht |
| K6 | Aphanizomenon ovalisporum | Nostocales | plankton | BG11o | 28 ºC, continu licht |
| K7 | Phormidium sp. | Oscillatoriales | bodemdieren | BG11 | 18 ºC, 16-8 fotoperiode |
| K8 | Rivularia sp. | Nostocales | bodemdieren | CHU-D | 18 ºC, 16-8 fotoperiode |
| K9 | Chamaesiphon sp. | Chroococcales | bodemdieren | BG11 | 18 ºC, 16-8 fotoperiode |
| K10 | Leptolyngbya Boryana | Oscillatoriales | bodemdieren | BG11 | 18 ºC, 16-8 fotoperiode |
| K11 | Tolypothrix distorta | Nostocales | bodemdieren | BG11o | 18 ºC, 16-8 fotoperiode |
| K12 | Aphanizomenon aphanizomenoides | Nostocales | plankton | BG11o | 28 ºC, continu licht |
| K13 | Nostoc sp. (Antarctica) | Nostocales | bodemdieren | BG11o | 13 ºC, 16-8 fotoperiode |
| K14 | Anabaena sp. | Nostocales | bodemdieren | BG11o | 13 ºC, 16-8 fotoperiode |
| K15 | Leptolyngbya sp. | Oscillatoriales | bodemdieren | BG11 | 13 ºC, 16-8 fotoperiode |
| K16 | Tolypothrix sp. | Nostocales | bodemdieren | BG11 | 13 ºC, 16-8 fotoperiode |
| K17 | Planktothrix rubescens | Oscillatoriales | planktonic | geen | geen |
Tabel 1. Lijst van de Antilichamen (Abs) en de cyanobacteriën stammen gebruikt om de CYANOCHIP 22 Produce.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier wordt een multiplex fluorescerende sandwich immunoassay met de CYANOCHIP, een 17-antilichaam microarray voor de detectie en identificatie van een breed scala van cyanobacteriën genera, beschreven 22. Deze blauwalgen vormen de meest voorkomende bodemdieren en plankton genera in zoetwaterhabitats, sommigen van hen zijn toxine producenten. Onlangs heeft de fluorescentie immunoassay format gebruikt om micro-organismen en / of bioanalytes identificeren milieutoepassingen 26, 27, 28. Het protocol is voornamelijk gebaseerd op twee stappen: (i) het immobiliseren of vangende antilichamen specifiek binden analyten uit een testmonster en (ii) het detecteren van analyt-antilichaam paren met fluorescent gemerkte antilichamen (tracer of detector antilichamen). Omdat de sandwich assay vereist ten minste twee toegankelijke antilichaam bindingsplaatsen (epitopen) het analytde reactie plaatsvindt, positieve fluorescent signaal duidt op de aanwezigheid van relatief grote en complexe oligo- of multimere analyten die identiek of sterk vergelijkbaar met die toegepast om de vangende antilichamen produceren.
Hoewel deze werkwijze kleine volumes en eenvoudig monstervoorbereiding, zonder dat speciale deskundigheid of kennis vereist, kunnen meerdere nadelen de assay ruïneren. Lage fluorescerende signalen of een compleet gebrek daarvan kan als gevolg van slechte antilichaam zuivering of slechte etikettering efficiëntie. Voor de isolatie van konijn IgG, eiwit A de beste keuze, omdat het specifiek bindt met hoge efficiëntie naar het Fc-gebied van immunoglobulinen. Zoals aangegeven in hoofdstuk 4, moet fluorescerende antilichamen met een etikettering bereik tussen 3-7 mol kleurstof per mol antilichaam worden gebruikt. Bovendien kan een gebrek aan fluorescerende spots worden verklaard door de concentratie van analyten liggen onder de detectielimiet. In dit geval kan het monster worden concentrated vóór incubatie met de microarray of grotere hoeveelheden kunnen worden gebruikt voor een nieuwe extractie. High fluorescerende achtergronden zijn het gevolg van inefficiënte chip blokkeren en / of wasstappen en uittreksels uit monsters samengesteld uit mineralen en complexe organische stof die stok op de chip. Bij complexe monsters worden gebruikt als analyten, is het wenselijk om het zout en / of de detergensconcentratie te verhogen tot de specifieke interactie van analyt-antilichaam paren begunstigen.
De laatste jaren heeft antilichaam microarray technologie ontwikkeld voor milieutoepassingen. Toch moet het gebruik van deze techniek inhoudt enkele beperkingen. Polyklonale antilichamen zijn sneller en goedkoper te produceren en, belangrijker, de mogelijkheid om elk doelwit epitoop in een complex milieumonster binden theoretisch hoger dan met monoklonale antilichamen. Echter, het feit dat zij verschillende epitopen kunnen herkennen verhoogt het aantal kruisreacties in FSMI. Om hoge specificiteit te verkrijgen, het gebruik van methoden om deze kruisreactiviteit gebeurtenissen van de ware verwant antigeen-antilichaamreacties ontwarren door deconvolutie 26, 27, bijvoorbeeld, is zeer wenselijk. In principe wordt de microarray als een kwalitatieve biosensor om verscheidene detectie en classificatie van cyanobacteriën. In dit verband is het essentieel om de detectielimiet te bepalen voor elk antilichaam één voor één aan hun optimale werkende concentraties gebruikt in de assay. Hoewel microarray samen met FSMI, wordt niet als een kwantitatieve methode bedacht, de biosensor impliceert hoge gevoeligheid, omdat de onderste detectiegrens van de meeste van de antilichamen in het CYANOCHIP 22 is vanaf 10 februari - 10 maart cellen / ml.
Ondanks deze beperkingen, deze methode heeft een aantal voordelen ten opzichte van andere technieken die in het milieu monitoring. Antilichaam-biosensoren kan de mogelijkheid gelijktijdig herkennen van verschillende moleculen in één analyse, de mogelijkheid van het detecteren van lage concentratie van analyten, en de mogelijkheid van het produceren van antilichamen tegen bijna elke stof. Bovendien kan de microarray tot wel 24 analyses in een enkele test met detectiegrenzen van 2 10 cellen / ml. In vergelijking met andere methoden kunnen antilichamen levende of dode cellen, extracellulair materiaal, en celresten te detecteren. Hoewel het duurt minstens 4 uur om de hele test te voltooien, is het sneller dan andere analytische methoden toegepast op toezicht op het milieu. De CYANOCHIP werd oorspronkelijk bedacht voor de identificatie van cyanobacteriën stammen. Deze biosensor niet formeel daarvoor bedoeld, dus het potentieel toxine producenten kunnen identificeren en in de toekomst kunnen worden verbeterd door antilichamen tegen een groot aantal nieuwe stammen. Biochemische assays, zoals ELISA, PPIA en neurochemischeproeven bij muizen, zodat de identificatie van cyanotoxines, maar ze zijn beperkt tot een paar bekende toxines en kan valse positieven geven. Bovendien, met behulp van de CYANOCHIP geen speciale training nodig, terwijl de optische microscopie en muis bioassays vereisen opgeleid personeel of arbeidsintensieve werken met levende dieren, en ze hebben geen informatie over de aard van de giftige stoffen die aanwezig zijn in een monster te geven. Cyanotoxines kunnen ook worden geïdentificeerd en gekwantificeerd door andere analytische werkwijzen, zoals HPLC, GC-MS of MALDI-TOF. In deze methoden, moet het monster worden gezuiverd, en het ontbreken van een verwijzing normen beperkt de identificatie van cyanotoxines. Bovendien analysemethoden vereisen dure apparatuur en benodigdheden en gespecialiseerde opleiding. Molecular methoden zijn gebaseerd op DNA-extractie van de monsters, terwijl FSMI milieu extract bereid in een aantal eenvoudige stappen zonder zuivering vereist slechts cyanobacteriën.
De hoge prestaties van de CYANOCHIP voorde in situ detectie van cyanobacteriën in zoet water reservoirs maakt het een nieuw instrument voor de vroegtijdige waarschuwing van de waterbeheerders. Daarnaast is de microarray is ook interessant voor het gebied van astrobiology, met name voor het zoeken naar microbiële markers als bewijs van het leven. De studie van extremofielen kan ons helpen om de oorsprong van het leven op Aarde te begrijpen en hoe het leven zou kunnen overleven in de extreme omstandigheden die aanwezig zijn in ons zonnestelsel en daarbuiten. Zoals meerdere omgevingen op Aarde zijn zeer vergelijkbaar met plekken op andere planeten zoals Mars, zou het mogelijk zijn om restanten van fotosynthetische prokaryoten als bewijzen van uitgestorven leven te vinden. De microarray kon cyanobacteriën markers van levende of niet-levende cellen; van de bevolking blijven en / of extracellulair materiaal oud microbiële matten (figuur 1); en van water, bodem en rotsen verzameld in extreme omgevingen, zoals Antarctica, Atacama, de Andes-meren, de Hoge Noordpoolgebied, of deRio Tinto gebied Spanje (niet getoond). Gezien het feit dat cyanobacteriën zijn de oorspronkelijke micro-organismen op aarde, is er reden om te geloven dat ze ooit op andere planeten zou hebben geleefd.
Tot slot, het feit dat CYANOCHIP-FSMI kunnen identificeren in situ cyanobacteriën markers en kan ze zelfs koppelen aan verschillende phylotypes of groepen, en dat de microarray omvat een breed scala van habitats, waaronder die van plankton, benthos en endoliths, toont aan dat dit techniek kan een instrument voor toezicht op het milieu. Toekomstige verbeteringen aan de microarray bestaat erin het aantal antilichamen verhogen om nieuwe stammen waardoor relevante fylogenetische groepen nog aanhangige inbegrepen. Bovendien kan de chip worden uitgevoerd met antilichamen tegen specifieke cyanobacteriën verbindingen zoals toxinen of cyanophicin polymeer. Dit geldt met name voor het bewaken van zoet water reservoirs, leidingen en installaties in menselijke faciliteiten. De huidige microarray en toekomstige versies zal zeer nuttig zijn op het gebied van astrobiology, hetzij voor het leven detectie of voor het bewaken van bemande ruimtevaart voorzieningen (bijvoorbeeld het toezicht op waterreservoirs of life support systemen). In feite hebben we routinematig gebruik de microarray op veldcampagnes extreme omgevingen een werkwijze voor de "on-site" detectie van leven blijft. De microarray maakt deel uit van de zogenaamde Life Detector Chip (LDChip), een microarray met meer dan 300 antilichamen voor de zoektocht naar het leven in planetaire missies 29, 30. De microarray alleen of als onderdeel van de LDChip zal in de tekenen van Life Detector (SOLID) instrument 29 worden uitgevoerd om de SOLID-LDChip concept voor planetaire exploratie in meerdere veldcampagnes aan terrestrische analogen valideren. De microarray zal nuttige informatie verschaffen door het identificeren van cyanobacteriën en / of hun gifstoffen. Door bepaling van de stammen, zal give informatie over de omgeving en de habitats waarin ze ontwikkeld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Wij danken Dr. Antonio Quesada aan de Universidad Autónoma de Madrid voor het verstrekken van cyanobacteriën stammen. Dit werk werd gefinancierd door de Subdirección General de Proyectos de Investigación van de Spaanse Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO), verleent geen. AYA2011-24803 en ESP2014-58494-R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 mm pore diameter filters | Millipore | GSWP04700 | For preparation of immunogens |
| Eppendorf 5424R microcentrifuge | Fisher Scientific | For preparation of immunogens | |
| Phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 (10x) | Thermo Fisher Scientific | 70011036 | 50 mM potassium phosphate, 150 mM NaCl, pH 7.4 |
| Ultrasonic processor UP50H | Hielscher | For preparation of immunogens | |
| Complete Freund's adjuvant | Sigma-Aldrich | F5881 | Immunopotentiator |
| Incomplete Freud's adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | For boost injections |
| Protein A antibody purification kit | Sigma-Aldrich | PURE1A | For isolation of IgG |
| Centrifugal filter devices MWCO<100 kDa | Millipore | UFC510096-96K | For isolation of IgG |
| Dialysis tubings, benzoylated | Sigma-Aldrich | D7884-10FT | For isolation of IgG |
| Illustra Microspin G-50 columns | GE-HealthCare | GE27-5330-02 | For isolation of IgG |
| Bradford reagent | Sigma-Aldrich | B6916-500 mL | To quantify the antibody concentration |
| MicroBCA protein assay kit | Thermo Scientific | 23235 | To quantify the antibody concentration |
| Protein arraying buffer 2x | Whatman (Sigma Aldrich) | S00537 | Printing buffer; 30 - 40% glycerol in 1x PBS with 0.01% Tween 20 |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | Non-ionic detergent |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | Control for printing; blocking reagent |
| 384-wells microplate | Genetix | X6004 | For antibody printing |
| Robot arrayer for multiple slides | MicroGrid II TAS arrayer from Digilab | For antibody printing | |
| Epoxy substrate glass slides | Arrayit corporation | VEPO25C | Solid support for antibody printing |
| Alexa Fluor-647 Succinimidyl-ester | Molecular probes | A20006 | Fluorochrome |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | Fluorochrome dissolvent |
| Heidolph Titramax vibrating platform shaker | Fisher Scientific | For antibody labeling | |
| Illustra Microspin G-50 columns | Healthcare | 27-5330-01 | For purification of labeled antibodies |
| Safe seal brown 0.5 mL tubes | Sarstedt | 72,704,001 | For labeled antibodies storage |
| Nanodrop 1000 spectrophotometer | Thermo Scientific | To quantify antibody concentration and labeling efficiency | |
| 3 µm pore size polycarbonate 47 mm diameter filter | Millipore | TMTP04700 | To concentrate cells |
| 1 M Trizma hydrochloride solution pH 8 | Sigma-Aldrich | T3038 | For TBSTRR preparation; to block slides |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | For TBSTRR preparation |
| 20 µm nylon filters | Millipore | NY2004700 | For environmental extract preparation |
| 10 - 12 mm filter holders | Millipore | SX0001300 | For environmental extract preparation |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | For environmental extract storage |
| 1 M Trizma hydrochloride solution pH 9 | Sigma-Aldrich | T2819 | To block slides |
| Heidolph Duomax 1030 rocking platform shaker | VWR | To block slides; for incubation processes | |
| VWR Galaxy miniarray microcentrifuge | VWR | C1403-VWR | To dry slides |
| Multi-Well microarray hybridization cassette | Arrayit corporation | AHC1X24 | Cassette for 24 assays per slide |
| GenePix 4100A microarray scanner | Molecular Devices | Scanner for fluorescence | |
| GenePix Pro Software | Molecular Devices | Software for image analysis and quantification |
References
- Simis, S. G. H., Peters, S. W. M., Gons, H. J. Remote sensing of the cyanobacterial pigment phycocianin in turbid inland water. Limnol. Oceanogr. 50 (1), 237-245 (2005).
- Zamyadi, A., McQuaid, N., Prevost, M., Dorner, S. Monitoring of potentially toxic cyanobacteria using an online multi-probe in drinking water sources. J. Environ. Monit. 14, 579-588 (2012).
- Msagati, T. A. M., Siame, B. A., Shushu, D. D. Evaluation of methods for the isolation, detection and quantification of cyanobacterial hepatotoxins. Aquat. Toxicol. 78 (4), 382-397 (2006).
- Weller, M. G. Immunoassays and biosensors for the detection of cyanobacterial toxins in water. Sensors. 13 (11), 15085-15112 (2013).
- Baker, J. A., Neilan, B. A., Entsch, B., McKay, D. B. Identification of cyanobacteria and their toxigenicity in environmental samples by rapid molecular analysis. Environ. Toxicol. 16 (6), 472-482 (2001).
- Li, H., Singh, A. K., McIntyre, L. M., Sherman, L. A. Differential gene expression in response to hydrogen peroxide and the putative PerR regulon of Synechocystis sp. Strain PCC 6803. J. Bacteriol. 186 (11), 3331-3345 (2004).
- Anderson, D. M., Cembella, A. D., Hallegraeff, G. M. Progress in understanding harmful algal blooms: paradigm shifts and new technologies for research, monitoring, and management. Ann. Rev. Mar. Sci. 4, 143-176 (2012).
- Dittami, S. M., Pazos, Y., Laspra, M., Medlin, L. K. Microarray testing for the presence of toxic algae monitoring programme in Galicia (NW Spain). Environ. Sci. Pollut. Res. Int. 20, 6778-6793 (2013).
- Kegel, J. U., Del Amo,, Medlin, Y., K, L. Introduction to Project MIDTAL: its methods and samples from Arcachon Bay, France. Environ. Sci. Pollut. Res. Int. 20 (10), 6690-6704 (2013).
- Marcheggiani, S., et al. Detection of emerging and re-emerging pathogens in surface waters close to an urban area. Int. J. Environ. Res. Public Health. 12 (5), 5505-5527 (2015).
- Fernández-Calvo, P., Näke, C., Rivas, L. A., García-Villadangos, M., Gómez-Elvira, J., Parro, V. A multi-array competitive immunoassay for the detection of broad-range molecular size organic compounds relevant for astrobiology. Planet. Space Sci. 54 (815), 1612-1621 (2006).
- Parro, V. Antibody microarrays for environmental monitoring. Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg, Germany. 2699-2710 (2010).
- Fan, Z., Keum, Y. S., Li, Q. X., Shelver, W. L., Guo, L. H. Sensitive immunoassay detection of multiple environmental chemicals on protein microarrays using DNA/dye conjugate as a fluorescent label. J. Environ. Monit. 14 (5), 1345-1352 (2012).
- Rivas, L. A., García-Villadangos, M., Moreno-Paz, M., Patricia Cruz-Gil, P., Gómez-Elvira, J., Parro, V. A 200-Antibody microarray biochip for environmental monitoring: Searching for universal microbial biomarkers through immunoprofiling. Anal. Chem. 80 (21), 7970-7979 (2008).
- Delehanty, J. B., Ligler, F. S. A microarray immunoassay for simultaneous detection of proteins and bacteria. Anal. Chem. 74 (21), 5681-5687 (2002).
- Ligler, F. S., Taitt, C. R., Shriver-Lake, L. C., Sapsford, K. E., Shubin, Y., Golden, J. P. Array biosensor for detection of toxins. Anal. Bioanal. Chem. 377 (3), 469-477 (2003).
- Rucker, V. C., Havenstrite, K. L., Herr, A. E. Antibody microarrays for native toxin detection. Anal. Biochem. 339 (2), 262-270 (2005).
- Kang, J., Kim, S., Kwon, Y. Antibody-based biosensors for environmental monitoring. Toxicol. Environ. Health. Sci. 1 (3), 145-150 (2009).
- Herranz, S., Marazuela, M. D., Moreno-Bondi, M. C. Automated portable array biosensor for multisample microcystin analysis in freshwater samples. Biosens. Bioelectron. 33 (1), 50-55 (2012).
- Shlyapnikov, Y., et al. Rapid simultaneous ultrasensitive immunodetection of five bacterial toxins. Anal. Chem. 84 (13), 5596-5603 (2012).
- Szkola, A., et al. Rapid and simultaneous detection of ricin, staphylococcal enterotoxin B and saxitoxin by chemiluminescence-based microarray immunoassay. Analyst. 139, 5885-5892 (2014).
- Blanco, Y., Quesada, A., Gallardo-Carreño, I., Jacobo Aguirre,, Parro, J., V, CYANOCHIP: An antibody microarray for high-taxonomical-resolution cyanobacterial monitoring. Environ. Sci. Technol. 49 (3), 1611-1620 (2015).
- Bradford, M. M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Anal. Chem. 72, 248-254 (1976).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J.
- Smith, P. K., et al.
- Rivas, L. A., Aguirre, J., Blanco, Y., González-Toril, E., Parro, V. Graph-based deconvolution analysis of multiplex sandwich microarray immunoassays: applications for environmental monitoring. Environ. Microbiol. 13 (6), 1421-1432 (2011).
- Blanco, Y., et al. Deciphering the prokaryotic community and metabolisms in south african deep-mine biofilms through antibody microarrays and graph theory. PloS One. 9 (2), e114180 (2014).
- Gas, F., Baus, B., Queré, J., Chapelle, A., Dreanno, C. Rapid detection and quantification of the marine toxic algae, Alexandrium minutum, using a super-paramagnetic immunochromatographic strip test. Talanta. 147, 581-589 (2016).
- Parro, V., et al. SOLID3: a multiplex antibody microarray-based optical sensor instrument for in situ life detection in planetary exploration. Astrobiology. 11, 15-28 (2011).
- McKay, C. P., et al. The Icebreaker Life Mission to Mars: a search for biomolecular evidence for life. Astrobiology. 13, 334-353 (2013).
