Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Experimentellt protokoll för att upptäcka Published: February 7, 2017 doi: 10.3791/54994
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Molecular Evolution, Centro de Astrobiología (CAB, INTA-CSIC)

Abstract

Den globala uppvärmningen och övergödning göra några vattenekosystem beter sig som riktiga bioreaktorer som utlöser snabb och massiv cyanobakterier tillväxt; Detta har relevant hälsa och ekonomiska konsekvenser. Många blågrön stammar är toxinproducenter, och endast ett fåtal celler är nödvändiga för att framkalla irreparabla skador på miljön. Därför myndigheter vattenkropps och förvaltningar kräver snabba och effektiva system för tidig varning som ger tillförlitliga data för att stödja deras förebyggande eller botande beslut. Detta manuskript rapporterar ett experimentellt protokoll för in-fältet detektion av toxinproducerande blågrön stammar genom användning av en antikropp microarray chip med 17 antikroppar (Abs) med taxonomisk upplösning (CYANOCHIP). Här, en multiplex fluorescerande sandwich microarray immun (FSMI) för samtidig övervakning av 17 blågrön stammar hittades ofta blommar i sötvattensekosystem, några av dem toxinproducenter, beskrivs. En mikromatris med multipel identiska replikat (upp till 24) av CYANOCHIP trycktes på en enda objektglas för att samtidigt testa ett liknande antal prover. Vätskeprover kan testas antingen genom direkt inkubation med antikroppar (Abs) eller efter cellkoncentrationen genom filtrering genom ett 1- till 3-pm filter. Fasta prover, såsom sediment och mark stenar, först homogeniseras och sprids av en handhållen ultraljud i en inkubationsbuffert. De är sedan filtrerade (5-20 ^ m) för avlägsnande av det grova materialet, och filtratet inkuberas med Abs. Immunreaktioner avslöjas av en slutlig inkubering med en blandning av 17 fluorescensmärkt Abs och läses av en portabel fluorescensdetektor. Hela processen tar ungefär tre timmar, det mesta motsvarar två 1-h perioder inkubation. Utgången är en bild, där ljuspunkter motsvara positiv detektion av blågrön markörer.

Introduction

Detektering och övervakning av mikroorganismer i komplexa naturliga mikrobiella samhällen är avgörande på många områden, inklusive biomedicin, miljö ekologi och astrobiologi. Cyanobakterier är prokaryota mikroorganismer välkända för sin förmåga att bilda blooms (överskott av tillväxt) av celler i sötvatten. De finns överallt, och många arter kan producera toxiner, leder inte bara till en potentiell risk för människors hälsa, men också till en ekologisk påverkan. I detta avseende är det viktigt att utveckla snabba och känsliga metoder för tidig upptäckt av cyanobakterier och / eller deras toxiner i mark och vatten. För detta ändamål har en multiplex fluorescerande sandwich microarray immun (FSMI) utvecklats som ett verktyg för vatten chefer för att hjälpa dem att fatta beslut och följaktligen att genomföra ordentliga vatten hanteringsprogram.

Ett varierat utbud av metoder har utvecklats för att upptäcka och identifiera cyanobacterial celler och cyanotoxins i mark och vatten, inklusive optisk mikroskopi, molekylärbiologi och immunologiska tekniker. Dessa metoder kan variera kraftigt i den information de tillhandahåller. Mikroskopiska tekniker bygger på cellmorfologi och detektion av in vivo fluorescens från blågröna pigment, såsom phycocyanin eller klorofyll 1. Även om de är snabba och billiga metoder för realtids och frekvent övervakning som informerar om typ och antal av cyanobakterier förekommer i ett prov, ger de inte information om den potentiella toxiciteten. Dessutom kräver de en viss nivå av kompetens, med tanke på att det ofta är mycket svårt att skilja mellan närbesläktade arter 2. För att övervinna dessa begränsningar, måste ljusmikroskop åtföljas av både biologiska och biokemiska screeningsanalyser och fysikalisk-kemiska metoder för identifiering och kvantifiering av cyanotoxins.

tre, fyra. Dessutom är dessa metoder är tidskrävande; kräver dyrbar utrustning, förnödenheter och provberedning; och måste utföras av erfaren och specialiserad personal.

Molekylbaserade metoder har använts i flera årtionden för att upptäcka, identifiera och kvantifiera cyanobakterier och deras motsvarande cyanotoxins tack vare sekvensinformationen publiceras i genomdatabaser (t.ex. National Center for Biotechnology Information, NCBI). Bland dessa metoder är de som är baserade på polymeraskedjereaktionen (PCR), som kräver utformning av uppsättningar av primrar för DNA-amplifiering och beror på tidigare kunskap om DNA-sekvenser av olika blågrön arter. Medan gen upptäckt, liksom fykocyanin operonet leder till korrekt identifikation på släktet nivå, vissa arter eller stammar är oupptäckt meddenna metod. Men toxin-kodande gener, såsom de som tillhör microcystin operonet, underlätta identifieringen av gifter i prover där producenterna är knappa fem. Ändå gör detektion av toxinmarkörer av PCR inte nödvändigtvis toxicitet i miljön. Dessutom är den uppsättning primers utvecklats för att analysera hela skalan av arter av cyanobakterier och toxinproducenter som finns i ett prov fortfarande ofullständig, och ytterligare studier måste göras för att identifiera okända arter. Andra molekylära tekniker är icke-PCR-baserade, såsom fluorescens in situ hybridisering (FISH) och DNA microarrays.

Under de senaste två decennierna har microarray teknik blivit allt viktigare i många tillämpningsområden, särskilt i miljöövervakning. Mikromatris medger diskriminering mellan arter och analyter 4, 6, 7 sup>, 8, 9, 10, men de anses mycket mödosam och tidskrävande uppgifter som omfattar flera steg (t.ex. microarray prestanda, DNA-extraktion, PCR-amplifiering och hybridiserings). Av den anledningen mindre tidskrävande analyser baserade på antikroppar, såsom sandwich och konkurrenskraftiga immunologiska mikroarrayer, har blivit en viktig och pålitlig hög genomströmning metod för detektion av flera miljö analyter 11, 12, 13. Förmågan hos antikroppar att specifikt känna igen sina målföreningar och att detektera små mängder av analyter och proteiner, tillsammans med möjligheten att producera antikroppar mot nästan vilken som helst substans, gör microarrays antikropps en kraftfull teknik för miljöändamål. Dessutom förmåga att uppnå flera analyser in somIngle analys med detektionsgräns som sträcker sig från ppb till ppm, är en av de viktigaste fördelarna med denna metod 14.

Antikroppsbaserade biosensorer har visat sig vara känsliga och snabba verktyg för påvisande av ett brett spektrum av patogener och toxiner i miljöövervakning 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21. Även DNA-metoder involverar flera steg, de antikroppsbaserade microarrays kräver endast en liten provberedning som huvudsakligen grundar sig på en kort lys steg i en lämplig buffertlösning. Delehanty och Ligler 15 rapporterade samtidig detektion av proteiner och bakteriella analyter i komplexa blandningar baserade på en antikropp sandwich-immunanalys med förmåga att detektera en proteinkoncentration av 4 ppb end 10 4 cfu / ml celler. Szkola et al. 21 har utvecklat en billig och pålitlig multiplex microarray för samtidig detektion av proteotoxins och små toxiner, föreningar som kan användas i biologisk krigföring. De upptäckta koncentrationerna av ricin toxin, med en detektionsgräns på 3 ppb, i mindre än 20 minuter. Nyligen har CYANOCHIP en antikropp microarray-baserad biosensor för in situ-detektion av giftiga och ogiftiga cyanobakterier, har beskrivits 22. Detta microarray möjliggör identifiering av potentiella cyanobakterieblomningar, främst i vattenmiljöer, som är svåra att identifiera mikroskopiskt. Gränsen för detektering av microarray är 10 från 02 till 10 mars celler för de flesta arter, svarvning denna biosensor i ett kostnadseffektivt verktyg för multiplex detektion och identifiering av cyanobakterier, även på artnivå. Alla dessa egenskaper gör den Antibody microarray teknik, och i synnerhet den metod som presenteras i detta arbete, en snabbare och enklare metod jämfört med de tidigare nämnda teknikerna.

Detta arbete presenterar två exempel på experiment som använder en antikropp microarray-baserad biosensor för att detektera närvaron av cyanobakterier i jord och vattenprover. Det är en enkel och tillförlitlig metod som bygger på en sandwich immun format som kräver mycket små provvolymer och mycket grundläggande provberedning. Metoden kräver en kort tid och lätt kan utföras i fält.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Framställning av de Immunogener

  1. Växa varje cyanobakterier stam i motsvarande odlingsmediet under betingelser som beskrivits i tabell 1.
    NOT: Tillväxtmedium och odlingsbetingelser för varje cyanobakterier stam är listade i tabell 1. Alla blågrön stammar, med undantag för K17, tillhör Antonio Quesada grupp från Autonoma universitetet (Madrid, Spanien). Antikroppen mot Planktothrix rubescens genererades från en naturlig prov av monospecifika blomning av denna cyanobakterien från Vilasouto reservoaren (norra Spanien).
  2. Kvantifiera antalet celler med användning av en cellräkningskammare genom optisk mikroskopi för att erhålla cirka 10 8 celler / ml från en sen exponentiell eller stationär tillväxtfas kultur.
  3. Harvest celler från 5 ml av kulturen genom centrifugering vid 2000 xg under 5 min.
  4. Kassera supernatanten och suspendera cellerna i en 10-ml tube med 5 ml 1x fosfatbuffrad saltlösning (1x PBS) för att erhålla cirka 10 8 celler / ml.
  5. Homogenisera och lysera cellerna i suspension genom sonikering under 5 cykler, 30 s vardera, med ett 30-till 60-s paus på is, med hjälp av en portabel, handhållen ultraljuds processor eller genom doppning av röret i vattenbadet av en cell disruptor vid maximal amplitud (30 kHz).
  6. Upprepa steg 1,3-1,5 för varje stam av cyanobakterie.
    OBS: Sonication producerar cellsprängning och cellulära innehåll release. Medan proteiner och polysackarider är goda immunogener, specifika molekyler, såsom lipider och nukleinsyror, inte inducera ett humoralt immunsvar av sig själva. Därför måste de binder till bärare, såsom polysackarider eller proteiner, för att öka den molekylära komplexitet. Dessutom släpper ultraljudsbehandling intracellulär material som kan utlösa antikroppsproduktion.

2. Produktion av polyklonala antikroppar

  1. Förbered första IMMunogen dos genom att blanda 0,5 ml av den ultraljudbehandlades cellysat som erhållits i steg 1,5 med 0,5 ml av komplett Freunds adjuvans. Leverera den till operatören av ett djur anläggning för polyklonal produktion kaninantikropp.
  2. Förbered tre doser som tidigare för vidare användning som minnes ökar i antikropps produktionsprocessen genom att blanda 0,5 ml av samma homogenatet / lysat som erhållits i steg 1,5 med 0,5 ml Freunds ofullständiga adjuvans. Ge dem till djuranläggningen att uppfylla antikroppsproduktion processen.
  3. Upprepa steg 2,1 och 2,2 för varje ny antikropp tillverkningsprocessen.
    OBS! Normalt är antikroppsproduktion anförtros specialiserade djuranläggningar eller företag, eftersom lämplig licensiering och utbildning krävs för att arbeta med djur. Företagen levererar en relativ enzymkopplad immunabsorberande analys (ELISA) mätning av den mängd av antigenspecifika antikroppar närvarande i serumprovet.

3. Antikropp Purifblue

  1. Rena immunoglobulin G (IgG) fraktionen från både immun- och pre-immunserum som uppsamlats i steg 2 genom protein-A-affinitetskromatografi. Vissa kommersiella reningssatser, baserat på patronsystem fungerar bra; Följ leverantörens anvisningar.
  2. När reningskit inte ger en avsaltnings systemet genom att ändra bufferten efter elueringen av de renade antikropparna till 0,1X PBS, antingen genom dialys eller genom användning av centrifugal filteranordningar med en 100-kDa (eller lägre) membran porstorlek.
  3. Bestämma koncentrationen antikroppen genom mätning av absorbansen vid 280 nm eller med användning av kolorimetriska metoder, såsom Bradford 23, Lowry 24, eller bicinkoninsyra (BCA) 25.
    OBS: Det är viktigt att undvika att ta med amingrupper i elueringsbuffert (t.ex. Tris-buffertar) för att de konkurrerar med antikroppen för bindning till fasta ytor aktiverade med epoxigrupper. efter purification, är det viktigt att testa aktiviteten antikropp med ELISA.

4. Fluorescens Antibody Labeling

  1. Märka de renade antikropparna som erhållits i avsnitt 3 med en fluorokrom (t ex, en långt rött fluorescerande färgämne) genom upplösning av en kommersiell flaska innehållande färgämne för märkning 1 mg protein i 100 mikroliter av dimetylsulfoxid (DMSO). Lägg 2 mikroliter av det upplösta färgämnet till varje antikroppsberedning i en koncentration av 2 mg / ml i en slutlig volym av 50 mikroliter i 50 mM fosfatbuffrad saltlösning (pH 8,5).
  2. Bibehålla de märknings reaktioner under kontinuerlig omröring under 1 h vid omgivande temperatur och 1200 varv per minut på en vibrerande plattform.
  3. Rena de märkta antikropparna efter storlekssorterande kromatografi (t.ex., med användning av en gel med en fraktioneringsområde mellan 1,5 och 30 kDa fångade i en kolonn), följande leverantörens rekommendationer.
  4. Mät absorbansen vid 280 nm och vid 650 nm i eluaten och beräkna labeLing effektivitet efter leverantörs rekommendationer.
    OBSERVERA: Upp till 50 x 50-mikroliter-antikropp-märkningsreaktioner kan göras med en enda flaska med det fluorescerande färgämnet för märkningen en mg protein. Det rekommenderas att täcka rören med aluminiumfolie eller alternativt, att använda ogenomskinliga 0,5 ml rör för att undvika kylningsprocesserna efter steg 4,3. För IgG-antikroppar, är optimal märkning uppnås med 3-7 mol av färgämnet per mol antikropp.

5. CYANOCHIP Produktion

  1. Antikroppar och kontroller i utskriftslösning
    1. Förbered 30 mikroliter av varje renad antikropp i utskriftslösning genom blandning av varje antikropp vid 1 mg / ml i en kommersiell 1x protein tryckning buffert med 0,01% (v / v) Tween 20 (en icke-jonisk detergent), alla såsom slutkoncentrationer.
      OBS: Alternativt kan en antikroppslösning innehåller 20% glycerol, 1% (vikt / volym) sackaros (eller trehalos, som ett konserveringsmedel), och 0,01% (volym / volym) Tween 20 i karbonatbuffert (pH 8,5).
    2. Förbered 30 mikroliter av tryckningslösning som kontroller: (a) 1 x protein utskrift buffert med 0,01% (v / v) Tween 20, (b) protein-A renad pre-immunt serum vid 1 mg / ml i 1 x protein tryckbuffert med 0,01% (v / v) Tween 20, och (c) bovint serumalbumin (BSA) vid 1 mg / ml i 1 x protein utskrift buffert med 0,01% (volym / volym) Tween 20.
    3. Förbered 30 mikroliter av en fluorescensmärkt, renat pre-immunt serum vid olika koncentrationer (t.ex., från 50 | j, g / ml till 1 pg / ml) i 1x protein utskrift buffert med Tween 20, som i steg 5.1.1. Dessa prover kommer att användas som fluorescerande ram markörer och för relativ fluorescens kvantifiering efter observation.
    4. Tillsätt 30 mikroliter per brunn av utskriftslösningar som framställts i steg 5.1.1, 5.1.2 och 5.1.3 till högsta kvalitet 384 mikrobrunnar för microarray tillverkning, såsom polypropylen.
      OBS: Protein tryckbuffert ökar kvaliteten och stabiliteten av antikropparna, och Tween 20 homogeniserar spot morphology och bygger upp proteinkoppling upp. Det rekommenderas att bibehålla 384-brunnars mikroplatta vid 4 ° C före användning. Förvara den vid -20 ° C under långa tidsperioder. Polypropylen har låg DNA, protein, cellextrakt, och små molekyler inneboende bindande.
  2. Antikropps utskrift på ett objektglas
    OBS: Skriv antikropparna på aktiverade objektglas med hjälp av olika array plattformar, som kontakt, split-nål eller kontaktfria anordningar, såsom piezoelektriska skrivare eller "bläckstråle" teknik. I detta arbete har CYANOCHIP rutinmässigt ut av kontakt med ett robotsystem (arrayer) kan upptäcka nL mängder av antikropparna vid um skala.
    1. Ställ miljöförhållandena i tryckrummet till 20 ° C och 40 - 50% relativ fuktighet.
    2. Ställ in glid substrat (t.ex. 75- x 25 mm epoxi-aktiverad mikroskop objektglas) för att utföra flera identiska antikropps ARRAys på varje bild.
    3. Spot varje renad antikropp, inklusive kontroller och referensramen, i tredubbel fläckmönster; under dessa betingelser, fläckarna är 180 - 200 | im i diameter.
    4. Efter utskriften lämna bilderna under åtminstone 30 minuter vid rumstemperatur för att låta dem torka och sedan lagra dem vid 4 ° C; för arbetar på området, kan objektglasen transporteras och förvaras vid rumstemperatur under flera månader.
      OBS! CYANOCHIP skrivs i tredubbel plats microarray format med 3 x 8 identiska mikroarrayer per bild eller 9 identiska matriser i en 1 x 9 microarray format. Varje matrisstorlek får inte vara högre än reaktionskammaren dimensioner för en 24-brunnars packning (vanligen 7,5 x 6,5 mm i en 3 x 8 hybridisering kammare).
    5. Innan du använder microarray att analysera miljöprover, använd FSMI att fastställa arbetsutspädning för varje antikropp i en titrerkurva. För varje antikropp, använd en standardkoncentration av motsvarande IMMunogen (10 april 03-10 celler / ml) och seriespädningar av den fluorescerande antikroppen (mellan 1: 500 och 1: 32000). Den optimala koncentrationen antikropp motsvarar 50% av det maximala signalintensitet som erhölls i titreringskurvan. Dessutom måste känsligheten och specificiteten för varje antikropp bestämmas, såsom beskrivs i Blanco et al. 22.

6. Beredning av miljö Multianalyte Extrakt för fluorescerande Sandwich microarray Immunoassay (FSMI)

  1. Multianalyte utdrag ur ett vätskeprov
    1. Ta 1 - 100 ml av vätskeprovet med en steril spruta (t.ex. vatten från stranden av en vattenreservoar); mängden prov är i hög grad beroende av den potentiella koncentrationen av målen.
    2. Koncentrera cellerna genom att vattenprovet genom en 3-um porstorlek, 47 mm polykarbonat diameter filter; en cellulär koncentrationmellan 10 Mars - 10 augusti celler / ml är önskvärt för positiv detektion, men den faktiska koncentrationen är okänd.
    3. Återvinna den biomassa uppsamlas i filtret med 1 ml av en modifierad Tris-buffrad saltlösning, Tween 20 förstärkt buffert (TBSTRR; 0,4 M Tris-HCl (pH 8), 0,3 M NaCl och 0,1% Tween 20) genom att skrapa den med en spatel i en 15-ml rör.
    4. Homogenisera och disaggregera genom att använda en handhållen ultraljudsprocessor, såsom beskrivs i steg 1,5, eller bara genom att pipettera upp och ned flera gånger; Detta förbereder provet för analys av microarray.
  2. Multianalyte extrakt från en fast prov
    1. Väga upp till 0,5 g av det fasta provet (t.ex. sten, jord eller sediment) i en 10-ml rör och lägga till upp till 2 ml TBSTRR.
    2. Sonikera genom nedsänkning av sonikator sonden i röret, genom doppning av röret i vattenbadet av en kraftfull sonikator hornet, eller genom att använda en handhållen sonikator. Utför åtminstone 5 x 30-scykler vid 30 kHz, stannar under 30 sekunder medan på is.
    3. Filtrera för att avlägsna sand, lera och annat grovt material med en 10-ml spruta kopplad till en 10- till 12-mm diameter, 5- till 20-fim porstorlek nylonfilterhållaren. Skjut in prov genom filtret in i en 1,5-ml rör. Om filter mättade fettsyror, agitera suspensionen i sprutan och ta det till en ny; Detta förbereder filtratet material för immunanalys (steg 7).
      OBS: Den buffrande kapaciteten hos TBSTRR beror på vilken typ av prov. Det är viktigt att utföra immunoanalysen omedelbart efter framställningen av miljö extraktet för att undvika effekten av enzymatisk nedbrytning på analyterna. Alternativt, tillsätt proteasinhibitorer i miljö extraktet och frys vid -80 ° C fram till nästa steg.

7. Fluorescerande Sandwich microarray Immunoassay (FSMI)

  1. Blockering av CYANOCHIP
    OBS: Omedelbart före användning, behandla printed glider för att blockera alla fria epoxigrupper på objektglaset och för att avlägsna överskott av icke-kovalent bundna antikroppar.
    1. Sänk ned microarray in 0,5 M Tris-HCl (pH 9) med 5% (vikt / volym) BSA-lösning på en ren yta (t.ex., petriskål eller ett 50-ml rör) med mild omröring från en rocker plattform under 5 min. Alternativt, lägg glida ner på en 100- till 200-mikroliter droppe av ovanstående lösning med microarray fläckar står inför. Låt verka i 3-5 minuter och fortsätt sedan.
    2. plocka försiktigt upp bilden med hjälp av plast spets pincett; Försök att inte vidröra microarray zoner. Eliminera överskottet av vätska genom mjukt knackar sliden på en pappershandduk. Doppa den i 0,5 M Tris-HCl (pH 8) med 2% (vikt / volym) BSA-lösning under 30 min med mild omröring från en vippa plattformen.
    3. Torka bilden genom att utföra en kort centrifugering (200-300 xg under 1 minut) med en kommersiell mikro anpassad för objektglas. Alternativt, torka bilden av mjukt knackar ontoa pappershandduk.
  2. Inkubation av multianalyte provextraktet med microarray
    1. Ställ in bilden i en kommersiell microarray-hybridisering kassett med 24 brunnar för flera mikroarrayer; Följ leverantörens anvisningar.
    2. Efter slide och kassettanordningen, pipett upp till 50 mikroliter av provextraktet eller en utspädning av den i TBSTRR i varje brunn i kassetten.
    3. Upprepa steg 7.2.2 för varje prov som skall analyseras.
    4. Som en blank kontroll, pipett 50 mikroliter av TBSTRR buffert i åtminstone två separata brunnar i kassetten.
    5. Inkubera vid rumstemperatur under 1 h under blandning genom pipettering varje 15 min eller genom att lämna den under mild skakning. Alternativt inkubera under 12 h vid 4 ° C.
      OBS: Använd andra packningar inkubation som en funktion av microarray mönster. Tiden och temperaturen för inkubationen i steg 7.2.5 är empiriska parametrar som normalt är beroende av affinitet och bindande kinetics av ​​varje parad antigen-antikropp.
  3. Tvättning
    1. Ta proverna genom att kassetten ner och försiktigt knackar det på en ren, absorberande papper.
    2. Tvätta brunnarna genom tillsats av 150 mikroliter av TBSTRR till var och en, och eliminera bufferten, som ovan.
    3. Upprepa steg 7.3.2 tre gånger.
  4. Inkubering med fluorescerande detektorantikroppar
    1. Tillsätt 50 mikroliter av en antikroppsblandning innehållande de 17 anti cyanobakterier-töjnings-antikroppar, var och en märkt med fluorokrom i TBSTRR med 1% (vikt / volym) BSA. Bestämma koncentrationen av varje fluorescent antikropp i blandningen (0,7-2 | ig / ml) genom att utföra titrering experiment för varje antigen / antikroppspar 22.
    2. Inkubera under 1 h vid omgivande temperatur, såsom beskrivs i steg 7.2.5, eller under 12 timmar vid 4 ° C.
  5. Tvätta de fluorescerande antikroppar </ Strong>
    1. Avlägsna de fluorescerande obundna antikroppar, såsom i steg 7,3.
    2. Isär kassetten och sänk bilden i 0,1 x PBS (t.ex. i en 50-ml rör) för en snabb sköljning.
    3. Torka bilden som i steg 7.1.3.

8. Söker efter Fluorescence

  1. Skanna bilden för fluorescens vid emissionsmaximum fluorescenstopp för långt rött fluorescerande färgämne i en scanner för fluorescens. Ta flera bilder av mikromatriser vid olika inläsningsparametrarna, i allmänhet genom att sänka laserförstärkningsvärde.
    OBS: Undvik mättade fläckar (> 65.000 fluorescens räknas) -de är ur skala och kan införa kvantifiering fel.

9. Bildbehandling och dataanalys

  1. Använd en kommersiell programvara för bildanalys och kvantifiering; programvaran ger mätningar av fluorescensintensitet (FI, median eller medelvärde av alla pixlar från en enda fläck) för each plats i hela microarray. Subtrahera lokala bakgrunden runt fläckarna: FI = FI plats - FI lokal bakgrund.
  2. Spara FI uppgifter och öppna dem med ett kalkylprogram.
  3. Använd de värden som erhålls för tomma arrayer som den negativa kontrollen för att identifiera och kassera de falska positiva. Tillämpa följande ekvation för att beräkna FI för varje antikropp plats: FI = (FI prov - FI blank), där FI prov = FI plats - FI lokal bakgrund i microarrays drivs med extrakt prov och FI tom = FI plats - FI lokal bakgrund i tomma mikroarrayer.
  4. Applicera en ytterligare brytgränsen av 2 till 3 gånger genomsnittet av FI hela microarray att minimera sannolikheten för falska positiva; Detta är särskilt relevant för microarray bilder av dålig kvalitet och låga signal-brusförhållanden.
  5. Skapa tomter och / eller utföra ytterligare analys om så behövs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Detta arbete beskriver en multiplex immuntest för samtidig identifiering av de mest relevanta sötvatten blågrön arter (tabell 1) med CYANOCHIP antikroppsmicroarray. Microarray kan vara en 3 x 8 microarray format skrivs ut på objektglas. Varje microarray består av en uppsättning av 17 antikroppar tryckta i tredubbel fläckmönster, motsvarande pre-immuna antikroppar och BSA som negativa kontroller. De microarrays inkluderar även en fluorescerande ram, med användning av en fluorescensmärkt för-immun antikropp att lätt lokalisera microarray mönstret 22 (fig 1).

Microarray testades i fältet för in situ analys av vattenprover som samlats vid stranden av sötvatten Lozoya Reservoir, som förser staden Madrid. Prover bearbetades såsom beskrivits ovan, och denviktigaste positiva immunreaktioner motsvarade antikroppar mot plankton cyanobakterier, såsom Microcystis spp. (K4 och K5), och att bottenlevande Oscillatoriales, såsom Leptolyngbya spp. (K10 och K15). Lägre fluorescenssignaler erhölls från Nostocales (K6 och K12, två plankton Aphanizomenon spp.), Bentiska Rivularia sp. (K8), Anabaena sp. (K1) och plankton Microcystis flos-aquae sp. (K3). Optiskt mikroskop observationer (ej visade) visade en skiftande cyanobakteriell gemenskap inom riklig terrigenous skräp från land. Flera arter av Anabaena dominerade samhället, men Microcystis spp. och Pseudanabaena spp. var också närvarande.

Dessutom var microarray också valideras genom att analysera en torr, nästan 1000-åriga mikrobiell matta samlas i McMurdo Ice Shelf i Antarktis för att undersöka förekomsten av cyanobakterier markers. Figur 1 visar starkt fluorescerande, positiva reaktioner i antikroppar producerade för bentiska cyanobakterier isolerade från andra antarktiska mattor, inklusive Anabaena sp. och Leptolyngbya spp. (K14 och K15, respektive). Ytterligare positiva immunreaktioner upptäcktes med antikroppar mot plankton cyanobakterier, såsom Microcystis spp. (K4 och K5), Aphanizomenon spp. (K6 och K12), och Planktothrix rubescens sp. (K17). Låga signaler erhölls från antikroppar mot andra bottenlevande arter som isolerats i en Antarktiska matta, inklusive Tolypothrix sp. (K16) och Anabaena sp. (K1). Fluorescerande optisk mikroskopi avslöjade närvaron av celler strukturellt liknar cyanobakterier och grönalger (ej visad). Inga tråd cyanobakterier identifierades. Ändå fanns flera amorfa fluorescerande strukturer av ca 1 pm i storlek och kopiösa diffus fluorescens detekteras, which kunde tillskrivas närvaron av cell resterna (bruten och döda celler) och extracellulära polymera substanser (EPS), respektive. Följaktligen visade biokemisk analys att mattan bestod av riklig mängd biopolymerer och cellåterstår (komplexa biologiskt material) som kan vara mål för antikropparna i microarray.

Figur 1
Figur 1: snabb och pålitlig Multiplex microarray immun för att upptäcka cyanobakterier. A) Schema som visar de viktigaste stegen i FSMI för analys av flera riktade urval med en CYANOCHIP. B) Schematisk bild av en tryckmönsterlayout (genom tre exemplar) av samlingen anti cyanobakterier antikropp: (0) BSA, bovint serumalbumin; (X) endast utskrift buffert; (1-17) var och en av antikropparna som i tabell 1 i BLanco et al. 2015 (K1 till K17). Från P1 till P17, motsvarande pre-immuna antikroppar fungera som kontroller. De gula rektanglar motsvarar en fluorescerande fläck gradient som en ram referens. C och D) Bild som visar den övre delen av en 1000-årig torra mikrobiella mattan från McMurdo Ice Shelf (Antarktis) och CYANOCHIP bilddetekterings cyanobakterier i denna matta, respektive. E) Panoramautsikt över Lozoya Reservoir visar transparent vatten utan synliga gröna partiklar vid tidpunkten för provtagning. F) microarray bild efter in situ analys av provet vatten (modifierad från referens 22).

ab-kod Immunogen (stam) Beställa Livsmiljö odlingsbetingelser
K1 Anabaena sp. Nostocales okänd BG11 och nitrat 30 ° C, kontinuerligt ljus
K2 Anabaena sp. Nostocales okänd BG11o 30 ° C, kontinuerligt ljus
K3 Microcystis flos-aquae Chroococcales plankton BG11 28 ° C, kontinuerligt ljus
K4 Microcystis novacekii Chroococcales plankton BG11 28 ° C, kontinuerligt ljus
K5 Microcystis aeruginosa Chroococcales plankton BG11 28 ° C, kontinuerligt ljus
K6 Aphanizomenon ovalisporum Nostocales plankton BG11o 28 ° C, kontinuerligt ljus
K7 Phormidium sp. Oscillatoriales bentiska BG11 18 ºC, 16-8 fotoperiod
K8 Rivularia sp. Nostocales bentiska CHU-D 18 ºC, 16-8 fotoperiod
K9 Chamaesiphon sp. Chroococcales bentiska BG11 18 ºC, 16-8 fotoperiod
K10 Leptolyngbya Boryana Oscillatoriales bentiska BG11 18 ºC, 16-8 fotoperiod
K11 Tolypothrix distorta Nostocales bentiska BG11o 18 ºC, 16-8 fotoperiod
K12 Aphanizomenon aphanizomenoides Nostocales plankton BG11o 28 ° C, kontinuerligt ljus
K13 Nostoc sp. (Antarktis) Nostocales bentiska BG11o 13 ° C, 16-8 fotoperiod
K14 Anabaena sp. Nostocales bentiska BG11o 13 ° C, 16-8 fotoperiod
K15 Leptolyngbya sp. Oscillatoriales bentiska BG11 13 ° C, 16-8 fotoperiod
K16 Tolypothrix sp. Nostocales bentiska BG11 13 ° C, 16-8 fotoperiod
K17 Planktothrix rubescens Oscillatoriales planktonic ingen ingen

Tabell 1. Lista över de Antikroppar (Abs) och de Blågrön Stammar används för att producera den CYANOCHIP 22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Här är en multiplex fluorescerande sandwich immun använder CYANOCHIP, en 17-antikropp microarray för detektion och identifiering av ett brett spektrum av cyanobakterier släkten, beskrivs 22. Dessa cyanobakterier representerar den vanligaste bottenlevande och plankton släkten i sötvatten, vissa av dem är toxinproducenter. Nyligen har fluorescerande sandwich immun format använts för att identifiera mikroorganismer och / eller bioanalytes i miljötillämpningar 26, 27, 28. Protokollet baseras främst på två steg: (i) immobilisering eller fånga antikroppar för att specifikt binda analyter från ett prov och (ii) att detektera analyt-antikropp par med hjälp av fluorescerande antikroppar (spår eller detektor antikroppar). Eftersom sandwichanalysen kräver åtminstone två tillgängliga antikroppbindningsställen (epitoper) i analyten föratt reaktionen skall äga rum, varje positiv fluorescerande signal indikerar närvaron av relativt stora och komplexa oligo- eller multimera analyter som är identiska eller mycket liknande dem som används för att producera de fånga antikroppar.

Även om denna metod kräver små volymer och grundläggande provberedning, utan behov av särskild kompetens eller kunskap, kan flera nackdelar förstöra analysen. Låga fluorescenssignaler eller en total avsaknad därav kan bero på dålig antikroppsrening eller dålig effektivitet märkning. För isolering av kanin-IgG, är protein A det bästa valet, eftersom det specifikt binder med hög effektivitet till Fc-regionen av immunoglobuliner. Såsom anges i avsnitt 4, måste fluorescerande antikroppar med en märkning intervall mellan 3-7 mol färgämne per mol antikropp användas. Dessutom kan en brist av fluorescerande fläckar förklaras av koncentrationen av analyter ligger under detektionsgränser. I detta fall kan provet vara koncentreradentrated före inkubering den med mikromatris, eller större mängder kan användas för en ny extraktion. Höga fluorescerande bakgrunder är resultatet av ineffektiv chip blockering och / eller tvättsteg och extrakt från prover som består av mineraler och komplexa organiska ämnen som sticker ut på chipet. När komplexa prover användes som analyter, är det önskvärt att öka salt och / eller koncentrationen detergent för att gynna den specifika interaktionen mellan analytantikroppspar.

Under de senaste åren har antikroppar microarray teknik utvecklats för miljötillämpningar. Icke desto mindre har användningen av denna teknik innebär vissa begränsningar. Polyklonala antikroppar är snabbare och billigare att producera och, ännu viktigare, en möjlighet att binda eventuell målepitop i en komplex miljöprov är teoretiskt högre än med monoklonala antikroppar. Men det faktum att de kan känna igen olika epitoper ökar antalet korsreaktioner i FSMI. För att få hög specificitet, användning av metoder för att särskilja dessa korsreaktivitet händelser från de sanna cognate antigen-antikroppsreaktioner med hjälp av avfaltning metoder 26, 27, till exempel, är mycket önskvärd. I grund och botten är den mikromatris anses en kvalitativ biosensor för den multipla detektering och klassificering av cyanobakterier. I detta avseende är det viktigt att bestämma detektionsgränsen för varje antikropp en efter en att använda sina optimala arbets koncentrationer i analysen. Även om denna mikromatris, tillsammans med FSMI, är inte tänkt som en kvantitativ metod, innebär biosensorn hög känslighet, eftersom den lägre detektionsgränsen för de flesta av de antikroppar som finns i CYANOCHIP 22 är från 10 2 till 10 3 celler / ml.

Trots dessa begränsningar, har flera fördelar mot andra tekniker som används i miljö m denna metodÖVERVAKNING. Antikropps biosensorer ger möjlighet att erkänna olika molekyler samtidigt i en enda analys, möjligheten att detektera låga koncentrationer av analyter, och möjligheten att producera antikroppar mot nästan alla ämnen. Vidare kan microarray nå upp till 24 analyser i en enda analys, med detektionsgränser från 10 två celler / ml. I jämförelse med andra metoder, kan antikroppar detektera levande eller döda celler, extracellulära material och cellrester. Även om det tar minst fyra timmar att slutföra hela analysen, är det snabbare än andra analysmetoder som tillämpas på miljöövervakning. Den CYANOCHIP var ursprungligen tänkt för identifiering av blågrön stammar. Denna biosensor har inte formellt avsedd för detta ändamål, så det kan identifiera potentiella toxinproducenter och skulle kunna förbättras i framtiden genom att tillsätta antikroppar mot ett brett spektrum av nya stammar. Biokemiska analyser, såsom ELISA, PPIA och neurokemiskatester på möss, möjliggöra identifiering av cyanotoxins, men de är begränsade till ett fåtal kända gifter och kan ge falska positiva. Dessutom, med hjälp av CYANOCHIP inte kräver särskild utbildning, medan optisk mikroskopi och mus bioanalyser kräver utbildad personal eller arbetsintensiva arbetet med levande djur, och de ger inte information om vilken typ av toxiner som förekommer i ett prov. Cyanotoxins kan också identifieras och kvantifieras genom andra analytiska metoder, såsom HPLC, GC-MS, eller MALDI-TOF. I dessa metoder måste provet renas, och avsaknaden av referensstandarder begränsar identifiera cyanotoxins. Dessutom analysmetoder kräver dyr utrustning och förnödenheter och specialiserad utbildning. Molekylära metoder baserade på DNA-extraktion från proven, medan FSMI kräver endast en miljö extrakt framställt i ett par mycket enkla steg, utan cyanobakterier rening.

Den höga prestanda CYANOCHIP förin situ detektering av cyanobakterier i sötvatten reservoarer gör det till ett nytt verktyg för tidig varning av vatten administratörer. Dessutom är mikromatrisen också intressant för området för astrobiologi, i synnerhet för att söka efter mikrobiella markörer som tecken på liv. Studiet av extremofiler kan hjälpa oss att förstå livets ursprung på jorden och hur livet skulle kunna överleva i extrema miljöer som finns i vårt solsystem och bortom. Eftersom flera miljöer på jorden är mycket lika till platser på andra planeter, såsom Mars, kan det vara möjligt att hitta resterna av foto prokaryoter som bevis på utdöda liv. Microarray kunde identifiera blågrön markörer från levande eller icke-levande celler; från befolkningen kvarstår och / eller extracellulära material i gamla mikrobiella mattor (Figur 1); och från vatten, jord och stenar samlas i extrema miljöer, såsom Antarktis, Atacama, de andinska sjöar, högarktiska, ellerRio Tinto område i Spanien (ej visad). Med tanke på att cyanobakterier är urtids mikroorganismer på jorden, finns det anledning att tro att de en gång kan ha levt på andra planeter.

Sammanfattningsvis, det faktum att CYANOCHIP-FSMI kan identifiera in situ blågrönmarkörer och kan även associera dem till olika phylotypes eller grupper, och att microarray täcker ett brett spektrum av livsmiljöer, bland annat av plankton bottenfaunan och endoliths, visar att denna teknik kunde ett verktyg för miljöövervakning. Framtida förbättringar av microarray kan vara att öka antalet antikroppar mot nya stammar, så att relevanta fylogenetiska grupper fortfarande pågår ingår. Dessutom kan chipet implementeras med antikroppar mot specifika blågrön föreningar, såsom toxiner eller cyanophicin polymer. Detta är särskilt relevant för övervakning av sötvattenreservoarer, rör och installationer i mänskliga anläggningar. Den nuvarande microarray och framtida versioner kommer att vara mycket användbar när det gäller astrobiologi, antingen för livet detektering eller för övervakning av mänskliga utrymme anläggningar (t.ex. övervakning vattenreservoarer eller livsuppehållande system). I själva verket rutinmässigt använder vi mikromatris i fältkampanjer för extrema miljöer som en metod för "on-site" detektering av tiden återstår. Microarray är en del av den så kallade Life Detector Chip (LDChip), en mikromatris med mer än 300 antikroppar för sökandet efter liv i planetutforskningsuppdrag 29, 30. Microarray ensam eller som en del av LDChip kommer att genomföras i livstecken detektor (FAST) instrument 29 för att bekräfta SOLID-LDChip koncept för planet prospektering i flera fältkampanjer till mark analoger. Microarray kommer att ge användbar information genom att identifiera cyanobakterier och / eller deras toxiner. Genom bestämning av de stammar, kommer den att give information om de miljöer och miljöer som de utvecklat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Vi tackar Dr Antonio Quesada från Universidad Autónoma de Madrid för att ge blågrön stammar. Detta arbete har finansierats av Subdirección General de Proyectos de Investigación av den spanska Ministerio de Economía y Competitividad (Mineco), ger ingen. AYA2011-24803 och ESP2014-58494-R.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 mm pore diameter filters Millipore GSWP04700 For preparation of immunogens
Eppendorf  5424R microcentrifuge Fisher Scientific For preparation of immunogens
Phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 (10x) Thermo Fisher Scientific 70011036 50 mM potassium phosphate, 150 mM NaCl, pH 7.4
Ultrasonic processor UP50H Hielscher For preparation of immunogens
Complete Freund's adjuvant  Sigma-Aldrich F5881 Immunopotentiator
Incomplete Freud's adjuvant Sigma-Aldrich  F5506 For boost injections
Protein A antibody purification kit   Sigma-Aldrich PURE1A  For isolation of IgG
Centrifugal filter devices MWCO<100 kDa Millipore UFC510096-96K For isolation of IgG
Dialysis tubings, benzoylated Sigma-Aldrich D7884-10FT For isolation of IgG
Illustra Microspin G-50 columns  GE-HealthCare GE27-5330-02 For isolation of IgG
Bradford reagent Sigma-Aldrich B6916-500 mL To quantify the antibody concentration
MicroBCA protein assay kit  Thermo Scientific 23235 To quantify the antibody concentration
Protein arraying buffer 2x Whatman (Sigma Aldrich)  S00537 Printing buffer; 30 - 40% glycerol in 1x PBS with 0.01% Tween 20
Tween 20  Sigma-Aldrich  P9416 Non-ionic detergent
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich  A9418 Control  for printing; blocking reagent
384-wells microplate Genetix X6004 For antibody printing
Robot arrayer for multiple slides MicroGrid II TAS arrayer from Digilab For antibody printing
Epoxy substrate glass slides Arrayit corporation VEPO25C Solid support for antibody printing
Alexa Fluor-647 Succinimidyl-ester  Molecular probes A20006 Fluorochrome
DMSO  Sigma-Aldrich  D8418 Fluorochrome dissolvent
Heidolph Titramax vibrating platform shaker Fisher Scientific For antibody labeling 
Illustra Microspin G-50 columns  Healthcare 27-5330-01 For purification of labeled antibodies
Safe seal brown 0.5 mL tubes Sarstedt 72,704,001 For labeled antibodies storage 
Nanodrop 1000 spectrophotometer Thermo Scientific To quantify antibody concentration and labeling efficiency
3 µm pore size polycarbonate 47 mm diameter filter Millipore TMTP04700 To concentrate cells
1 M Trizma hydrochloride solution pH 8 Sigma-Aldrich  T3038 For TBSTRR preparation; to block slides
Sodium chloride Sigma-Aldrich  S7653 For TBSTRR preparation
20 µm nylon filters  Millipore NY2004700 For environmental extract preparation
10 - 12 mm filter holders Millipore SX0001300 For environmental extract preparation
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich  P8340 For environmental extract storage
1 M Trizma hydrochloride solution pH 9 Sigma-Aldrich  T2819 To block slides
Heidolph Duomax 1030 rocking platform shaker VWR To block slides; for incubation processes 
VWR Galaxy miniarray microcentrifuge VWR C1403-VWR To dry slides
Multi-Well microarray hybridization cassette Arrayit corporation AHC1X24 Cassette for 24 assays per slide
GenePix 4100A microarray scanner  Molecular Devices Scanner for fluorescence
GenePix Pro Software Molecular Devices Software for image analysis and quantification

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Simis, S. G. H., Peters, S. W. M., Gons, H. J. Remote sensing of the cyanobacterial pigment phycocianin in turbid inland water. Limnol. Oceanogr. 50 (1), 237-245 (2005).
  2. Zamyadi, A., McQuaid, N., Prevost, M., Dorner, S. Monitoring of potentially toxic cyanobacteria using an online multi-probe in drinking water sources. J. Environ. Monit. 14, 579-588 (2012).
  3. Msagati, T. A. M., Siame, B. A., Shushu, D. D. Evaluation of methods for the isolation, detection and quantification of cyanobacterial hepatotoxins. Aquat. Toxicol. 78 (4), 382-397 (2006).
  4. Weller, M. G. Immunoassays and biosensors for the detection of cyanobacterial toxins in water. Sensors. 13 (11), 15085-15112 (2013).
  5. Baker, J. A., Neilan, B. A., Entsch, B., McKay, D. B. Identification of cyanobacteria and their toxigenicity in environmental samples by rapid molecular analysis. Environ. Toxicol. 16 (6), 472-482 (2001).
  6. Li, H., Singh, A. K., McIntyre, L. M., Sherman, L. A. Differential gene expression in response to hydrogen peroxide and the putative PerR regulon of Synechocystis sp. Strain PCC 6803. J. Bacteriol. 186 (11), 3331-3345 (2004).
  7. Anderson, D. M., Cembella, A. D., Hallegraeff, G. M. Progress in understanding harmful algal blooms: paradigm shifts and new technologies for research, monitoring, and management. Ann. Rev. Mar. Sci. 4, 143-176 (2012).
  8. Dittami, S. M., Pazos, Y., Laspra, M., Medlin, L. K. Microarray testing for the presence of toxic algae monitoring programme in Galicia (NW Spain). Environ. Sci. Pollut. Res. Int. 20, 6778-6793 (2013).
  9. Kegel, J. U., Del Amo,, Medlin, Y., K, L. Introduction to Project MIDTAL: its methods and samples from Arcachon Bay, France. Environ. Sci. Pollut. Res. Int. 20 (10), 6690-6704 (2013).
  10. Marcheggiani, S., et al. Detection of emerging and re-emerging pathogens in surface waters close to an urban area. Int. J. Environ. Res. Public Health. 12 (5), 5505-5527 (2015).
  11. Fernández-Calvo, P., Näke, C., Rivas, L. A., García-Villadangos, M., Gómez-Elvira, J., Parro, V. A multi-array competitive immunoassay for the detection of broad-range molecular size organic compounds relevant for astrobiology. Planet. Space Sci. 54 (815), 1612-1621 (2006).
  12. Parro, V. Antibody microarrays for environmental monitoring. Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg, Germany. 2699-2710 (2010).
  13. Fan, Z., Keum, Y. S., Li, Q. X., Shelver, W. L., Guo, L. H. Sensitive immunoassay detection of multiple environmental chemicals on protein microarrays using DNA/dye conjugate as a fluorescent label. J. Environ. Monit. 14 (5), 1345-1352 (2012).
  14. Rivas, L. A., García-Villadangos, M., Moreno-Paz, M., Patricia Cruz-Gil, P., Gómez-Elvira, J., Parro, V. A 200-Antibody microarray biochip for environmental monitoring: Searching for universal microbial biomarkers through immunoprofiling. Anal. Chem. 80 (21), 7970-7979 (2008).
  15. Delehanty, J. B., Ligler, F. S. A microarray immunoassay for simultaneous detection of proteins and bacteria. Anal. Chem. 74 (21), 5681-5687 (2002).
  16. Ligler, F. S., Taitt, C. R., Shriver-Lake, L. C., Sapsford, K. E., Shubin, Y., Golden, J. P. Array biosensor for detection of toxins. Anal. Bioanal. Chem. 377 (3), 469-477 (2003).
  17. Rucker, V. C., Havenstrite, K. L., Herr, A. E. Antibody microarrays for native toxin detection. Anal. Biochem. 339 (2), 262-270 (2005).
  18. Kang, J., Kim, S., Kwon, Y. Antibody-based biosensors for environmental monitoring. Toxicol. Environ. Health. Sci. 1 (3), 145-150 (2009).
  19. Herranz, S., Marazuela, M. D., Moreno-Bondi, M. C. Automated portable array biosensor for multisample microcystin analysis in freshwater samples. Biosens. Bioelectron. 33 (1), 50-55 (2012).
  20. Shlyapnikov, Y., et al. Rapid simultaneous ultrasensitive immunodetection of five bacterial toxins. Anal. Chem. 84 (13), 5596-5603 (2012).
  21. Szkola, A., et al. Rapid and simultaneous detection of ricin, staphylococcal enterotoxin B and saxitoxin by chemiluminescence-based microarray immunoassay. Analyst. 139, 5885-5892 (2014).
  22. Blanco, Y., Quesada, A., Gallardo-Carreño, I., Jacobo Aguirre,, Parro, J., V, CYANOCHIP: An antibody microarray for high-taxonomical-resolution cyanobacterial monitoring. Environ. Sci. Technol. 49 (3), 1611-1620 (2015).
  23. Bradford, M. M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Anal. Chem. 72, 248-254 (1976).
  24. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193 (1), 265-275 (1951).
  25. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using Bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
  26. Rivas, L. A., Aguirre, J., Blanco, Y., González-Toril, E., Parro, V. Graph-based deconvolution analysis of multiplex sandwich microarray immunoassays: applications for environmental monitoring. Environ. Microbiol. 13 (6), 1421-1432 (2011).
  27. Blanco, Y., et al. Deciphering the prokaryotic community and metabolisms in south african deep-mine biofilms through antibody microarrays and graph theory. PloS One. 9 (2), e114180 (2014).
  28. Gas, F., Baus, B., Queré, J., Chapelle, A., Dreanno, C. Rapid detection and quantification of the marine toxic algae, Alexandrium minutum, using a super-paramagnetic immunochromatographic strip test. Talanta. 147, 581-589 (2016).
  29. Parro, V., et al. SOLID3: a multiplex antibody microarray-based optical sensor instrument for in situ life detection in planetary exploration. Astrobiology. 11, 15-28 (2011).
  30. McKay, C. P., et al. The Icebreaker Life Mission to Mars: a search for biomolecular evidence for life. Astrobiology. 13, 334-353 (2013).

Tags

Miljövetenskap cyanobakterier CYANOCHIP miljöövervakning antikropp microarray bärbara fluorescerande immun sötvatten reservoar övervakning
Experimentellt protokoll för att upptäcka<em&gt; Cyanobakterier</em&gt; I flytande och fasta prover med en antikropp microarray Chip
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Blanco, Y., Moreno-Paz, M., Parro,… More

Blanco, Y., Moreno-Paz, M., Parro, V. Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip. J. Vis. Exp. (120), e54994, doi:10.3791/54994 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter