Abstract
Il riscaldamento globale e l'eutrofizzazione fanno alcuni ecosistemi acquatici si comportano come veri bioreattori che innescano la crescita dei cianobatteri rapida e massiccia; questo ha conseguenze economiche rilevanti sulla salute e. Molti ceppi di cianobatteri sono produttori di tossine, e solo poche cellule sono necessarie per indurre un danno irreparabile per l'ambiente. Pertanto, le autorità d'acqua del corpo e le amministrazioni richiedono sistemi di allarme precoce rapidi ed efficienti che forniscono dati affidabili per supportare le loro decisioni preventivo o curativo. Questo manoscritto riporta un protocollo sperimentale per la rilevazione sul campo di ceppi di cianobatteri produttori di tossine utilizzando un chip microarray anticorpo con 17 anticorpi (Abs) con risoluzione tassonomica (CYANOCHIP). Qui, una fluorescente immunodosaggio a sandwich microarray multiplex (FSMI) per il monitoraggio simultaneo di 17 ceppi di cianobatteri frequente che fiorisce in ecosistemi d'acqua dolce, alcuni dei quali produttori di tossine, è descritto. Un microarray con multiple replicati identici (fino a 24) del CYANOCHIP fu stampata su un unico vetrino per testare contemporaneamente un numero simile di campioni. Campioni liquidi possono essere testati mediante incubazione diretta con gli anticorpi (Abs) o dopo concentrazione cellulare mediante filtrazione attraverso un filtro da 1 a 3 micron. campioni solidi, come sedimenti e rocce macinate, vengono prima omogeneizzati e dispersi da un ultrasonicatore portatile in un tampone di incubazione. Essi vengono filtrati (i 5 - 20 micron) per rimuovere il materiale grossolano, e il filtrato viene incubato con Abs. Immunoreazioni sono rivelati da una incubazione finale con una miscela di 17 Abs fluorescenza etichettati e vengono letti da un rivelatore a fluorescenza portatile. L'intero processo richiede circa 3 ore, la maggior parte corrispondente a due periodi di 1 h di incubazione. L'uscita è un'immagine, in cui punti luminosi corrispondono alla rilevazione positiva di marcatori cianobatteri.
Introduction
Il rilevamento e il monitoraggio dei microrganismi in complesse comunità microbiche naturali sono fondamentali in molti campi, tra cui la biomedicina, l'ecologia ambientale, e astrobiologia. I cianobatteri sono microrganismi procarioti ben noti per la loro capacità di formare fioriture (eccessiva proliferazione) delle cellule in acqua dolce. Essi sono onnipresenti, e molte specie sono in grado di produrre tossine, che porta non solo ad un potenziale rischio per la salute umana, ma anche ad un impatto ecologico. A questo proposito, è essenziale sviluppare metodi rapidi e sensibili per la diagnosi precoce di cianobatteri e / o loro tossine nel suolo e acqua. A questo scopo, una fluorescente immunodosaggio a sandwich microarray multiplex (FSMI) è stato sviluppato come strumento per gestori delle risorse idriche per aiutarli a prendere decisioni e, di conseguenza, nella realizzazione dei programmi di gestione dell'acqua corretta.
Una vasta gamma di metodi è stato sviluppato per rilevare e identificare cianocellule obacterial e cianotossine nel suolo e acqua, tra cui la microscopia ottica, la biologia molecolare e tecniche immunologiche. Questi metodi possono variare notevolmente nelle informazioni che forniscono. Tecniche microscopiche sono basate sulla morfologia cellulare e la rilevazione della fluorescenza in vivo da pigmenti cianobatteri, come phycocyanin o clorofilla a 1. Anche se sono metodi rapidi ed economici per il tempo reale e il monitoraggio frequente che a seconda del tipo e del numero di cianobatteri presenti in un campione, non danno informazioni sulla potenziale tossicità. Inoltre, essi richiedono un certo livello di esperienza, considerando che spesso è molto difficile distinguere tra specie strettamente collegate 2. Per superare queste limitazioni, la microscopia ottica deve essere accompagnata da entrambi i test di screening biologici e biochimici e metodi fisico-chimiche per l'identificazione e la quantificazione di cianotossine.
Metodi molecolari basati sono stati applicati per decenni per rilevare, identificare e quantificare cianobatteri e loro cianotossine corrispondenti grazie alle informazioni di sequenza pubblicata nelle banche dati del genoma (ad esempio, National Center for Biotechnology Information, NCBI). Tra questi metodi sono quelli basati sulla reazione a catena della polimerasi (PCR), che richiede la definizione di serie di primer per l'amplificazione del DNA e dipendono dalla precedente conoscenza della sequenza di DNA di diverse specie di cianobatteri. Mentre la rilevazione del gene, come l'operone phycocyanin, porta ad accurata identificazione a livello di genere, alcune specie o ceppi sono rilevati conquesto metodo. Tuttavia, geni della tossina codificanti, come quelle appartenenti alla operone microcystin, facilitare l'identificazione di tossine in campioni in cui i produttori sono scarsi 5. Tuttavia, la rilevazione dei marcatori tossina mediante PCR non implica necessariamente tossicità nell'ambiente. Inoltre, la serie di primer sviluppati per analizzare l'intera gamma di specie di cianobatteri produttori e tossiche presenti in un campione è ancora incompleta, e ulteriori studi deve essere fatto per identificare specie sconosciute. Altre tecniche molecolari sono non-PCR-based, come ibridazione in situ fluorescente (FISH) e DNA microarray.
Negli ultimi due decenni, la tecnologia microarray ha acquisito importanza in molti campi di applicazione, in particolare nel monitoraggio ambientale. DNA microarray consentono di discriminazione tra le specie e gli analiti 4, 6, 7 sup>, 8, 9, 10, ma sono considerati molto laborioso e richiede tempo compiti che coinvolgono più passaggi (ad esempio, prestazioni microarray, estrazione DNA, amplificazione PCR e ibridazione). Per questo motivo, meno saggi in termini di tempo basati su anticorpi, come panino e microarrays immunologici competitivi, sono diventati un metodo essenziale e affidabile ad alta produttività per la rilevazione di più analiti ambientali 11, 12, 13. La capacità degli anticorpi di riconoscere specificamente i loro composti target e rilevare piccole quantità di analiti e proteine, insieme alla possibilità di produrre anticorpi contro quasi ogni sostanza, rendono microarrays dell'anticorpo una tecnica potente per scopi ambientali. Inoltre, la capacità di realizzare analisi multiple comeassay ingle, con limiti di rilevazione vanno da ppb a ppm, è uno dei principali vantaggi di questo metodo 14.
Biosensori basati su anticorpi sono dimostrati strumenti sensibili e rapidi per la rilevazione di una vasta gamma di patogeni e tossine nel monitoraggio ambientale 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21. Mentre i metodi del DNA coinvolgono diversi passaggi, i microarray a base di anticorpi richiedono solo una piccola preparazione del campione che si basa principalmente su un gradino lisi breve in un buffer soluzione adeguata. Delehanty e Ligler 15 riportato la rilevazione simultanea di proteine e analiti batteriche in miscele complesse sulla base di un test immuno-anticorpi a sandwich in grado di rilevare una concentrazione proteica di 4 ppb und 10 4 cfu / ml di cellule. Szkola et al. 21 hanno sviluppato un buon mercato e affidabile multiplex microarray per la rilevazione simultanea di proteotoxins e piccoli tossine, composti che possono essere utilizzati nella guerra biologica. Essi rivelò concentrazioni di tossina ricina, con un limite di rilevamento di 3 ppb, in meno di 20 min. Recentemente, la CYANOCHIP, un biosensore basato microarray anticorpi per il rilevamento in situ di cianobatteri tossici e non tossico, è stato descritto 22. Questo microarray consente l'identificazione di potenziali fioriture di cianobatteri, soprattutto in ambienti acquatici, che sono difficili da identificare microscopicamente. Il limite di rilevazione del microarray è di 10 marzo 2-10 cellule per la maggior parte delle specie, trasformando questo biosensore in uno strumento conveniente per il rilevamento e l'identificazione multiplex di cianobatteri, anche a livello di specie. Tutte queste caratteristiche rendono il Antibotecnica microarray dy, e in particolare il metodo presentato in questo lavoro, un metodo rapido e più semplice rispetto alle tecniche citate.
Questo lavoro presenta due esempi di esperimenti che utilizzano un biosensore microarray anticorpi per rilevare la presenza di cianobatteri in campioni di suolo e acqua. Si tratta di un metodo semplice ed affidabile basato su un formato di immunodosaggio a sandwich che richiede volumi di campioni molto piccoli e preparazione del campione molto semplice. Il metodo richiede poco tempo e può essere facilmente eseguita nel campo.
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Protocol
1. Preparazione di immunogeni
- Grow ciascun ceppo cianobatteri nel mezzo di coltura corrispondente alle condizioni descritte nella Tabella 1.
NOTA: terreno di coltura e cultura condizioni per ogni ceppo cianobatteri sono elencati nella tabella 1. Tutti i ceppi di cianobatteri, con l'eccezione di K17, appartengono al gruppo di Antonio Quesada da Autonoma University (Madrid, Spagna). L'anticorpo contro Planktothrix rubescens è stata generata da un campione naturale della fioritura monospecifico di questo cianobatterio da Vilasouto serbatoio (nord della Spagna). - Quantificare il numero di celle utilizzando una camera di conteggio delle cellule mediante microscopia ottica per ottenere circa 10 8 cellule / mL da una coltura fase di crescita esponenziale o stazionarie ritardo.
- Celle di raccolta da 5 ml di coltura per centrifugazione a 2.000 xg per 5 min.
- Eliminare il surnatante e risospendere le cellule in una vasca da 10 mle con 5 ml di 1x PBS (1x PBS) per ottenere circa 10 8 cellule / mL.
- Mescolare e lisare le cellule della sospensione mediante sonicazione per 5 cicli, 30 s ciascuno, con un 30 a 60 s di pausa sul ghiaccio, utilizzando un portatile, palmare processore ultrasuoni o immergendo la provetta a bagnomaria di un distruttore cellulare alla massima ampiezza (30 kHz).
- Ripetere i passaggi 1,3-1,5 per ogni ceppo di cianobatterio.
NOTA: sonicazione produce rottura delle cellule e il rilascio contenuto cellulare. Mentre proteine e polisaccaridi sono buoni immunogeni, molecole specifiche, come i lipidi e acidi nucleici, non indurre una risposta immunogenica umorale da soli. Pertanto, essi devono legarsi ai vettori, quali polisaccaridi o proteine, per aumentare la complessità molecolare. Inoltre, sonicazione rilascia materiale intracellulare che possono innescare la produzione di anticorpi.
2. La produzione di anticorpi policlonali
- Preparare la prima immDose unogen miscelando 0,5 ml di lisato cellulare ultrasonicated ottenuto allo stadio 1.5 con 0,5 mL di adiuvante completo di Freund. Consegnarlo per il gestore di un impianto di animali per la produzione di anticorpi policlonali di coniglio.
- Preparare altre tre dosi come prima ulteriormente utilizzato come aumenta memoria nel processo di produzione di anticorpi miscelando 0,5 mL dello stesso omogenato / lisato ottenuto allo stadio 1.5 con 0,5 ml di adiuvante incompleto di Freund. li darà al stabulario per soddisfare il processo di produzione di anticorpi.
- Ripetere i punti 2.1 e 2.2 per ogni nuovo processo di produzione di anticorpi.
NOTA: normalmente, la produzione di anticorpi è affidata a strutture specializzate di animali o aziende, a causa delle licenze e la formazione adeguata sono tenuti a lavorare con gli animali. Le aziende forniscono una misura relativa enzimatico test immunoenzimatico (ELISA) della quantità di anticorpi antigene-specifici presenti nel campione di siero.
3. Anticorpo Purificazione
- Purificare il G (IgG) Frazione di immunoglobulina sia dal immunitario e il siero pre-immune raccolte nel passaggio 2 dalla proteina-A cromatografia di affinità. Alcuni kit di purificazione commerciali, sulla base di sistemi a cartuccia, funzionano bene; seguire le istruzioni del fornitore.
- Quando il kit di purificazione non fornisce un sistema di desalificazione, modificare il buffer dopo l'eluizione degli anticorpi purificati per 0.1x PBS, mediante dialisi o mediante dispositivi di filtro centrifugo con 100-kDa (o inferiore) dimensione dei pori della membrana.
- Determinare la concentrazione dell'anticorpo misurando l'assorbanza a 280 nm o utilizzando metodi colorimetrici, come Bradford 23, Lowry 24, o acido bicinconinico (BCA) 25.
NOTA: È importante evitare compresi i gruppi amminici del tampone di eluizione (es buffer Tris) perché competono con l'anticorpo per il legame a superfici solide attivati con gruppi epossidici. dopo purification, è importante per testare l'attività anticorpale con ELISA.
4. fluorescenza anticorpi etichettatura
- Etichettare gli anticorpi purificati ottenuti nella sezione 3 con un fluorocromo (ad esempio, un colorante fluorescente rosso lontano) sciogliendo una fiala commerciale contenente colorante per l'etichettatura 1 mg di proteina in 100 ml di dimetilsolfossido (DMSO). Aggiungere 2 ml di colorante disciolto per ogni preparazione di anticorpi ad una concentrazione di 2 mg / ml in un volume finale di 50 microlitri in 50 mM tampone fosfato salino (pH 8,5).
- Mantenere le reazioni di marcatura sotto continua agitazione per 1 ora a temperatura ambiente e 1.200 rpm su una piattaforma vibrante.
- Purificare gli anticorpi marcati per dimensione cromatografia di esclusione (ad esempio, utilizzando un gel con un range di frazionamento tra 1,5 e 30 kDa intrappolati in una colonna), seguendo le raccomandazioni del fornitore.
- Misurare l'assorbanza a 280 nm ed a 650 nm in eluati e calcolare la labeefficienze ling seguenti raccomandazioni del fornitore.
NOTA: fino a 50 x 50 ml reazioni anticorpo-etichettatura può essere fatto con un singolo flaconcino di colorante fluorescente per l'etichettatura 1 mg di proteina. Si raccomanda di coprire le provette con foglio di alluminio o, in alternativa, di utilizzare tubi opachi 0,5 mL di evitare processi di tempra dopo passo 4.3. Per gli anticorpi IgG, etichettatura ottimale si ottiene con 3-7 moli di colorante per mole di anticorpo.
5. CYANOCHIP Produzione
- Anticorpi e controlli in soluzione di stampa
- Preparare 30 ml di ogni anticorpo purificato in soluzione di stampa mescolando ciascun anticorpo a 1 mg / ml in un buffer di stampa commerciale proteina 1x con 0,01% (v / v) Tween 20 (un detergente non ionico), tutto come concentrazioni finali.
NOTA: In alternativa, una soluzione di anticorpo può contenere 20% glicerolo, 1% (w / v) di saccarosio (o trealosio, come conservante), e 0,01% (v / v) Tween 20 in tampone carbonato (pH 8,5). - Preparare 30 microlitri della soluzione di stampa come controlli: (a) buffer di stampa 1x proteina con 0,01% (v / v) Tween 20, (b) la proteina-A purificata di siero pre-immune a 1 mg / ml in 1x tampone di stampa proteina con 0,01% (v / v) Tween 20, e (c) di albumina di siero bovino (BSA) a 1 mg / ml in 1x tampone di stampa proteina con 0,01% (v / v) Tween 20.
- Preparare 30 ml di una fluorescente, purificato siero pre-immune a diverse concentrazioni (ad esempio da 50 mg / ml a 1 mg / ml) in 1x tampone di stampa proteina con Tween 20, come nel passaggio 5.1.1. Questi campioni saranno utilizzati come marcatori fluorescenti telaio e per il parente la quantificazione della fluorescenza dopo aver individuato.
- Aggiungere 30 ml per pozzetto delle soluzioni di stampa preparato negli stadi 5.1.1, 5.1.2 e 5.1.3, per la più alta qualità 384 pozzetti per la produzione di microarray, come il polipropilene.
NOTA: tampone stampa proteina aumenta la qualità e la stabilità degli anticorpi e Tween 20 omogeneizza posto morphology e si accumula accoppiamento proteine up. Si raccomanda di mantenere la micropiastra 384 pozzetti a 4 ° C prima dell'uso. Conservarlo a -20 ° C per lunghi periodi di tempo. Il polipropilene ha una bassa DNA, proteine, estratto cellulare, e piccola molecola intrinseca vincolante.
- Preparare 30 ml di ogni anticorpo purificato in soluzione di stampa mescolando ciascun anticorpo a 1 mg / ml in un buffer di stampa commerciale proteina 1x con 0,01% (v / v) Tween 20 (un detergente non ionico), tutto come concentrazioni finali.
- Stampa anticorpi su un vetrino da microscopio
NOTA: Stampa gli anticorpi su vetrini da microscopio attivati utilizzando piattaforme di array diversi, come il contatto, split-ago, o dispositivi senza contatto, quali stampanti piezoelettriche o tecnologie "getto d'inchiostro". In questo lavoro, il CYANOCHIP è stato regolarmente stampato da contatto utilizzando un sistema robotizzato (Arrayer) in grado di individuare quantità nL degli anticorpi alla scala micron.- Impostare le condizioni ambientali del locale di stampa a 20 ° C e 40 - 50% di umidità relativa.
- Impostare i substrati di scorrimento (ad esempio, 75- x 25 mm vetrini da microscopio epossidica-attivato) per eseguire diverse identico anticorpo arrays su ogni diapositiva.
- Spot ogni anticorpo purificato, compresi i controlli e il quadro di riferimento, in un modello di punto triplice copia; in queste condizioni, le macchie sono 180 - 200 micron di diametro.
- Dopo la stampa, lasciare i vetrini per almeno 30 minuti a temperatura ambiente per lasciarli asciugare, e poi conservarli a 4 ° C; per lavorare sul campo, i vetrini possono essere trasportati e conservati a temperatura ambiente per parecchi mesi.
NOTA: Il CYANOCHIP è stampata in un formato di punto microarray triplice copia con 3 x 8 microarray identici per vetrino o 9 matrici identiche in un formato microarray 1 x 9. Ogni formato matrice non deve essere superiore alle dimensioni della camera di reazione per un 24-pozzetti guarnizione (solitamente 7,5 x 6.5 mm di una camera di ibridazione 3 x 8). - Prima di utilizzare il microarray per analizzare campioni ambientali, utilizzare FSMI per determinare la diluizione di lavoro per ogni anticorpo in una curva di titolazione. Per ogni anticorpo, utilizzare una concentrazione standard della imm corrispondenteunogen (10 Aprile 03-10 cellule / ml) e diluizioni seriali del immunofluorescenza (tra 1: 500 e 1: 32.000). La concentrazione ottimale di anticorpi corrisponde al 50% della massima intensità segnale ottenuto nella curva di titolazione. Inoltre, la sensibilità e la specificità per ciascun anticorpo deve essere determinato, come descritto in Blanco et al. 22.
6. Preparazione del ambientali multianalita Estratti per immunodosaggio Sandwich fluorescente microarray (FSMI)
- Estratto multianalita da un campione di liquido
- Prendere 1 - 100 ml del campione liquido con una siringa sterile (ad esempio, l'acqua dalla riva di un serbatoio d'acqua); la quantità di campione è fortemente dipendente dal potenziale concentrazione dei bersagli.
- Concentrare le cellule facendo passare il campione di acqua attraverso una dimensione dei pori di 3 um, 47 mm di diametro filtro in policarbonato; una concentrazione cellularetra il 10 3 - 10 8 celle / mL è desiderabile per il rilevamento positivo, ma la concentrazione effettiva è sconosciuta.
- Recupero biomassa raccolta nel filtro con 1 mL di una soluzione salina tamponata con Tris modificato, Tween 20 rinforzato tampone (TBSTRR; 0,4 M Tris-HCl (pH 8), 0.3 M NaCl e 0,1% Tween 20) raschiando con una spatola in un tubo da 15 ml.
- Mescolare e disaggregare utilizzando un processore ad ultrasuoni portatile, come descritto al punto 1.5, o semplicemente pipettando su e giù più volte; Questo prepara il campione per analisi microarray.
- Estratto multianalita da un campione solido
- Pesare fino a 0,5 g del campione solido (ad esempio, roccia, suolo, o sedimenti) in un tubo da 10 ml e aggiungere fino a 2 ml di TBSTRR.
- Sonicare immergendo sonda del sonicatore nel tubo, immergendo il tubo in bagnomaria di un potente corno sonicatore, oppure utilizzando un sonicatore a mano. Effettuare almeno 5 x 30-scicli a 30 kHz, fermandosi per 30 s mentre sul ghiaccio.
- Filtro per rimuovere sabbia, argilla, e altro materiale grossolano con una siringa da 10 ml accoppiato ad un diametro 10 ai 12 mm, da 5 a 20 micron titolare dimensione dei pori del filtro di nylon. Premere il campione attraverso il filtro in una provetta da 1,5 mL. Se i filtri saturi, agitare la sospensione nella siringa e portarlo ad uno nuovo; Questo prepara il materiale filtrato per la immunologico (punto 7).
NOTA: La capacità tampone TBSTRR dipende dal tipo di campione. È importante effettuare immunodosaggio immediatamente dopo la preparazione dell'estratto ambientale per evitare l'effetto di degradazione enzimatica sulle analiti. In alternativa, aggiungere inibitori della proteasi nel estratto ambientale e congelare a -80 ° C fino alla fase successiva.
7. Sandwich microarray fluorescente Immunoassay (FSMI)
- Bloccando il CYANOCHIP
NOTA: Immediatamente prima dell'uso, trattare il pTAMPATO scivola per bloccare tutti i gruppi epossidici liberi sul vetrino e per rimuovere l'eccesso di anticorpi non legati covalentemente.- Immergere il microarray in 0,5 M Tris-HCl (pH 9) con 5% (w / v) di BSA su una superficie pulita (ad esempio, capsula Petri o un tubo da 50 ml) con blanda agitazione da una piattaforma bilanciere per 5 min. In alternativa, fissare la slitta giù su un 100- a 200 microlitri goccia della soluzione di cui sopra con le macchie microarray fronte. Lasciare agire per 3-5 minuti e poi procedere.
- prendere con cautela il vetrino con pinze con punta di plastica; cercare di evitare le zone microarray toccare. Eliminare l'eccesso di liquido battendo dolcemente il vetrino su un tovagliolo di carta. Immergerlo in 0,5 M Tris-HCl (pH 8) con il 2% (w / v) di BSA per 30 minuti con blanda agitazione da una piattaforma rocker.
- Essiccare la diapositiva eseguendo una breve centrifugazione (200 - 300 xgea per 1 min) usando una microcentrifuga commerciale adatto per vetrini da microscopio. In alternativa, asciugare la diapositiva dolcemente battendo ontOA tovagliolo di carta.
- L'incubazione dell'estratto del campione multianalita con microarray
- Impostare la diapositiva in una cassetta microarray ibridazione commerciale con 24 pozzi per più microarray; seguire le istruzioni del fornitore.
- Dopo scivolo e cassette assemblaggio, pipetta fino a 50 microlitri dell'estratto del campione o diluizione in TBSTRR in ciascun pozzetto della cassetta.
- Ripetere il passaggio 7.2.2 per ciascun campione da analizzare.
- Come controllo vuoto, pipetta 50 ml di tampone TBSTRR in almeno due pozzetti separati della cassetta.
- Incubare a temperatura ambiente per 1 h con miscelazione pipettando ogni 15 min oppure lasciando sotto agitazione lieve. In alternativa, incubare per 12 ore a 4 ° C.
NOTA: utilizzare altre guarnizioni incubazione in funzione del modello di microarray. Il tempo e la temperatura di incubazione nel passaggio 7.2.5 sono parametri empirici che normalmente dipendono dal affinità e ki vincolantenetics di ogni appaiati antigene-anticorpo.
- Lavaggio
- Rimuovere i campioni mettendo la cassetta verso il basso e con attenzione battendolo su un foglio pulito, assorbente.
- Lavare i pozzetti aggiungendo 150 ml di TBSTRR a ciascuno, ed eliminare il buffer, come sopra.
- Ripetere il punto 7.3.2 altre tre volte.
- L'incubazione con anticorpi fluorescenti rivelatore
- Aggiungere 50 ml di una miscela di anticorpi contenente 17 anticorpi anti-cianobatterico-deformazione, ciascuna etichettata con fluorocromo in TBSTRR con 1% (w / v) BSA. Determinare la concentrazione di ogni anticorpo fluorescente nella miscela (dai 0,7 al 2 mg / ml) effettuando esperimenti di titolazione di ogni coppia antigene / anticorpo 22.
- Incubare per 1 ora a temperatura ambiente, come descritto nel passaggio 7.2.5, o per 12 ore a 4 ° C.
- Lavare le anticorpi fluorescenti </ Strong>
- Rimuovere gli anticorpi non legati fluorescenti, come al punto 7.3.
- Smontare la cassetta e immergere il vetrino in 0.1x PBS (ad esempio, in un tubo da 50 ml) per un rapido risciacquo.
- Asciugare il vetrino come al punto 7.1.3.
8. Scansione per fluorescenza
- Scansione il vetrino per la fluorescenza al massimo del picco di fluorescenza di emissione di colorante fluorescente rosso lontano in uno scanner per la fluorescenza. Prendere diverse immagini dei microarray a differenti parametri di scansione, generalmente abbassando il valore di guadagno laser.
Nota: evitare macchie saturi (> 65.000 conteggi fluorescenza) -Sono fuori scala e può introdurre errori di quantificazione.
9. Elaborazione delle immagini e analisi dei dati
- Utilizzare un software commerciale per l'analisi delle immagini e quantificazione; il software fornisce misurazioni dell'intensità di fluorescenza (FI; mediana o medio di tutti i pixel da un singolo spot) per l'epunto ach di tutto il microarray. Sottrarre il fondo locale intorno alle macchie: FI = punto FI - FI sfondo locale.
- Salvare i dati FI e aprirli con un programma di foglio di calcolo.
- Utilizzare i valori ottenuti per gli array vuoti come controllo negativo per individuare e scartare i falsi positivi. Applicare la seguente equazione per calcolare la FI per ogni posto di anticorpi: FI = (campione FI - FI vuoto), dove FI campione = posto FI - FI fondo locale nei microarray eseguito con estratti dei campioni e FI vuoto = posto FI - FI sfondo locali nei microarray vuote.
- Applicare una soglia ulteriore cut-off di 2- a 3 volte la media del FI dell'intero microarray per minimizzare la probabilità di falsi positivi; questo è particolarmente rilevante per le immagini di microarray di scarsa qualità e basso rapporto segnale-rumore.
- Creare trame e / o eseguire ulteriori analisi se necessario.
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Representative Results
Questo lavoro descrive un test immunologico multiplex per l'identificazione simultanea delle più importanti specie di cianobatteri acqua dolce (Tabella 1) utilizzando il microarray anticorpi CYANOCHIP. Il microarray può essere un formato 3 x 8 microarray stampati su vetrini da microscopio. Ogni microarray è costituito da un insieme di 17 anticorpi stampate in un modello punto triplo, loro corrispondenti anticorpi pre-immuni e BSA come controlli negativi. I microarray includono anche un telaio fluorescente, utilizzando un anticorpo pre-immune fluorescente di localizzare facilmente il modello microarray 22 (Figura 1).
Il microarray è stato testato in campo per il in situ analisi dei campioni di acqua prelevati presso la riva d'acqua dolce Lozoya Reservoir, che fornisce la città di Madrid. I campioni sono stati trattati come descritto sopra, eprincipali immunoreazioni positivi corrispondevano agli anticorpi di cianobatteri planctonici, come Microcystis spp. (K4 e K5), e per bentonici Oscillatoriales, come ad esempio Leptolyngbya spp. (K10 e K15). Segnali di fluorescenza bassi sono stati ottenuti da Nostocales (K6 e K12, due planctonici Aphanizomenon spp.), Bentonici Rivularia sp. (K8), Anabaena sp. (K1), e planctonici Microcystis flos-aquae sp. (K3). osservazioni al microscopio ottico (non mostrato) hanno mostrato una variegata comunità di cianobatteri all'interno abbondanti detriti terrigeno dalla riva. Diverse specie di Anabaena dominato la comunità, ma Microcystis spp. e Pseudanabaena spp. erano anche presenti.
Inoltre, il microarray è stata convalidata anche testando una secca, quasi 1.000 anni mat microbica raccolti nel McMurdo Ice Shelf in Antartide per verificare la presenza di cianobatteri markers. La figura 1 mostra altamente fluorescenti, reazioni positive in anticorpi prodotti per bentonici cianobatteri isolata da altri tappetini antartiche, tra cui Anabaena sp. e Leptolyngbya spp. (K14 e K15, rispettivamente). Ulteriori immunoreazioni positivi sono stati rilevati con anticorpi anti cianobatteri planctonici, come Microcystis spp. (K4 e K5), Aphanizomenon spp. (K6 e K12), e Planktothrix rubescens sp. (K17). Segnali bassi sono stati ottenuti da anticorpi verso altre specie bentoniche isolati in un tappetino Antartico, tra cui Tolypothrix sp. (K16) e Anabaena sp. (K1). Microscopia ottica fluorescente rivelato la presenza di cellule strutturalmente simili ai cianobatteri e alghe verdi (non mostrato). Non sono stati identificati cianobatteri filamentosi. Tuttavia, sono state rilevate molteplici strutture fluorescenti amorfe di circa 1 micron di dimensione e copiosa di fluorescenza diffusa, WHIch potrebbe essere attribuita alla presenza di resti cellulari (rotto e cellule morte) e sostanze polimeriche extracellulari (EPS), rispettivamente. Di conseguenza, l'analisi biochimica ha mostrato che il tappetino consisteva in quantità abbondanti di biopolimeri e resti cellulari (materiale biologico complesso) che potrebbero essere gli obiettivi per gli anticorpi del microarray.
Figura 1: rapido e affidabile Multiplex microarray immunologico per la rilevazione di cianobatteri. A) Schema che mostra le fasi principali della FSMI per l'analisi di campioni multi-target con un CYANOCHIP. B) Schema di un modello di layout di stampa (dal triplice copia) della collezione anticorpo anti-cianobatteri: (0) BSA, albumina di siero bovino; (X) solo la stampa del buffer; (1-17) ciascuno degli anticorpi, come nella Tabella 1 in BLanco et al. 2015 (K1 a K17). Da P1 a P17, corrispondenti anticorpi pre-immuni agiscono come controlli. I rettangoli gialli corrispondono ad un gradiente posto fluorescente come riferimento fotogramma. C e D) Immagine che mostra la parte superiore di un 1.000-year-old mat microbica secco dalla McMurdo Ice Shelf (Antartide) e l'immagine CYANOCHIP rilevazione cianobatteri in questa stuoia, rispettivamente. E) Vista panoramica del Lozoya Reservoir mostrando acqua trasparente senza particelle verdi visibili al momento del campionamento. Immagine microarray dopo l'analisi in situ di campione F) (modificato da riferimento 22).
| codice Ab | Immunogeno (ceppo) | Ordine | Habitat | | condizioni di coltura | |
| K1 | Anabaena sp. | Nostocales | Sconosciuto | BG11 e nitrato | 30 ° C, luce continua |
| K2 | Anabaena sp. | Nostocales | Sconosciuto | BG11o | 30 ° C, luce continua |
| K3 | Microcystis flos-aquae | Chroococcales | planctonici | BG11 | 28 ° C, luce continua |
| K4 | Microcystis novacekii | Chroococcales | planctonici | BG11 | 28 ° C, luce continua |
| K5 | Microcystis aeruginosa | Chroococcales | planctonici | BG11 | 28 ° C, luce continua |
| K6 | Aphanizomenon ovalisporum | Nostocales | planctonici | BG11o | 28 ° C, luce continua |
| K7 | Phormidium sp. | Oscillatoriales | bentonici | BG11 | 18 ºC, 16-8 fotoperiodo |
| K8 | Rivularia sp. | Nostocales | bentonici | CHU-D | 18 ºC, 16-8 fotoperiodo |
| K9 | Chamaesiphon sp. | Chroococcales | bentonici | BG11 | 18 ºC, 16-8 fotoperiodo |
| K10 | Leptolyngbya Boryana | Oscillatoriales | bentonici | BG11 | 18 ºC, 16-8 fotoperiodo |
| K11 | Tolypothrix distorta | Nostocales | bentonici | BG11o | 18 ºC, 16-8 fotoperiodo |
| K12 | aphanizomenoides Aphanizomenon | Nostocales | planctonici | BG11o | 28 ° C, luce continua |
| K13 | Nostoc sp. (Antartide) | Nostocales | bentonici | BG11o | 13 ° C, 16-8 fotoperiodo |
| K14 | Anabaena sp. | Nostocales | bentonici | BG11o | 13 ° C, 16-8 fotoperiodo |
| K15 | Leptolyngbya sp. | Oscillatoriales | bentonici | BG11 | 13 ° C, 16-8 fotoperiodo |
| K16 | Tolypothrix sp. | Nostocales | bentonici | BG11 | 13 ° C, 16-8 fotoperiodo |
| K17 | Planktothrix rubescens | Oscillatoriales | planktonic | nessuna | nessuna |
Tabella 1. Elenco degli anticorpi (ABS) e le cianobatteri ceppi utilizzati per produrre il CYANOCHIP 22.
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Discussion
Qui, un multiplex a fluorescenza immunodosaggio a sandwich con il CYANOCHIP, un microarray 17-anticorpo per il rilevamento e l'identificazione di una vasta gamma di generi cianobatteri, è descritto 22. Questi cianobatteri rappresentano i generi bentonici e planctonici più frequente in habitat d'acqua dolce, alcuni dei quali produttori di tossine che sono. Recentemente, il formato a sandwich immunoassay fluorescente è stato usato per identificare i microrganismi e / o bioanalytes in applicazioni ambientali 26, 27, 28. Il protocollo si basa principalmente su due fasi: (i) immobilizzanti o catturare gli anticorpi di legarsi specificamente analiti da un campione di prova e (ii) la rilevazione coppie analita-anticorpo utilizzando anticorpi fluorescente (traccianti o rivelatore anticorpi). Poiché il saggio a sandwich richiede almeno due di legame anticorpali siti accessibili (epitopi) in dell'analita perla reazione abbia luogo, qualsiasi segnale fluorescente positivo indica la presenza di relativamente grandi e complessi oligo o multimerici analiti che sono identici o molto simili a quelli usati per produrre gli anticorpi di cattura.
Anche se questo metodo richiede volumi ridotti e la preparazione dei campioni di base, senza la necessità di competenze o conoscenze particolari, diversi inconvenienti potrebbero rovinare il test. segnali fluorescenti a basso o una completa mancanza di ciò può essere dovuto alla scarsa depurazione anticorpo o scarsa efficienza di etichettatura. Per l'isolamento di IgG di coniglio, proteina A è la scelta migliore, perché si lega specificamente con alta efficienza per la regione Fc delle immunoglobuline. Come indicato nella sezione 4, devono essere utilizzati gli anticorpi fluorescenti con una gamma di etichettatura tra 3-7 moli di colorante per mole di anticorpi. Inoltre, la mancanza di macchie fluorescenti può essere spiegato dalla concentrazione di analiti trovano sotto i limiti di rilevamento. In questo caso, il campione può essere concentrated prima incubazione con il microarray, o quantità maggiori può essere utilizzato per un nuovo estrazione. sfondi fluorescenti alti sono il risultato di inefficienti blocco chip o / e fasi di lavaggio e di estratti di campioni composti di minerali e materia organica complessa che sporgono sul chip. Quando i campioni complessi sono usati come analiti, è desiderabile aumentare il sale e / o la concentrazione di detersivo per favorire l'interazione specifica tra coppie analita-anticorpo.
Negli ultimi anni, la tecnologia degli anticorpi microarray è stata sviluppata per applicazioni ambientali. Tuttavia, l'uso di questa tecnica non comporta alcune limitazioni. Gli anticorpi policlonali sono più veloci e meno costosi da produrre e, soprattutto, la possibilità di legare qualsiasi epitopo bersaglio in un campione ambientale complesso sono teoricamente superiore con anticorpi monoclonali. Tuttavia, il fatto che essi possano riconoscere epitopi diversi aumenta il numero di reazioni incrociate in FSMI. Per guadagnare alta specificità, l'uso di metodi di districare questi eventi cross-reattività delle vere reazioni antigene-anticorpo cognate utilizzando metodi di deconvoluzione 26, 27, per esempio, è altamente desiderabile. Fondamentalmente, il microarray è considerato un biosensore per la determinazione qualitativa multiplo e classificazione dei cianobatteri. A questo proposito, è essenziale per determinare il limite di rilevamento per ciascun anticorpo uno ad uno da usare loro concentrazioni ottimali di lavoro nel saggio. Sebbene questo microarray, insieme con FSMI, non è concepito come un metodo quantitativo, il biosensore implica alta sensibilità, perché il limite inferiore di rilevazione di più degli anticorpi contenuti nel CYANOCHIP 22 è da 10 2 a 10 3 cellule / mL.
Nonostante queste limitazioni, questa metodologia presenta diversi vantaggi contro altre tecniche usate in m ambientaleONITORAGGIO. Anticorpo-biosensori permettono la possibilità di riconoscere molecole diverse simultaneamente in una singola analisi, la possibilità di rilevare basse concentrazioni di analiti, e la possibilità di produrre anticorpi contro quasi qualsiasi sostanza. Inoltre, il microarray può raggiungere fino a 24 analisi in un singolo test, con limiti di rilevamento da 10 2 cellule / ml. In confronto con altri metodi, gli anticorpi possono rilevare le cellule vivi o morti, materiale extracellulare, e detriti cellulari. Sebbene ci vogliono almeno 4 ore per completare l'intero test, è più veloce rispetto ad altri metodi analitici applicati al monitoraggio ambientale. Il CYANOCHIP è stato originariamente concepito per l'identificazione dei ceppi di cianobatteri. Questo biosensore non è stato progettato formalmente a tale scopo, in modo che possa identificare potenziali produttori di tossine e potrebbe essere migliorato in futuro, con l'aggiunta di anticorpi contro una vasta gamma di nuovi ceppi. saggi biochimici, come ad esempio ELISA, PPIA, e neurochimicitest nei topi, permettono l'identificazione di cianotossine, ma si sono limitate a un paio di tossine conosciute e possono dare falsi positivi. Inoltre, utilizzando il CYANOCHIP non richiede una formazione specifica, mentre la microscopia ottica e mouse saggi biologici richiedono personale qualificato o di lavoro ad alta intensità di manodopera con animali vivi, e che non danno informazioni sul tipo di tossine presenti in un campione. Cianotossine possono anche essere identificati e quantificati con altri metodi analitici, come HPLC, GC-MS, o MALDI-TOF. In questi metodi, il campione deve essere purificato, e la mancanza di standard di riferimento limita l'identificazione di cianotossine. Inoltre, i metodi analitici richiedono attrezzature e forniture costose e formazione specializzata. Metodi molecolari sono basate su estrazione del DNA dai campioni, mentre FSMI richiede solo un estratto ambientale redatto in un paio di passi molto semplici, senza purificazione cianobatteri.
Le elevate prestazioni del CYANOCHIP peril rilevamento in situ di cianobatteri in serbatoi d'acqua dolce lo rende un nuovo strumento per il tempestivo del amministratori acqua. Inoltre, il microarray è interessante anche per il campo di astrobiologia, particolarmente per la ricerca di marcatori microbici come prova della vita. Lo studio di estremofili può aiutarci a comprendere l'origine della vita sulla Terra e come la vita potrebbe sopravvivere in ambienti estremi presenti nel nostro sistema solare e oltre. Come diversi ambienti della Terra sono molto simili a posti su altri pianeti, come Marte, potrebbe essere possibile trovare resti di procarioti fotosintetici come prove della vita estinta. Il microarray è stato in grado di identificare i marcatori di cianobatteri da vivente o non vivente cellule; dalla popolazione rimane e / o materiale extracellulare in vecchi tappeti microbici (Figura 1); e da acqua, suolo e rocce raccolti in ambienti estremi, come l'Antartide, Atacama, i laghi andini, l'Alto Artico, o laArea Rio Tinto in Spagna (non mostrato). Considerando che cianobatteri sono i microorganismi primordiali sulla Terra, non vi è ragione di credere che essi potrebbero una volta hanno vissuto su altri pianeti.
In conclusione, il fatto che CYANOCHIP-FSMI può identificare dei marker di cianobatteri in situ e può anche associarli a diversi filotipi o gruppi, e che il microarray copre una vasta gamma di habitat, compresi quelli di plancton, benthos, e endolitiche, dimostra che questo tecnica potrebbe un attrezzo per il monitoraggio ambientale. Futuri miglioramenti al microarray potrebbe essere quello di aumentare il numero di anticorpi per nuovi ceppi in modo che importanti gruppi filogenetici ancora pendenti sono inclusi. Inoltre, il chip può essere implementato con anticorpi composti cianobatteri specifici, quali tossine o polimero cyanophicin. Questo è particolarmente rilevante per il monitoraggio di serbatoi d'acqua dolce, tubi, e installazioni in strutture umane. Il MICR correnteoarray e le versioni future saranno molto utili nel campo della astrobiologia, sia per il rilevamento di vita o per il monitoraggio di strutture spaziali umani (per esempio, il monitoraggio serbatoi d'acqua o sistemi di supporto vitale). In realtà, si usano abitualmente microarray in campagne per ambienti estremi come metodo per la rilevazione "on-site" della vita rimane. La microarray è parte della cosiddetta vita Detector Chip (LDChip), un microarray con più di 300 anticorpi per la ricerca della vita in missioni di esplorazione planetaria 29, 30. L'alone o come parte del LDChip microarray sarà attuato nei Signs of Life Detector (SOLID) strumento 29 per convalidare il concetto di SOLID-LDChip per l'esplorazione planetaria in più campagne di campo agli analoghi terrestri. Il microarray fornirà informazioni utili dai cianobatteri identificativi e / o loro tossine. Determinando i ceppi, sarà give informazioni su gli ambienti e gli habitat in cui si sono sviluppati.
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Acknowledgments
Ringraziamo il Dr. Antonio Quesada presso la Universidad Autónoma de Madrid per la fornitura di ceppi di cianobatteri. Questo lavoro è stato finanziato dalla Subdirección General de Proyectos de Investigación dello spagnolo Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO), concede nessuna. AYA2011-24803 e ESP2014-58494-R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 mm pore diameter filters | Millipore | GSWP04700 | For preparation of immunogens |
| Eppendorf 5424R microcentrifuge | Fisher Scientific | For preparation of immunogens | |
| Phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 (10x) | Thermo Fisher Scientific | 70011036 | 50 mM potassium phosphate, 150 mM NaCl, pH 7.4 |
| Ultrasonic processor UP50H | Hielscher | For preparation of immunogens | |
| Complete Freund's adjuvant | Sigma-Aldrich | F5881 | Immunopotentiator |
| Incomplete Freud's adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | For boost injections |
| Protein A antibody purification kit | Sigma-Aldrich | PURE1A | For isolation of IgG |
| Centrifugal filter devices MWCO<100 kDa | Millipore | UFC510096-96K | For isolation of IgG |
| Dialysis tubings, benzoylated | Sigma-Aldrich | D7884-10FT | For isolation of IgG |
| Illustra Microspin G-50 columns | GE-HealthCare | GE27-5330-02 | For isolation of IgG |
| Bradford reagent | Sigma-Aldrich | B6916-500 mL | To quantify the antibody concentration |
| MicroBCA protein assay kit | Thermo Scientific | 23235 | To quantify the antibody concentration |
| Protein arraying buffer 2x | Whatman (Sigma Aldrich) | S00537 | Printing buffer; 30 - 40% glycerol in 1x PBS with 0.01% Tween 20 |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | Non-ionic detergent |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | Control for printing; blocking reagent |
| 384-wells microplate | Genetix | X6004 | For antibody printing |
| Robot arrayer for multiple slides | MicroGrid II TAS arrayer from Digilab | For antibody printing | |
| Epoxy substrate glass slides | Arrayit corporation | VEPO25C | Solid support for antibody printing |
| Alexa Fluor-647 Succinimidyl-ester | Molecular probes | A20006 | Fluorochrome |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | Fluorochrome dissolvent |
| Heidolph Titramax vibrating platform shaker | Fisher Scientific | For antibody labeling | |
| Illustra Microspin G-50 columns | Healthcare | 27-5330-01 | For purification of labeled antibodies |
| Safe seal brown 0.5 mL tubes | Sarstedt | 72,704,001 | For labeled antibodies storage |
| Nanodrop 1000 spectrophotometer | Thermo Scientific | To quantify antibody concentration and labeling efficiency | |
| 3 µm pore size polycarbonate 47 mm diameter filter | Millipore | TMTP04700 | To concentrate cells |
| 1 M Trizma hydrochloride solution pH 8 | Sigma-Aldrich | T3038 | For TBSTRR preparation; to block slides |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | For TBSTRR preparation |
| 20 µm nylon filters | Millipore | NY2004700 | For environmental extract preparation |
| 10 - 12 mm filter holders | Millipore | SX0001300 | For environmental extract preparation |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | For environmental extract storage |
| 1 M Trizma hydrochloride solution pH 9 | Sigma-Aldrich | T2819 | To block slides |
| Heidolph Duomax 1030 rocking platform shaker | VWR | To block slides; for incubation processes | |
| VWR Galaxy miniarray microcentrifuge | VWR | C1403-VWR | To dry slides |
| Multi-Well microarray hybridization cassette | Arrayit corporation | AHC1X24 | Cassette for 24 assays per slide |
| GenePix 4100A microarray scanner | Molecular Devices | Scanner for fluorescence | |
| GenePix Pro Software | Molecular Devices | Software for image analysis and quantification |
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