Abstract
El calentamiento global y la eutrofización hacen algunos ecosistemas acuáticos se comportan como verdaderos biorreactores que desencadenan el crecimiento rápido y masivo de cianobacterias; esto tiene consecuencias económicas y de salud relevantes. Muchas cepas de cianobacterias son productores de toxina, y sólo unas pocas células son necesarias para inducir daño irreparable al medio ambiente. Por lo tanto, las autoridades de cuerpo de agua y las administraciones requieren sistemas de alerta temprana rápidos y eficaces que proporcionan datos fiables para apoyar sus decisiones preventivas o curativas. Este manuscrito informa de un protocolo experimental para la detección en el campo de las cepas de cianobacterias productoras de toxinas mediante el uso de un chip de microarray de anticuerpos con 17 anticuerpos (ABS) con resolución taxonómica (CYANOCHIP). Aquí, un inmunoensayo múltiplex fluorescente microarrays sandwich (FSMI) para el seguimiento simultáneo de 17 cepas de cianobacterias encuentra con frecuencia que florece en ecosistemas de agua dulce, algunos de ellos productores de toxina, se describe. Un microarray con multiPLE réplicas idénticas (hasta 24) de la CYANOCHIP se imprimen en un solo portaobjetos de microscopio para probar simultáneamente un número similar de muestras. Las muestras líquidas pueden ser probados ya sea por incubación directa con los anticuerpos (Abs) o después de la concentración de células por filtración a través de un filtro de 1 a 3 micras. Las muestras sólidas, tales como sedimentos y rocas molidas, se homogeneizan en primer lugar y se dispersaron por una de ultrasonidos de mano en un tampón de incubación. A continuación, se filtran (5-20 micras) para retirar el material grueso, y se incuba el filtrado con Abs. Inmunorreacciones se revelan por una incubación final con una mezcla de la Abs marcado con fluorescencia 17 y son leídas por un detector de fluorescencia portátil. Todo el proceso dura alrededor de 3 horas, la mayor parte corresponde a dos períodos de 1 h de incubación. La salida es una imagen, donde puntos brillantes corresponden a la detección positiva de los marcadores de cianobacterias.
Introduction
La detección y el seguimiento de los microorganismos en las comunidades microbianas naturales complejos son cruciales en muchos campos, incluyendo la biomedicina, la ecología del medio ambiente, y la astrobiología. Las cianobacterias son microorganismos procariotas bien conocidos por su capacidad para formar floraciones (proliferación excesiva de células) en agua dulce. Son ubicuos, y muchas especies son capaces de producir toxinas, lo que lleva no sólo a un riesgo potencial para la salud humana, sino también a un impacto ecológico. A este respecto, es esencial para desarrollar métodos rápidos y sensibles para la detección precoz de las cianobacterias y / o sus toxinas en el suelo y el agua. Para este propósito, un inmunoensayo de fluorescencia de microarrays sándwich múltiplex (FSMI) ha sido desarrollado como una herramienta para los gestores del agua para ayudar en la toma de decisiones y, en consecuencia, en la aplicación de programas adecuados de gestión del agua.
Una amplia gama de métodos ha sido desarrollada para detectar e identificar cianobacterial células y cyanotoxinas en suelo y agua, incluyendo la microscopía óptica, biología molecular y técnicas inmunológicas. Estos métodos pueden variar en gran medida en la información que proporcionan. Técnicas microscópicas se basan en la morfología celular y la detección de la fluorescencia in vivo a partir de pigmentos de cianobacterias, tales como ficocianina o clorofila a 1. A pesar de que son métodos rápidos y baratos para tiempo real y monitoreo frecuente que informan sobre el tipo y número de cianobacterias presentes en una muestra, que no dan información sobre la toxicidad potencial. Además, requieren un cierto nivel de experiencia, teniendo en cuenta que a menudo es muy difícil distinguir entre especies estrechamente relacionadas 2. Para superar estas limitaciones, la microscopía de luz debe ir acompañada de los dos ensayos de cribado bioquímicos y biológicos y métodos fisicoquímicos para identificar y cuantificar de cyanotoxinas.
Métodos basados en moléculas se han aplicado durante décadas para detectar, identificar, cuantificar y cianobacterias y sus correspondientes cyanotoxinas gracias a la información de la secuencia publicada en las bases de datos del genoma (por ejemplo, el Centro Nacional de Información sobre Biotecnología, NCBI). Entre estos métodos son los basados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que requiere el diseño de conjuntos de cebadores para la amplificación de ADN y dependen de un conocimiento previo de las secuencias de ADN de diferentes especies de cianobacterias. Mientras que la detección de genes, como el operón ficocianina, conduce a la identificación exacta a nivel de género, algunas especies o cepas no son detectados coneste método. Sin embargo, los genes de toxinas de codificación, como los que pertenecen al operón microcistina, facilitar la identificación de toxinas en muestras en las que los productores son escasos 5. Sin embargo, la detección de marcadores de toxina por PCR no implica necesariamente la toxicidad en el medio ambiente. Por otra parte, el conjunto de cebadores desarrollados para analizar toda la gama de especies de cianobacterias y productores de toxinas presentes en una muestra es aún incompleta, y otros estudios se debe hacer para identificar las especies desconocidas. Otras técnicas moleculares no están basadas en la PCR, tales como hibridación in situ fluorescente (FISH) y microarrays de ADN.
En las dos últimas décadas, la tecnología de microarrays ha ganado importancia en muchos campos de aplicación, en especial en el monitoreo ambiental. Microarrays de ADN permiten la discriminación entre las especies y los analitos 4, 6, 7 sup>, 8, 9, 10, pero se consideran muy laborioso y consume mucho tiempo tareas que implican múltiples etapas (por ejemplo, el rendimiento de microarrays, extracción de ADN, amplificación por PCR y de hibridación). Por esa razón, menos ensayos que requieren mucho tiempo sobre la base de anticuerpos, tales como sándwich y microarrays inmunológicos competitivos, se han convertido en un método de alto rendimiento esencial y fiable para la detección de múltiples analitos ambientales 11, 12, 13. La capacidad de los anticuerpos para reconocer específicamente sus compuestos diana y para detectar pequeñas cantidades de analitos y proteínas, junto con la posibilidad de producir anticuerpos contra casi cualquier sustancia, hacen microarrays de anticuerpos una poderosa técnica para fines medioambientales. Además, la capacidad para conseguir múltiples análisis en tanensayo ingle, con límites de detección que van desde ppb a ppm, es una de las principales ventajas de este método 14.
Biosensores basados en anticuerpos han demostrado ser herramientas sensibles y rápidos para la detección de una amplia gama de patógenos y toxinas en el monitoreo ambiental 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21. Si bien los métodos de ADN implican varios pasos, los microarrays basados en anticuerpos sólo requieren una preparación de la muestra pequeño que se basa principalmente en una etapa de lisis corto en un tampón de solución adecuada. Delehanty y Ligler 15 informaron de la detección simultánea de las proteínas y los analitos en mezclas complejas bacterianas basado en un inmunoensayo sándwich de anticuerpo capaz de detectar una concentración de proteína de un 4 ppbd 10 4 ufc / ml de células. Szkola et al. 21 han desarrollado un microarray múltiplex barato y fiable para la detección simultánea de proteotoxins y pequeñas toxinas, compuestos que podrían ser utilizados como armas biológicas. Se detectaron concentraciones de toxina ricina, con un límite de detección de 3 ppb, en menos de 20 min. Recientemente, el CYANOCHIP, un biosensor basado en microarrays de anticuerpos para la detección in situ de cianobacterias tóxicas y no tóxico, se ha descrito 22. Este microarrays permite la identificación de los posibles floraciones de cianobacterias, sobre todo en los ambientes acuáticos, que son difíciles de identificar microscópicamente. El límite de detección de la micromatriz es 10 2 - 10 3 células para la mayoría de las especies, convirtiendo este biosensor en un instrumento rentable para la detección múltiple y la identificación de las cianobacterias, incluso a nivel de especie. Todas estas propiedades hacen que el Antibotécnica de microarray dy, y en particular el método presentado en este trabajo, un método más rápido y más simple en comparación con las técnicas antes mencionadas.
Este trabajo presenta dos ejemplos de experimentos que usan un biosensor basado en microarrays de anticuerpos para detectar la presencia de cianobacterias en las muestras de suelo y agua. Es un método simple y fiable basado en un formato de inmunoensayo de tipo sándwich que requiere volúmenes de muestra muy pequeñas y preparación de la muestra muy básico. El método requiere un tiempo corto y se puede realizar fácilmente en el campo.
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Protocol
1. Preparación de los inmunógenos
- Crecer cada cepa de cianobacterias en el medio de cultivo correspondiente en las condiciones descritas en la Tabla 1.
NOTA: El medio de crecimiento y condiciones de cultivo para cada cepa cianobacterias se enumeran en la Tabla 1. Todas las cepas de cianobacterias, con la excepción de K17, pertenecen al grupo de Antonio Quesada de la Universidad Autónoma (Madrid, España). El anticuerpo contra rubescens Planktothrix se genera a partir de una muestra natural de la floración monoespecífico de esta cianobacteria de Vilasouto depósito (norte de España). - Cuantificar el número de células utilizando una cámara de recuento de células por microscopía óptica para obtener aproximadamente 10 8 células / ml de un cultivo en fase tardía de crecimiento exponencial o estacionario.
- Cosecha de células 5 ml de cultivo por centrifugación a 2.000 xg durante 5 min.
- Eliminar el sobrenadante y resuspender las células en una tina 10 mLe con 5 ml de solución salina tamponada con fosfato 1x (1x PBS) para obtener alrededor de 10 8 células / ml.
- Homogeneizar y lisar las células de la suspensión mediante sonicación durante 5 ciclos, 30 s cada una, con un 30 a 60 s de pausa en hielo, utilizando un procesador ultrasónico portátil, de mano o sumergiendo el tubo en el baño de agua de una disruptor celular con la máxima amplitud (30 kHz).
- Repita los pasos 1.3 a 1.5 para cada cepa de cianobacteria.
NOTA: La sonicación produce la ruptura celular y la liberación de contenido celular. Mientras que las proteínas y polisacáridos son buenos inmunógenos, moléculas específicas, tales como lípidos y ácidos nucleicos, no provocar una respuesta inmunogénica humoral por sí mismos. Por lo tanto, tienen que unirse a portadores, tales como polisacáridos o proteínas, para aumentar la complejidad molecular. Además, sonicación libera material intracelular que puede desencadenar la producción de anticuerpos.
2. Producción de anticuerpos policlonales
- Preparar la primera immdosis unogen mezclando 0,5 ml del lisado celular a ultrasonidos obtenido en la etapa 1.5 con 0,5 ml de adyuvante completo de Freund. Entregarlo al operador de una instalación de animales para la producción de anticuerpos policlonales de conejo.
- Preparar tres dosis más como antes para su utilización como aumenta la memoria en el proceso de producción de anticuerpos mediante la mezcla de 0,5 ml de la misma homogeneizado / lisado obtenido en la etapa 1.5 con 0,5 ml de adyuvante incompleto de Freund. Dales a la instalación de animales para cumplir con el proceso de la producción de anticuerpos.
- Repita los pasos 2.1 y 2.2 para cada nuevo proceso de producción de anticuerpos.
NOTA: Normalmente, la producción de anticuerpos se confía a las instalaciones de animales o empresas especializadas, ya que se requieren licencias y la formación adecuada para trabajar con animales. Las empresas de suministro de una medida relativa ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) de la cantidad de anticuerpos específicos de antígeno presente en la muestra de suero.
3. Anticuerpo Purificación
- Se purifica el G fracción de inmunoglobulina (IgG) tanto de la inmune y el suero pre-inmune obtenidos en la etapa 2 por una proteína de cromatografía de afinidad. Algunos kits de purificación comerciales, sobre la base de sistemas de cartuchos, funcionan bien; siga las instrucciones del proveedor.
- Cuando el kit de purificación no proporciona un sistema de desalinización, cambiar el tampón después de la elución de los anticuerpos purificados a 0,1X PBS, o bien mediante diálisis o mediante el uso de dispositivos de filtro centrífugos con un 100-kDa (o inferior) de tamaño de poro de la membrana.
- Determine la concentración de anticuerpo midiendo la absorbancia a 280 nm o mediante el uso de métodos colorimétricos, tales como Bradford 23, Lowry 24, o el ácido bicinconínico (BCA) 25.
NOTA: Es importante evitar la inclusión de grupos amina en el tampón de elución (por ejemplo, tampones Tris) porque compiten con el anticuerpo para la unión a superficies sólidas activadas con grupos epoxi. después de la pUrificación, es importante para probar la actividad de anticuerpo con ELISA.
4. La fluorescencia de anticuerpos etiquetado
- Etiquetar los anticuerpos purificados obtenidos en el apartado 3 con un fluorocromo (por ejemplo, un colorante fluorescente rojo lejano) por disolución de un vial comercial que contiene tinte para el etiquetado de 1 mg de proteína en 100 l de sulfóxido de dimetilo (DMSO). Añadir 2 l de colorante disuelto a cada preparación de anticuerpo a una concentración de 2 mg / ml en un volumen final de 50 l en solución salina tamponada con fosfato 50 mM (pH 8,5).
- Mantener las reacciones de marcado con agitación continua durante 1 h a temperatura ambiente y 1200 rpm en una plataforma vibratoria.
- Purificar los anticuerpos marcados por cromatografía de exclusión de tamaño (por ejemplo, utilizando un gel con un intervalo de fraccionamiento de entre 1,5 y 30 kDa atrapados en una columna), siguiendo las recomendaciones del proveedor.
- Se mide la absorbancia a 280 nm y 650 nm en los eluidos y calcular el labeeficiencias de Ling que sigue las recomendaciones del proveedor.
NOTA: Hasta 50 x 50 l reacciones anticuerpo-etiquetado se puede hacer con un solo vial del colorante fluorescente para el etiquetado 1 mg de proteína. Se recomienda cubrir los tubos con papel de aluminio o, alternativamente, utilizar opacos tubos de 0,5 ml para evitar los procesos de enfriamiento rápido después de la etapa 4.3. Para los anticuerpos IgG, etiquetado óptimo se consigue con 3-7 moles del colorante por mol de anticuerpo.
5. Producción CYANOCHIP
- Los anticuerpos y los controles en solución de impresión
- Preparar 30 l de cada anticuerpo purificado en solución de impresión mediante la mezcla de cada anticuerpo a 1 mg / ml en un tampón de impresión proteína 1x comercial con 0,01% (v / v) de Tween 20 (detergente no iónico), todas las concentraciones finales.
NOTA: Como alternativa, una solución de anticuerpo puede contener 20% de glicerol, 1% de sacarosa (o trehalosa, como conservante), y 0,01% (v / w) (v / v) (pH 8,5) de Tween 20 en tampón de carbonato. - Preparar 30 l de la solución de impresión como controles: (a) tampón de impresión proteína 1x con 0,01% (v / v) de Tween 20, (b) la proteína-A de suero pre-inmune purificada a 1 mg / ml en tampón de impresión proteína 1x con 0,01% (v / v) de Tween 20, y (c) de albúmina de suero bovino (BSA) al 1 mg / ml en 1 x tampón de impresión proteína con 0,01% (v / v) de Tween 20.
- Preparar 30 l de un suero pre-inmune marcada con fluorescencia, purificado a diferentes concentraciones (por ejemplo, de 50 mg / ml a 1 mg / ml) en tampón de impresión proteína 1x con Tween 20, como en el paso 5.1.1. Estas muestras se utilizaron como marcadores fluorescentes marco y para la cuantificación de fluorescencia relativa después de detectar.
- Añadir 30 l por pocillo de las soluciones de impresión preparados en los pasos 5.1.1, 5.1.2, y 5.1.3 a la más alta calidad de 384 pocillos de microplacas para la fabricación de microarrays, tal como polipropileno.
NOTA: tampón de impresión de la proteína aumenta la calidad y la estabilidad de los anticuerpos, y Tween 20 homogeniza mo puntorphology y se acumula la proteína de acoplamiento hacia arriba. Se recomienda mantener la microplaca 384 pocillos a 4 ° C antes de su uso. Almacenarlo a -20 ° C durante largos períodos de tiempo. El polipropileno tiene niveles bajos de DNA, proteínas, extracto de células, y la pequeña molécula de unión intrínseca.
- Preparar 30 l de cada anticuerpo purificado en solución de impresión mediante la mezcla de cada anticuerpo a 1 mg / ml en un tampón de impresión proteína 1x comercial con 0,01% (v / v) de Tween 20 (detergente no iónico), todas las concentraciones finales.
- La impresión de anticuerpos en un portaobjetos de microscopio
Nota: No imprimir los anticuerpos en portaobjetos de microscopio activadas mediante el uso de diferentes plataformas de gama, como contactos, escisión de la aguja, o dispositivos sin contacto, como impresoras piezoeléctricas o tecnologías "chorro de tinta". En este trabajo, la CYANOCHIP se ha impreso de forma rutinaria por contacto usando un sistema robótico (arrayer) capaz de detectar cantidades nL de los anticuerpos en la escala de micras.- Ajuste de las condiciones ambientales de la sala de impresión a 20 ° C y 40-50% de humedad relativa.
- Configurar los sustratos de diapositivas (por ejemplo, de 75 x 25 mm portaobjetos de vidrio de microscopio epoxi-activado) para realizar varias arra anticuerpos idénticosys en cada diapositiva.
- Detectar cada anticuerpo purificado, incluidos los controles y el sistema de referencia, en un patrón de puntos por triplicado; en estas condiciones, las manchas son de 180 - 200 micras de diámetro.
- Después de la impresión, deje los portaobjetos durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente hasta dejarlos secar, y luego almacenarlos a 4 ° C; por trabajar en el campo, las diapositivas pueden ser transportados y almacenados a temperatura ambiente durante varios meses.
NOTA: El CYANOCHIP se imprime en un formato de microarrays punto por triplicado con 3 x 8 microarrays idénticos por diapositiva o 9 matrices idénticas en un formato de microarrays 1 x 9. Cada tamaño de la matriz no debe ser mayor que las dimensiones de la cámara de reacción para una junta de 24 pocillos (por lo general 7,5 x 6,5 mm en una cámara de hibridación 3 x 8). - Antes de utilizar el microarray para analizar muestras ambientales, el uso FSMI para determinar la dilución de trabajo para cada anticuerpo en una curva de titulación. Para cada anticuerpo, utilizar una concentración estándar de la imm correspondientesunogen (10 04 03 al 10 células / ml) y diluciones en serie del anticuerpo fluorescente (entre 1: 500 y 1: 32.000). La concentración óptima de anticuerpos corresponde a 50% de la intensidad máxima de la señal obtenida en la curva de titulación. Además, la sensibilidad y especificidad de cada anticuerpo se deben determinar, como se describe en Blanco et al. 22.
6. Preparación de extractos de varios analitos ambientales para el inmunoensayo fluorescente Sandwich de microarrays (FSMI)
- Extracto de varios analitos a partir de una muestra líquida
- Tomar 1 - 100 ml de la muestra de líquido con una jeringa estéril (por ejemplo, el agua de la orilla de un depósito de agua); la cantidad de muestra depende en gran medida de la concentración potencial de los objetivos.
- Concentrar las células haciendo pasar la muestra de agua a través de un tamaño de poro de 3 micras, 47 mm de filtro de policarbonato de diámetro; una concentración celularentre 03 10 hasta 8 10 células / ml es deseable para la detección positiva, pero la concentración real es desconocido.
- Recuperar la biomasa recogida en el filtro con 1 ml de una solución salina tamponada con Tris modificado, tampón Tween 20 reforzado con (TBSTRR; 0,4 M Tris-HCl (pH 8), 0,3 M NaCl, y 0,1% de Tween 20) por raspado con una espátula en un tubo de 15 ml.
- Homogeneizar y desagregar mediante el uso de un procesador ultrasónico manual, tal como se describe en el paso 1.5, o simplemente la pipeta hacia arriba y abajo varias veces; Esto prepara la muestra para su análisis por el microarray.
- Extracto de varios analitos a partir de una muestra sólida
- A pesar hasta 0,5 g de la muestra sólida (por ejemplo, roca, suelo o sedimentos) en un tubo de 10 ml y añadir hasta 2 ml de TBSTRR.
- Someter a ultrasonidos mediante la inmersión de la sonda de ultrasonidos en el tubo, sumergiendo el tubo en el baño de agua de un poderoso cuerno sonicador, o mediante el uso de un aparato de ultrasonidos de mano. Realizar al menos 5 x 30-sciclos a 30 kHz, parando durante 30 s mientras que en el hielo.
- Se filtra para eliminar la arena, arcilla, y otros materiales de grueso con una jeringa de 10 mL acoplado a un diámetro de 10 a 12 mm, de 5 a 20 micras-soporte de filtro de nylon de tamaño de poro. Empuje la muestra a través del filtro en un tubo de 1,5 ml. Si se satura el filtro, agitar la suspensión en la jeringa y llevarlo a una nueva; Esto prepara el material de filtrado para el inmunoensayo (paso 7).
NOTA: La capacidad tampón de TBSTRR depende del tipo de muestra. Es importante para llevar a cabo el inmunoensayo inmediatamente después de la preparación del extracto del medio ambiente para evitar el efecto de la degradación enzimática de los analitos. Alternativamente, añadir inhibidores de la proteasa en el extracto del medio ambiente y se congelan a -80 ° C hasta el siguiente paso.
7. Sandwich fluorescente de microarrays de Inmunoensayo (FSMI)
- El bloqueo de la CYANOCHIP
NOTA: Inmediatamente antes de su uso, el tratamiento de la pMPRESO desliza para bloquear todos los grupos epoxi libres en el portaobjetos y para eliminar el exceso de anticuerpos no unidos covalentemente.- Sumergir el microarray en 0,5 M Tris-HCl (pH 9) con 5% (w / v) de BSA en una superficie limpia (por ejemplo, placa Petri o un tubo de 50 ml) con agitación suave de una plataforma oscilante durante 5 min. Como alternativa, coloque la corredera hacia abajo en una caída de 100 a 200 l de la solución anterior con las manchas de microarrays que se le plantean. Dejar actuar de 3 - 5 min y luego proceder.
- Recoja cuidadosamente el portaobjetos utilizando pinzas de plástico con punta; tratar de evitar zonas de microarrays tocar. Eliminar el exceso de líquido golpeando suavemente el portaobjetos sobre una toalla de papel. Sumerja en 0,5 M Tris-HCl (pH 8) con 2% (w / v) de BSA durante 30 min con agitación suave a partir de una plataforma oscilante.
- Se seca la diapositiva mediante la realización de una breve centrifugación (200 - 300 g durante 1 min) utilizando una microcentrífuga comercial adaptada para portaobjetos de microscopio. Como alternativa, se seca la diapositiva golpeando suavemente el OntarioOA toalla de papel.
- La incubación del extracto de la muestra multianalito con el microarray
- Configurar el portaobjetos en un casete de hibridación de microarrays comercial con 24 pozos de múltiples microarrays; siga las instrucciones del proveedor.
- Después del montaje deslizante y casete, pipeta hasta 50 l de extracto de la muestra o una dilución de la misma en TBSTRR en cada pocillo de la cassette.
- Repita el paso 7.2.2 para cada muestra a analizar.
- Como control en blanco, la pipeta 50 l de tampón TBSTRR en al menos dos pocillos separados de la cassette.
- Incubar a temperatura ambiente durante 1 h con mezcla pipeteando cada 15 min o dejándolo bajo agitación suave. Como alternativa, se incuba durante 12 horas a 4 ° C.
NOTA: Utilice otras juntas de incubación como una función del patrón de microarrays. El tiempo y la temperatura de la incubación en el paso 7.2.5 son parámetros empíricos, que normalmente dependen de la afinidad y la unión kinetics de cada emparejados antígeno-anticuerpo.
- Lavado
- Retire las muestras al poner el casete hacia abajo y con cuidado lo derriba sobre un papel absorbente limpio.
- Lavar los pocillos mediante la adición de 150 l de TBSTRR a cada uno, y eliminar el tampón, como arriba.
- Repita el paso 7.3.2 tres veces más.
- La incubación con anticuerpos detectores fluorescentes
- Añadir 50 l de una mezcla de anticuerpos que contiene los anticuerpos anti-cianobacterias-deformación 17, cada una marcada con el fluorocromo en TBSTRR con 1% (w / v) de BSA. Determinar la concentración de cada anticuerpo fluorescente en la mezcla de (0,7 a 2 mg / ml) mediante la realización de experimentos de titulación de cada par 22 de antígeno / anticuerpo.
- Incubar durante 1 h a temperatura ambiente, como se describe en el paso 7.2.5, o durante 12 horas a 4 ° C.
- Lavado de los anticuerpos fluorescentes </ Strong>
- Extraer los anticuerpos no unidos fluorescentes, como en el paso 7.3.
- Desmontar el cassette y sumerja el deslizamiento hacia 0,1x PBS (por ejemplo, en un tubo de 50 ml) durante un enjuague rápido.
- Se seca la diapositiva como en el paso 7.1.3.
8. Análisis en busca de fluorescencia
- Escanear la diapositiva para la fluorescencia en el pico máximo de emisión de fluorescencia de colorante fluorescente rojo lejano en un escáner de fluorescencia. Tome varias imágenes de los microarrays a diferentes parámetros de análisis, generalmente mediante la reducción del valor de ganancia de láser.
NOTA: Evitar los puntos saturados (> 65.000 cuentas de fluorescencia) -ellos están fuera de escala y pueden introducir errores de cuantificación.
9. Procesamiento de Imágenes y Análisis de Datos
- Utilice un software comercial para el análisis de imágenes y cuantificación; el software proporciona mediciones de la intensidad de fluorescencia (FI; mediana o la media de todos los píxeles de un solo punto) para correoada punto de todo el microarray. Restar el fondo local alrededor de las manchas: FI = punto FI - FI fondo local.
- Guardar los datos FI y abrirlos utilizando un programa de hoja de cálculo.
- Utilice los valores obtenidos para las matrices en blanco como control negativo para identificar y descartar los falsos positivos. Aplicar la siguiente ecuación para calcular el FI para cada mancha de anticuerpos: FI = (muestra FI - FI en blanco), donde FI muestra = punto FI - FI fondo local en los microarrays de correr con extractos de la muestra y FI en blanco = punto FI - FI antecedentes locales en los microarrays en blanco.
- Aplicar un umbral de corte adicional de 2 a 3 veces el promedio de la FI de todo el microarray para minimizar la probabilidad de falsos positivos; esto es especialmente relevante para las imágenes de microarrays de baja calidad y baja relación señal-ruido.
- Crear parcelas y / o llevar a cabo un análisis adicional según sea necesario.
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Representative Results
Este trabajo describe una prueba de inmunoensayo múltiplex para la identificación simultánea de las especies de cianobacterias de agua dulce más relevantes (Tabla 1) utilizando el microarray de anticuerpos CYANOCHIP. El microarray puede ser un formato 3 x 8 microarrays impresos en portaobjetos de microscopio. Cada micromatriz se compone de un conjunto de 17 anticuerpos impresos en un patrón de puntos por triplicado, sus anticuerpos pre-inmunes correspondientes y BSA como controles negativos. Los microarrays también incluyen un marco fluorescente, usando un anticuerpo pre-inmune marcado con fluorescencia para localizar fácilmente el patrón de microarray 22 (Figura 1).
La micromatriz se puso a prueba en el campo para el análisis in situ de las muestras de agua recogidas en la orilla del embalse de agua dulce Lozoya, que abastece a la ciudad de Madrid. Las muestras se procesaron como se describe anteriormente, y elprincipales inmunorreacciones positivos correspondían a los anticuerpos a las cianobacterias planctónicas, como Microcystis spp. (K4 y K5), y para bentónicos Oscillatoriales, como Leptolyngbya spp. (K10 y K15). Bajar las señales de fluorescencia se obtuvieron de Nostocales (K6 y K12, dos planctónicas Aphanizomenon spp.), Bentónicas Rivularia sp. (K8), Anabaena sp. (K1), y planctónicas Microcystis sp flos-aquae. (K3). observaciones al microscopio óptico (no mostrados) mostraron una comunidad de cianobacterias diversa dentro abundante escombros terrígeno de la orilla. Varias especies de Anabaena dominaron la comunidad, pero Microcystis spp. y Pseudanabaena spp. También estuvieron presentes.
Además, el microarray también fue validado por el ensayo de una cerca de 1.000 años de edad, estera seca, microbiano recogida en la barrera de hielo McMurdo en la Antártida para comprobar la presencia de cianobacterias markers. La figura 1 muestra las reacciones altamente fluorescentes y positivos en anticuerpos producidos bentónicos cianobacterias aisladas de otras alfombras de la Antártida, incluidas Anabaena sp. y Leptolyngbya spp. (K14 y K15, respectivamente). Inmunorreacciones positivos adicionales se detectaron con anticuerpos a las cianobacterias planctónicas, como Microcystis spp. (K4 y K5), Aphanizomenon spp. (K6 y K12), y Planktothrix rubescens sp. (K17). Las señales bajas se obtuvieron a partir de anticuerpos a otras especies bentónicas aislados en una estera de la Antártida, incluidas Tolypothrix sp. (K16) y Anabaena sp. (K1). Microscopía óptica fluorescente reveló la presencia de células estructuralmente similares a las cianobacterias y algas verdes (no mostrado). No se identificaron las cianobacterias filamentosas. Sin embargo, se detectaron múltiples estructuras fluorescentes amorfos de aproximadamente 1 m de tamaño y fluorescencia difusa copiosa, WHIch podría atribuirse a la presencia de restos celulares (roto y las células muertas) y las sustancias poliméricas extracelulares (EPS), respectivamente. En consecuencia, el análisis bioquímico mostró que la estera consistía en cantidades abundantes de biopolímeros y restos celulares (materia biológica compleja) que podrían ser los blancos de los anticuerpos en el microarray.
Figura 1: Rápido y fiable Multiplex Microarray inmunoensayo para detectar cianobacterias. A) Esquema que muestra las principales etapas de la FSMI para el análisis de muestras múltiples de destino con un CYANOCHIP. B) Esquema de un diseño de patrón de impresión (por triplicado) de la colección de anticuerpos anti-cianobacterias: (0) BSA, albúmina de suero bovino; (X) único amortiguador impresión; (1-17), cada uno de los anticuerpos como en la Tabla 1 en BLanco et al. 2015 (K1 a K17). De P1 a P17, los anticuerpos pre-inmunes correspondientes actúan como controles. Los rectángulos amarillos corresponden a un gradiente mancha fluorescente como un marco de referencia. C y D) Imagen que muestra la parte superior de una de 1.000 años de edad, estera microbiana seca de la imagen CYANOCHIP detección de cianobacterias en esta alfombra, respectivamente barrera de hielo McMurdo (Antártida) y. E) Vista panorámica del embalse de Lozoya mostrando el agua transparente, sin partículas visibles verdes en el momento del muestreo. Imagen microarray después de que el análisis in situ de la muestra de agua F) (modificado de referencia 22).
| código ab | Inmunógeno (cepa) | Orden | Habitat | | condiciones de cultivo | |
| K1 | Anabaena sp. | Nostocales | desconocido | BG11 y nitrato | 30 ºC, luz continua |
| K2 | Anabaena sp. | Nostocales | desconocido | BG11o | 30 ºC, luz continua |
| K3 | Microcystis flos-aquae | Chroococcales | planctónica | BG11 | 28 ºC, luz continua |
| K4 | novacekii Microcystis | Chroococcales | planctónica | BG11 | 28 ºC, luz continua |
| K5 | Microcystis aeruginosa | Chroococcales | planctónica | BG11 | 28 ºC, luz continua |
| K6 | ovalisporum Aphanizomenon | Nostocales | planctónica | BG11o | 28 ºC, luz continua |
| K7 | Phormidium sp. | Oscillatoriales | bentónica | BG11 | 18 ºC, 16-8 fotoperiodo |
| K8 | Rivularia sp. | Nostocales | bentónica | CHU-D | 18 ºC, 16-8 fotoperiodo |
| K9 | Chamaesiphon sp. | Chroococcales | bentónica | BG11 | 18 ºC, 16-8 fotoperiodo |
| K10 | boryana Leptolyngbya | Oscillatoriales | bentónica | BG11 | 18 ºC, 16-8 fotoperiodo |
| K11 | distorta Tolypothrix | Nostocales | bentónica | BG11o | 18 ºC, 16-8 fotoperiodo |
| K12 | aphanizomenoides Aphanizomenon | Nostocales | planctónica | BG11o | 28 ºC, luz continua |
| K13 | Nostoc sp. (Antártida) | Nostocales | bentónica | BG11o | 13 ºC, 16-8 fotoperiodo |
| K14 | Anabaena sp. | Nostocales | bentónica | BG11o | 13 ºC, 16-8 fotoperiodo |
| K15 | Leptolyngbya sp. | Oscillatoriales | bentónica | BG11 | 13 ºC, 16-8 fotoperiodo |
| K16 | Tolypothrix sp. | Nostocales | bentónica | BG11 | 13 ºC, 16-8 fotoperiodo |
| K17 | rubescens Planktothrix | Oscillatoriales | planktonic | ninguna | ninguna |
Tabla 1. Lista de los anticuerpos (Abs) y las cepas de cianobacterias usado para producir el CYANOCHIP 22.
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Discussion
Aquí, un inmunoensayo de tipo sándwich fluorescente multiplex usando el CYANOCHIP, una micromatriz 17-anticuerpo para la detección y la identificación de una amplia gama de géneros de cianobacterias, se describe 22. Estas cianobacterias representan los géneros bentónicas y planctónicas más frecuente en hábitats de agua dulce, algunos de ellos productores de toxinas que son. Recientemente, el formato de inmunoensayo sándwich fluorescente se ha utilizado para identificar microorganismos y / o bioanalytes en aplicaciones medioambientales 26, 27, 28. El protocolo se basa principalmente en dos etapas: (i) inmovilizar o captura de anticuerpos para unirse específicamente analitos de una muestra de ensayo y (ii) detectar pares de analito-anticuerpo mediante el uso de anticuerpos marcados con fluorescencia (anticuerpos trazadores o detectores). Debido a que el ensayo de sándwich requiere al menos dos sitios de unión de anticuerpos accesibles (epítopos) en el analito paraque la reacción tenga lugar, cualquier señal fluorescente positiva indica la presencia de relativamente grandes y complejos oligo- o multiméricos analitos que son idénticos o muy similares a los utilizados para producir los anticuerpos de captura.
A pesar de que este método requiere volúmenes pequeños y preparación de la muestra básica, sin la necesidad de experiencia o conocimientos especiales, varios inconvenientes podrían arruinar el ensayo. señales fluorescentes de bajo o una completa falta de la misma puede ser debido a la purificación de anticuerpos pobre o pobre eficiencia de etiquetado. Para el aislamiento de IgG de conejo, proteína A es la mejor opción, porque se une específicamente con alta eficiencia a la región Fc de las inmunoglobulinas. Como se indica en la sección 4, se deben utilizar anticuerpos fluorescentes con una gama de etiquetado entre 3-7 moles de colorante por mol de anticuerpo. Además, la falta de puntos fluorescentes puede explicarse por la concentración de analitos se encuentran debajo de los límites de detección. En este caso, la muestra puede ser concentrated antes de incubar con la micromatriz, o mayores cantidades puede ser utilizado para una nueva extracción. fondos fluorescentes de alta son el resultado de bloqueo de chip ineficiente y / o etapas de lavado y de extractos de las muestras compuestas de minerales y materia orgánica compleja que se pegan en el chip. Cuando se utilizan muestras complejas como analitos, es deseable aumentar la sal y / o la concentración de detergente, para favorecer la interacción específica entre los pares de analito-anticuerpo.
En los últimos años, la tecnología de microarrays de anticuerpos se ha desarrollado para aplicaciones ambientales. No obstante, el uso de esta técnica implica algunas limitaciones. Los anticuerpos policlonales son más rápido y más barato de producir y, más importante, la posibilidad de unirse cualquier epítopo diana en una muestra ambiental complejo son teóricamente más alta que con los anticuerpos monoclonales. Sin embargo, el hecho de que pueden reconocer diferentes epítopos aumenta el número de reacciones cruzadas en FSMI. Para tener una alta especificidad, el uso de métodos para separar estos eventos de reactividad cruzada de los verdaderos reacciones afines antígeno-anticuerpo mediante el uso de métodos de deconvolución 26, 27, por ejemplo, es altamente deseable. Básicamente, el microarray se considera un biosensor cualitativo para la detección múltiple y clasificación de las cianobacterias. A este respecto, es esencial para determinar el límite de detección para cada anticuerpo de una en una para utilizar sus concentraciones óptimas de trabajo en el ensayo. Aunque este microarray, junto con FSMI, no se concibe como un método cuantitativo, el biosensor implica alta sensibilidad, debido a que el límite inferior de detección de la mayoría de los anticuerpos contenidos en el CYANOCHIP 22 es de 10 2 a 10 3 células / ml.
A pesar de estas limitaciones, esta metodología tiene varias ventajas frente a otras técnicas utilizadas en m ambientaliento. Anticuerpos biosensores permiten la posibilidad de reconocer diferentes moléculas simultáneamente en un solo análisis, la posibilidad de detectar baja concentración de analitos, y la posibilidad de producir anticuerpos contra casi cualquier sustancia. Además, la micromatriz puede alcanzar hasta 24 análisis en un solo ensayo, con límites de detección de 10 2 células / ml. En comparación con otros métodos, los anticuerpos pueden detectar células vivos o muertos, material extracelular, y los restos celulares. Aunque se necesitan al menos 4 horas para completar todo el ensayo, es más rápido que otros métodos analíticos aplicados a la vigilancia del medio ambiente. El CYANOCHIP fue concebido originalmente para la identificación de cepas de cianobacterias. Este biosensor no fue diseñado formalmente para tal fin, por lo que puede identificar potenciales productores de toxinas y podría ser mejorado en el futuro mediante la adición de anticuerpos contra una amplia gama de nuevas cepas. Ensayos bioquímicos, tales como ELISA, PPIA, y neuroquímicoPruebas en ratones, permiten la identificación de cyanotoxinas, sino que se limitan a unas pocas toxinas conocidas y pueden dar falsos positivos. Además, el uso de la CYANOCHIP no requiere un entrenamiento especial, mientras microscopía óptica y de ratón bioensayos requieren personal capacitado o un trabajo intensivo con animales vivos, y no dan información sobre el tipo de toxinas presentes en una muestra. Cianotoxinas también pueden ser identificados y cuantificados por otros métodos analíticos, tales como HPLC, GC-MS, o MALDI-TOF. En estos métodos, la muestra debe ser purificado, y la falta de estándares de referencia limita la identificación de cianotoxinas. Además, los métodos analíticos requieren equipos y materiales costosos y formación especializada. Los métodos moleculares se basan en la extracción de ADN de las muestras, mientras que FSMI sólo requiere un extracto medioambiental elaborado de un par de pasos muy sencillos, sin purificación cianobacterias.
El alto rendimiento de la CYANOCHIP dela detección in situ de las cianobacterias en los embalses de agua dulce hace que sea una nueva herramienta para la detección temprana de los administradores del agua. Además, el microarray también es interesante para el campo de la astrobiología, en particular para la búsqueda de marcadores microbianos como prueba de la vida. El estudio de los extremófilos nos puede ayudar a comprender el origen de la vida en la Tierra y cómo la vida podría sobrevivir en las condiciones extremas presentes en nuestro sistema solar y más allá. Como varios ambientes de la Tierra son muy similares a los lugares en otros planetas, como Marte, podría ser posible encontrar restos de procariotas fotosintéticos como evidencias de vida extintas. El microarray fue capaz de identificar marcadores de cianobacterias de vivir o de células no vivientes; de la población se mantiene y / o material extracelular en los tapetes microbianos de edad (Figura 1); y del agua, el suelo y las rocas recogidas en ambientes extremos, tales como la Antártida, Atacama, los lagos andinos, el Alto Ártico, o laárea de Río Tinto en España (no se muestra). Teniendo en cuenta que las cianobacterias son los microorganismos primitivos en la Tierra, no hay razón para creer que puede ser que una vez que han vivido en otros planetas.
En conclusión, el hecho de que CYANOCHIP-FSMI puede identificar en los marcadores de cianobacterias situ e incluso puede que asociar a diferentes filotipos o grupos, y que el microarray cubre una amplia gama de hábitats, incluyendo los de plancton, bentos, y endolitos, demuestra que este técnica podría una herramienta para el monitoreo ambiental. Las mejoras futuras a la micromatriz podría ser aumentar el número de anticuerpos a nuevas cepas de modo que los grupos filogenéticos pertinentes aún pendientes están incluidos. Además, el chip puede ser implementado con anticuerpos frente a compuestos de cianobacterias específicos, tales como toxinas o polímero cyanophicin. Esto es especialmente relevante para el monitoreo de reservorios de agua dulce, tuberías e instalaciones en las instalaciones humanos. El micr actualoarray y versiones futuras serán muy útiles en el campo de la astrobiología, ya sea para la detección de vida o para el control de instalaciones espaciales humanos (por ejemplo, el seguimiento embalses de agua o sistemas de soporte de vida). De hecho, nosotros usamos el microarray en las campañas de campo para ambientes extremos como un método para la detección "in situ" de la vida sigue. El microarray es parte de la denominada vida detector Chip (LDChip), un microarray con más de 300 anticuerpos para la búsqueda de vida en las misiones de exploración planetaria 29, 30. El solo o como parte de la LDChip microarrays se llevará a cabo en los signos de vida Detector (SOLID) instrumento 29 para validar el concepto SOLID-LDChip para la exploración planetaria en múltiples campañas de campo a análogos terrestres. El microarray proporcionará información útil mediante la identificación de las cianobacterias y / o sus toxinas. Mediante la determinación de las cepas, se give la información sobre los entornos y los hábitats en los que se desarrollaron.
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Acknowledgments
Agradecemos al Dr. Antonio Quesada de la Universidad Autónoma de Madrid para proporcionar cepas de cianobacterias. Este trabajo fue financiado por la Subdirección General de Proyectos de Investigación de la española Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO), otorga ninguna. AYA2011-24803 y ESP2014-58494-R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 mm pore diameter filters | Millipore | GSWP04700 | For preparation of immunogens |
| Eppendorf 5424R microcentrifuge | Fisher Scientific | For preparation of immunogens | |
| Phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 (10x) | Thermo Fisher Scientific | 70011036 | 50 mM potassium phosphate, 150 mM NaCl, pH 7.4 |
| Ultrasonic processor UP50H | Hielscher | For preparation of immunogens | |
| Complete Freund's adjuvant | Sigma-Aldrich | F5881 | Immunopotentiator |
| Incomplete Freud's adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | For boost injections |
| Protein A antibody purification kit | Sigma-Aldrich | PURE1A | For isolation of IgG |
| Centrifugal filter devices MWCO<100 kDa | Millipore | UFC510096-96K | For isolation of IgG |
| Dialysis tubings, benzoylated | Sigma-Aldrich | D7884-10FT | For isolation of IgG |
| Illustra Microspin G-50 columns | GE-HealthCare | GE27-5330-02 | For isolation of IgG |
| Bradford reagent | Sigma-Aldrich | B6916-500 mL | To quantify the antibody concentration |
| MicroBCA protein assay kit | Thermo Scientific | 23235 | To quantify the antibody concentration |
| Protein arraying buffer 2x | Whatman (Sigma Aldrich) | S00537 | Printing buffer; 30 - 40% glycerol in 1x PBS with 0.01% Tween 20 |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | Non-ionic detergent |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | Control for printing; blocking reagent |
| 384-wells microplate | Genetix | X6004 | For antibody printing |
| Robot arrayer for multiple slides | MicroGrid II TAS arrayer from Digilab | For antibody printing | |
| Epoxy substrate glass slides | Arrayit corporation | VEPO25C | Solid support for antibody printing |
| Alexa Fluor-647 Succinimidyl-ester | Molecular probes | A20006 | Fluorochrome |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | Fluorochrome dissolvent |
| Heidolph Titramax vibrating platform shaker | Fisher Scientific | For antibody labeling | |
| Illustra Microspin G-50 columns | Healthcare | 27-5330-01 | For purification of labeled antibodies |
| Safe seal brown 0.5 mL tubes | Sarstedt | 72,704,001 | For labeled antibodies storage |
| Nanodrop 1000 spectrophotometer | Thermo Scientific | To quantify antibody concentration and labeling efficiency | |
| 3 µm pore size polycarbonate 47 mm diameter filter | Millipore | TMTP04700 | To concentrate cells |
| 1 M Trizma hydrochloride solution pH 8 | Sigma-Aldrich | T3038 | For TBSTRR preparation; to block slides |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | For TBSTRR preparation |
| 20 µm nylon filters | Millipore | NY2004700 | For environmental extract preparation |
| 10 - 12 mm filter holders | Millipore | SX0001300 | For environmental extract preparation |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | For environmental extract storage |
| 1 M Trizma hydrochloride solution pH 9 | Sigma-Aldrich | T2819 | To block slides |
| Heidolph Duomax 1030 rocking platform shaker | VWR | To block slides; for incubation processes | |
| VWR Galaxy miniarray microcentrifuge | VWR | C1403-VWR | To dry slides |
| Multi-Well microarray hybridization cassette | Arrayit corporation | AHC1X24 | Cassette for 24 assays per slide |
| GenePix 4100A microarray scanner | Molecular Devices | Scanner for fluorescence | |
| GenePix Pro Software | Molecular Devices | Software for image analysis and quantification |
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