Summary
Bu teknik, bir insan onkogen kodlama çoğaltma kusurlu retroviral stokları hazırlamak için etkin bir şekilde gösteriyor ve daha sonra fare modeli myeloproliferatif hastalığı indüksiyonu için kullanılır.
Abstract
Bcr-Abl veya büyüme faktörü reseptör-kaynaklı onkogenler (ZNF198 FGFR1, Bcr-PDGFRα, vb) gibi onkogenler tarafından uyarılan laboratuar çalışmaları insan myeloproliferatif hastalıklar. Biz fare modelinde daha önce ilgi onkogen ifade bir retrovirüs ile enfekte kemik iliği hücrelerinin nakli, insan gibi bir hastalık modeli ve çalışma edebiliyoruz. Çoğaltma arızalı retrovirüs bir insan onkogen kodlama ve bir işaretleyici (GFP, RFP, antibiyotik direnç geni, vb.) 293T hücreleri, adenovirüs E1A gen ürünü tarafından dönüştürülmüş bir insan böbrek epitel hücre hattı kullanarak geçici bir transfeksiyon protokol tarafından üretilir. Kolayca ulaşılabilir% 50-80 transfeksiyon verimliliği kadar 293 hücreler, kalsiyum fosfat (Capo 4) yüksek transfectable olağandışı bir özelliği var . Burada, ilgi onkogen ve ambalaj Bu durumda kat veya PCL, yapıları tek genom EcoPak plazmid gibi gag-pol-env ambalaj fonksiyonları, ifade eden bir plazmid ifade retroviral vektör ile 293 hücreleri transfect ortak. Ilk transfeksiyon daha klorokin kullanımı artırıldı. Ecotropic virüs Hisse Senetleri, kültür süpernatant 48 saat olarak toplanır. post-transfeksiyon, C ° -80 saklanan ve dönüşüm görünümünde ve in vitro çalışmalardan sonra fare modeli nakli için kullanılabilir hücre hatları, ya da, fare kemik iliği hücreleri gibi birincil hücreleri, enfeksiyon için kullanılır. .
Protocol
- 3-5x10 6 hücre / 6 cm doku cultureplate dönüşümü, plaka 293T hücreleri önce akşam.
Not: Biz transfeksiyon ve efficacyas virüs üreten hücrelerin kendi kolaylığı için 293T hücreleri kullanır. Bu hücreler, plazmid bir yardımcı tanıtıldı sürece virüs ambalaj eksikliği vardır .
- Sabah ilk, orta hafifçe kaldırın ve 4 ml 293T hücre med 25 mM Klorokin içeren değiştirin. 1 saat için kuvöz koyun.
Not: plaka konfluent yaklaşık% 80 olmalıdır.
- Bu arada, 5 ml tüpler, bir seferde 2 plakaları için virüs yapımı karışımının hazırlanması:
- 2 x 10 mg retroviral plazmid inşa
- 2 x 5 mg ambalaj inşa (EcoPak)
- 2 x 62 ml CaCl
- 1 ml steril GKD 2 O ile tamamlamak
Not: retroviral plazmid faiz ve bir işaretleyici onkogen kodlar, EcoPak gag-pol-env kodlar. 293T hücreleri ile birlikte, bir fare hücreleri için spesifik ecotropic retrovirüs (RV), ama insan hücreleri için enfektif üretecektir. Klorokin ve CaCl 2 transfeksiyon verimliliği artırmak için gösterilmiştir.
- 2x sterileHBS 1ml ise tüp hafifçe karıştırın, karışımın açılan akıllıca ekleyin.
- Hemen hafifçe 2 tabak, her biri 1 ml, bu çözümü eklemek damla bırak.
- 7 ila 11 saat için kuvöz koyun.
- Akşam (7 ila 11 saat sonra), yavaşça orta kaldırmak ve çok yavaşça 5 ml taze 293T orta ile değiştirin. , Ertesi gün öğlene kadar kuvöz koyun.
Not: Bu adım, hücrelerin klorokin çıkarmak için ihtiyacınız olan önemlidir. Uzun süre devam ederse, klorokin toksiktir. Plakalarda çözüm transfeksiyon karışımı çok ince bir toz gibi yağış nedeniyle, bulanık görünüyor.
Not: klorokin duyarlı hücreler olan ve plakası kolayca ayırmak gibi, aşırı yumuşaklığı ile tüm medya değişiklikleri yapmak önemlidir.
- Ertesi gün, 18 ila 24 saat. Öğleyin) virüsü (almadan önce, hafifçe orta kaldırmak ve çok nazikçe 3 ml taze 293T orta ile değiştirin. Inkübatör O / N değiştirin.
- Üçüncü sabah (18 ila 24 saat sonrası), yavaşça, 18 G iğne ile donatılmış 10 ml şırınga ile orta formu plakaları emmek. Bu süpernatant retrovirüs içerir.
- ,, 45 mm şırınga filtre iğne, şırınga iyi çözüm karıştırmak için birkaç kez ters filtre ile süpernatant geçmek ve cryotubes içinde kısım
Not: Alternatif olarak, 5 0 ml konik tüp içine virüs, havuz aynı virüs tüm süpernatantlar 3 + plaka yapıyoruz. Cryotubes retrovirüs içeren kısım süpernatantlar filtreleyerek, sonra iyice karıştırın.
- Virüs dolu süpernatantlar içeren tüpler -80 ° C'ye kadar içinde tutulur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dört kritik noktaları iyi bir virüs stokunun başarısını temin edecektir:
- 293T üreten hücrelerin bir yoğunluk ulaşmak olduğunu, bu yüzden, çok düzenli olarak bölünmüş olan, yani çok sağlıklı olmak için büyümüş asla ve 6 cm doku kültürü plaka başına 3.5-5 milyon optimize yoğunlukta kaplama transfeksiyon sabahı plaka% 80.
- Hücre lysozomes stabilize ve çekirdeği ulaşır DNA kesir artırarak, 5-kat klorokin eklenmesi yaklaşık 3 transfeksiyon verimliliği ve daha sonraki bir virüs titresi geliştirir. Sodyum butirat (başka lizozom sabitleyici) de bu amaçla kullanılmıştır. Klorokin değişen orta 7-11 saat bu durumda, ihmal edilebilir. Bu noktada post-transfeksiyon gerekli değildir.
- DNA kalitesi çok önemlidir. Vektör ve ambalaj plazmid DNA'lar hem de arıtma tercih edilen yöntem iki kez CSCL etidyum bromür batmaz yoğunluğu santrifüj arındırılır. Biz en az 1 mg / ml DNA konsantrasyonu ve OD 260/280 oranı 1,75-1,90 arasında olmalıdır. Qiagen-saflaştırılmış DNA yazarların elinde, sonuçlar iyi değildir, her ne kadar çalışacaktır. DNA çözümleri kombine hacimli kalsiyum fosfat çökelti Tris ve EDTA (TE) olumsuz etkilerini önlemek için (<50 ul toplam son ml'de) küçük olması önemlidir.
- Ambalaj inşa retroviral vektör ve host aralığı seçimi önemlidir. Myeloproliferatif sarkomu virüsü dayalı bir vektör fare hematopoietik kök hücreler istikrarlı bir ifade için, tercih edilir. Ortak bir vektör omurgası MPSV uzun bir terminali Tekrar dizisi, bir onkogen tanıtımı için bir çok klonlama sitesi ve gelişmiş yeşil flüoresan protein (eGFP) gen ile bağlantılı bir alt-iç ribozom giriş yeri içeren, MIG RI. Fare HSC, virüs transdüksiyon için ecotropic konak aralığı en iyi, ancak hisse senetleri fizyolojik sıcaklığında kararsız ve santrifüj konsantre olamaz.
Bazı kontrol noktaları: İsterseniz, bir kez hasat, 293 hücreleri retroviral vektör (örneğin, TK) tarafından kodlanan proteinlerin ekspresyonu kontrol etmek için immunoblotting protein lizatları yapmak için kullanılan olabilir. Ayrıca biz diğer plakaları süpernatant toplarken transfeksiyon efficinecy beta-gal testi ile kontrol etmek için ayrı tabak transfeksiyon zaman (ambalaj vektör gerekli) plazmid bir LacZ kodlama kontrolü kullanabilirsiniz. Not: Bu virüs yapmak için kullanılan plazmid kalitesini hücreleri ve reaktifler test, ama olmaz.
Herhangi bir virüs kullanmadan önce, titresi tespit edilmesi gerekmektedir. Bu, aynı deneyi farklı virüs stokları, titreleri maç ve sipariş hematopoietik kök hücrelerin etkili transdüksiyon sağlamak için kritik öneme sahiptir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 293T cells | cell-line | Split 1:3 to 1:4 every 3 days, otherwise they will tend to clump with replating and will not transfect as well. | ||
| 293T cell medium | DMEM/hi-glu + 10 % FBS + 1% Pen/Strep + 1% L-Glutamine (1% NEAA, optional). We obtain our tissue culture slutions from CellGro. | |||
| coding DNA plasmid | Twice purified by CsCl. MSCV backbone, encoding oncogene and marker of choice (Neo, GFP, etc.) | |||
| EcoPak | also called pMCV-Ecopac: ecotropic packaging plasmid, encoding gag-pol-env | |||
| 2x HBS | For 500 ml: 8.0 g NaCl+ 0.37 g KCl + 106.5 mg Na2HPO4 (anhydrous; 201.1 mg if 7xH2O) + 1.0 g dextrose (D-glucose) + 5.0 g HEPES powder. Dissolve in 450 ml dH2O (milli-Q), adjust pH to 7.05 with NaOH, then complete to 500 ml with dH2O. Sterile filter thru 0.45 μ filter. Store at room temperature, with the cap on tight. | |||
| 2M CaCl2 | Sigma-Aldrich | |||
| miliQ H2O | sterile-filtered | |||
| Chloroquine | 1000x stock is 25 mM in PBS- (w/o Ca2+/Mg2+), stored at -20C. Add fresh to the medium when needed. | |||
| 6 cm plates | for tissue culture | |||
| Incubator | for tissue culture. Set at 37C, 10% CO2. | |||
| 10 cc sterile syringes | Sterile. One per virus type. | |||
| 18G needles | single use, one per virus type. | |||
| 45 um syringe filters | ||||
| 5 ml plastic tubes | Sterile, to mix transfection solution, for up to 2 plates at a time (2 ml). We use Falcon tubes. | |||
| 50 ml conical tubes | ||||
| cryovials | 2 and 4 ml, for virus aliquots. | |||
All reagents used in the transfection must be sterile-filtered (CaCl2, 2x HBS, miliQ H2O) and kept sterile. |
||||
References
- DuBridge, R. B., Tang, P., Hsia, H. C., Leong, P. M., Miller, J. H., Calos, M. P. Analysis of mutation in human cells by using an Epstein-Barr virus shuttle system. Mol Cell Biol. 7, 379-387 (1987).
- Cherry, S. R., Biniszkiewicz, D., van Parijs, L., Baltimore, D., Jaenisch, R. Retroviral expression in embryonic stem cells and hematopoietic stem cells. Mol Cell Biol. 20, 7419-7426 (2000).
- Finer, M. H., Dull, T. J., Qin, L., Farson, D., Roberts, M. kat: A high-efficiency retroviral transduction system for primary human T lymphocytes. Blood. 83, 43-50 (1994).
- Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. J Virol. 70, 5701-5705 (1996).
- Pear, W. S., Miller, J. P., Xu, L., Pui, J. C., Soffer, B., Quackenbush, R. C., Pendergast, A. M., Bronson, R., Aster, J. C., Scott, M. L., Baltimore, D. Efficient and rapid induction of a chronic myelogenous leukemia-like myeloproliferative disease in mice receiving P210 bcr/abl-transduced bone marrow. Blood. 92, 3780-3792 (1998).
- Pear, W. S., Nolan, G. P., Scott, M. L., Baltimore, D. Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection. Proc Natl Acad Sci USA. 90, 8392-8396 (1993).
- Stocking, C., Kollek, R., Bergholz, U., Ostertag, W. Long terminal repeat sequences impart hematopoietic transformation properties to the myeloproliferative sarcoma virus. Proc Natl Acad Sci USA. 82, 5746-5750 (1985).
- Van Etten, R. A. Models of chronic myeloid leukemia. Curr Oncol Rep. 3, 228-237 (2001).
- Van Etten, R. A. Studying the pathogenesis of BCR-ABL+ leukemia in mice. Oncogene. 21, 8643-8651 (2002).
