Summary
この手法は、人間の癌遺伝子をコードし、その後マウスモデルにおける骨髄増殖性疾患の誘発に使用される。複製欠損レトロウイルス株を準備する効率的な方法を示します
Abstract
Bcr - Ablタンパクまたは成長因子受容体由来の癌遺伝子（ZNF198 - FGFR1、BCR -PDGFRα、等）などのがん遺伝子により誘導される私たちの研究室の研究は人間の骨髄増殖性疾患。我々は以前に興味の癌遺伝子を発現するレトロウイルスを感染させた骨髄細胞を移植することにより、私たちのマウスモデルにおける人間のような疾患をモデル化し、勉強することができます。複製欠損レトロウイルスは、ヒトの癌遺伝子をコードするとマーカー（GFP、RFP、抗生物質耐性遺伝子など）は、293T細胞を用いた一過性トランスフェクションプロトコル、アデノウイルスE1A遺伝子産物で形質転換ヒト腎上皮細胞株によって産生される。 293細胞は容易に達成可能な最大50-80％のトランスフェクション効率と、リン酸カルシウム（CAPO 4）による高transfectableという異常な性質を持っている。ここで、我々はそのような単一ゲノムのパッケージングは、プラスミドEcoPakこのケースでは、KATまたはPCLを構築する。のようなギャグ- POL - envの包装の機能を、表現する関心の癌遺伝子の発現レトロウイルスベクターとプラスミドとの293細胞トランスフェクションのCO最初のトランスフェクションは、さらにクロロキンの使用により改善される。エコトロピックウイルスの株は、培養上清48時間として収集。トランスフェクション後、-80℃で保存し、変換の観点及びin vitro試験セルの行、またはそのようなし私たちのマウスモデルで移植に使用できるマウスの骨髄細胞などの初代培養細胞の感染に使用することができる。
Protocol
- 変換前の夕方、3 × 10 6セル/ 6 cmの組織cultureplateでプレート293T細胞。
注：私たちは、トランスフェクションとefficacyasウイルス産生細胞の容易さのために293T細胞を使用する。ヘルパープラスミドが導入されていない限り、これらの細胞は、ウイルスのパッケージングに不足しています。
- 最初の朝、穏やかに培地を除去し、4ミリリットル293T細胞MEDは、25mMのクロロキンを含むと交換してください。 1時間インキュベーターに入れ。
注：プレートは、約80％コンフルエントになるはず。
- 一方、5 mlのチューブに、一度に2枚のためにウイルス意思混合物を準備します。
- 2 × 10mgのレトロウイルスプラスミド構築
- 2 × 5 mgのパッケージング構造（EcoPak）、
- 2 × 62ミリリットルのCaCl
- 無菌のddH 2 Oで1 mlに完了
注：レトロウイルスプラスミドは、関心とマーカーの癌遺伝子をコードしている間、EcoPakはギャグ- POL - envをコードしている。一緒に293T細胞で、彼らはエコトロピックマウスの細胞に特異的なレトロウイルス（RV）が、ヒト細胞の感染を生成します。クロロキンおよびCaCl 2の両方は、トランスフェクション効率を高めることが示されている。
- 2倍sterileHBS 1mlの軽くチューブをボルテックスしながら、混合物に滴下を追加。
- すぐに2プレート、1mlのそれぞれにこのソリューションを追加し、穏やかに、ちょぼちょぼ。
- 7〜11時間インキュベーターに入れ。
- 夕方（7〜11時間以降）で、静かに培地を除去し、非常に穏やかに5 mlの新鮮な293T培地と交換してください。次の日、正午までインキュベーターに入れて。
注：このステップは、細胞からクロロキンを離陸する必要があるとして、重要である。長期間保管する場合、クロロキンは毒性があります。プレートのソリューションは、トランスフェクション混合物の非常に微細な、ほこりのような析出による、ファジーに見える。
注：これは、細胞がクロロキンによって感作されているように、極端な優しさを持つすべてのメディアの変更を行うことが重要である、と簡単にプレートから切り離すことができます。
- 翌日、18〜24時間。 （正午前後）ウイルスを取得する前に、静かに培地を除去し、非常に穏やかに3ミリリットル新鮮293T培地と交換してください。インキュベーターO / Nに置き換える
- 第三朝（18〜24時間以降）は、静かに18 Gの針を備えた10mlの注射器で中程度のフォームプレートを吸い上げる。この上清は、レトロウイルスが含まれています。
- 、45 mmのシリンジフィルターに針を変更し、溶液を混ぜてシリンジを数回反転させ、フィルターを介して上清を渡して、そしてクリオチューブに分注し
注：代わりに、5 0 mlのコニカルチューブにウイルス、プールの3 +板同じウイルスのすべての上清を作っている。フィルタリングすることにより、クリオチューブにレトロウイルスを含むアリコート上清はその後、よく混ぜる。
- 使用するまで含有するチューブは、ウイルスの完全な上清を-80℃に保存されています。
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Discussion
4つの重要な点は良いのウイルス株の成功が保証されます。
- 293T産生細胞は、それらは非常に定期的に分割されている意味、非常に健康的である必要は草に覆われたことはなかった、と彼らは密度に到達するように、6 cmの組織培養プレートあたり3.5から5000000の最適化された密度でプレーティングされていますプレートの80％のトランスフェクションの朝に。
- セルlysozomesを安定化し、核に達するDNAの割合を増加させることにより、5倍に - クロロキンの添加は、約3トランスフェクション効率と、その後のウイルス力価を、向上させます。酪酸ナトリウムは、（別のリソソーム安定剤）もこの目的のために使用されています。クロロキンは、培地7月11日時間を変更している場合には、省略することができます。この時点で、トランスフェクション後は不要です。
- DNAの品質は非常に重要です。ベクトルおよびパッケージングプラスミドDNAの両方の精製の好ましい方法は、二回塩化セシウム - エチジウムブロマイド浮遊密度遠心法で精製する。我々は、DNAの濃度は少なくとも1 mg / mlのになりたい、とODの280分の260の比は1.75から1.90の間でなければなりません。著者の手に、結果は心配ない、が、キアゲン精製DNAはまた、動作します。それは、DNA溶液の合計量は、リン酸カルシウム沈殿物でトリスとEDTA（TE）の悪影響を避けるために、（最後のml当たり<50 ULの合計）に小さいことが重要である。
- 包装構造のレトロウイルスベクターと宿主範囲の選択が重要です。マウス造血幹細胞の安定発現のために、骨髄増殖性肉腫ウイルスに基づくベクターが好ましい。一般的なベクター骨格には、MIG RIです、MPSV長い末端反復配列、癌遺伝子の導入のためのマルチクローニング部位、および強化された緑色蛍光タンパク質（EGFP）の遺伝子にリンクされている下流の内部リボソーム侵入部位を含む。マウスのHSCの伝達のために、エコトロピック宿主域を持つウイルスが最適ですが、そのような株は、生理的温度で不安定であり、遠心分離によって濃縮することができます。
いくつかのチェックポイント：必要に応じて、一回収穫、293細胞は、レトロウイルスベクター（例えば、TK）によってコードされるタンパク質の発現を確認するにはイムノブロッティング用蛋白質の溶解を行うために使用することができます。当社はまた、他のプレートの上清を収集するときにβ- galアッセイによってトランスフェクションefficinecyをチェックするためにトランスフェクションの時間（何パッケージングベクターは不要）で別々のプレートでのプラスミドのLacZのエンコード制御を使用してください。注：これは細胞と試薬ではなく、ウイルスの製作に用いられたプラスミドの品質をテストする。
すべてのウイルスを使用する前に、力価を決定する必要があります。これは、同じ実験で、異なるウイルス株の力価と一致するように、と造血幹細胞の効率的な伝達を確実にするために重要です。
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 293T cells | cell-line | Split 1:3 to 1:4 every 3 days, otherwise they will tend to clump with replating and will not transfect as well. | ||
| 293T cell medium | DMEM/hi-glu + 10 % FBS + 1% Pen/Strep + 1% L-Glutamine (1% NEAA, optional). We obtain our tissue culture slutions from CellGro. | |||
| coding DNA plasmid | Twice purified by CsCl. MSCV backbone, encoding oncogene and marker of choice (Neo, GFP, etc.) | |||
| EcoPak | also called pMCV-Ecopac: ecotropic packaging plasmid, encoding gag-pol-env | |||
| 2x HBS | For 500 ml: 8.0 g NaCl+ 0.37 g KCl + 106.5 mg Na2HPO4 (anhydrous; 201.1 mg if 7xH2O) + 1.0 g dextrose (D-glucose) + 5.0 g HEPES powder. Dissolve in 450 ml dH2O (milli-Q), adjust pH to 7.05 with NaOH, then complete to 500 ml with dH2O. Sterile filter thru 0.45 μ filter. Store at room temperature, with the cap on tight. | |||
| 2M CaCl2 | Sigma-Aldrich | |||
| miliQ H2O | sterile-filtered | |||
| Chloroquine | 1000x stock is 25 mM in PBS- (w/o Ca2+/Mg2+), stored at -20C. Add fresh to the medium when needed. | |||
| 6 cm plates | for tissue culture | |||
| Incubator | for tissue culture. Set at 37C, 10% CO2. | |||
| 10 cc sterile syringes | Sterile. One per virus type. | |||
| 18G needles | single use, one per virus type. | |||
| 45 um syringe filters | ||||
| 5 ml plastic tubes | Sterile, to mix transfection solution, for up to 2 plates at a time (2 ml). We use Falcon tubes. | |||
| 50 ml conical tubes | ||||
| cryovials | 2 and 4 ml, for virus aliquots. | |||
All reagents used in the transfection must be sterile-filtered (CaCl2, 2x HBS, miliQ H2O) and kept sterile. |
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References
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