Low-Density hipocampo Cultura Neuron primária

Summary

Este artigo descreve o protocolo para a cultura de baixa densidade neurónios do hipocampo primárias que crescem em lamelas de vidro invertida sobre uma monocamada de células gliais. As camadas neuronais e gliais são separados por contas de cera de parafina. Os neurónios cultivados por este método são adequados para imagiologia óptica de alta resolução e ensaios funcionais.

Abstract

A capacidade para sondar a estrutura e fisiologia das células nervosas individuais na cultura é crucial para o estudo da neurobiologia, e permite flexibilidade na manipulação genética e química de células individuais ou redes definidos. Tal facilidade de manipulação mais simples no sistema de cultura reduzida quando comparada com o tecido cerebral intacto. Enquanto existem muitos métodos para o isolamento e o crescimento destes neurónios primárias, cada uma tem as suas próprias limitações. Este protocolo descreve um método para a cultura de baixa densidade e de alta pureza de roedores neurónios do hipocampo embrionárias em lamelas de vidro, que depois são suspensas sobre uma monocamada de culas gliais. Esta 'cultura sanduíche' permite o crescimento exclusivo de longo prazo de uma população de neurônios, permitindo simultaneamente para suporte trófico da monocamada glial subjacente. Quando são neurónios de idade suficiente ou nível de maturidade, as lamelas de neurónios pode ser virado para fora-do prato da glia e utilizado em imagiologia ou ensaios funcionais. g neuróniosrown por este método normalmente sobreviver por várias semanas e desenvolver mandris extensos, as conexões sinápticas, e propriedades de rede.

Introduction

O cérebro está organizado em redes complexas de neurônios. A contribuição de neurónios individuais para a actividade de rede e função do cérebro pode ser estudada por alteração selectiva da sua composição molecular e perturbação das suas propriedades fisiológicas. A manipulação genética e química de neurónios individuais é sem dúvida mais fácil em neurónios cultivados do que em tecido cerebral intacto, livre de heterogeneidade celular deste último e complexidade. Os neurónios em cultura desenvolver axonal bem definida e mandris dendríticas e formar muitas ligações sinápticas uns com os outros.

Enquanto neurónio cultura de animais adultos ou de outras regiões do sistema nervoso é possível, culturas do hipocampo de embriões são frequentemente preferidos devido à sua população de células piramidais definida e relativamente baixa densidade glial ^{1, 2.} neurónios do hipocampo cultivados a baixa densidade em cultura são particularmente amenable para o estudo da localização sub-celular, o tráfico de proteína, polaridade e desenvolvimento neuronal sinapse. Os neurónios em cultura também têm sido extensivamente empregues no estudo dos processos moleculares na plasticidade sináptica ^{3, 4, 5, 6.} Preparações de cultura Neuron de ratinhos com deleções genéticas globais que não sobrevivem após o parto têm sido especialmente útil no estudo de funções celulares e sinápticos de certos genes ^7.

Tal como no cérebro, os neurónios do hipocampo em cultura são dependentes do suporte trófico de células gliais. Isso complica a sua cultura, e tem levado ao desenvolvimento de vários métodos diferentes por que este apoio é fornecido. Um método vulgarmente utilizado envolve plaqueamento neurónios directamente numa monocamada de células gliais ^8, ou que permitam que as células gliais de contaminantes a partir do Hipp adquiridatecido ocampal para proliferar e formar uma monocamada por baixo dos neurónios ^9. Enquanto este método tem encontrado algum sucesso, a impureza da cultura neuronal resultante é desvantajoso para experiências de imagiologia. Outro método vulgarmente utilizado de neurónio cultura é deixar-fora do alimentador glial camada completamente, e em vez disso proporcionam suporte trófico sob a forma de um meio de crescimento definido ^10.

Aqui, descrevemos o "sanduíche" ou método "Banker" do neurônio cultura ^{2, 11.} Este método envolve o plaqueamento os neurónios do hipocampo em lamelas de vidro, que depois são suspensas sobre uma monocamada de células gliais separados por contas de cera de parafina. Isto facilita a cultura de longo prazo de uma população homogénea de neurónios sem contaminar as células da glia, permitindo simultaneamente para suporte trófico da monocamada subjacente glia. Quando são neurónios de idade suficiente ou nível de maturidade,as lamelas dos neurónios pode ser virado para fora-do prato da glia e utilizado em imagiologia ou ensaios funcionais.

Protocol

Todos os experimentos e protocolos que utilizam animais de laboratório foram aprovados pela Universidade de Manitoba comitê de ética animal e estavam em conformidade com as diretrizes do Canadian Council on Animal Care.

1. Preparação de Instrumentos, Tampões e Soluções

1. Esterilizar por autoclavagem de todos os equipamentos de dissecção, pipetas de Pasteur de vidro, pontas de pipetas, aparelho de filtro, e água desionizada.
2. Prepara-se uma a 20% (w / v; 1,1 M) uma solução de glucose estoque em água desionizada e filtra-se a esterilizar. Armazenar a 4 ° C.
3. Prepara-se uma solução de piruvato de sódio 100 mM em água desionizada e filtra-se a esterilizar. Armazenar a 4 ° C.
4. Prepare a Solução Salina Equilibrada de cálcio e magnésio livre de Hank (CMF-HBSS) por preparação de uma solução de 10% de HBSS (10x), HEPES a 10 mM, e 100 U / mL de penicilina-estreptomicina, em água desionizada. Armazenar a 4 ° C durante não mais do que 1 a 2 meses.
5. Prepare a 10 mg / mL de desoxirribonuclease I (ADNase) em CMF-HBSS,e em seguida filtrar-esterilizar e armazenar a -20 ° C.
6. Preparar o meio da glia por preparação de uma solução de glicose a 30 mM (a partir da solução estéril), 95 U / mL de penicilina-estreptomicina, e soro de crescimento bovino de 10-15% (BGS) em Meio Essencial Mínimo (MEM).
   NOTA: Como indicado no protocolo, uma solução de 5% BGS pode ser usado, se necessário para retardar a proliferação das células. Soro de Cavalo pode ser usado em vez de BGS, mas notar que cada lote deve ser verificada antes da utilização, devido à variação inter-lote. Armazenar a solução preparada a 4 ° C durante não mais do que 1 a 2 meses. Embora muitos laboratórios usam FBS, observou-se consistentemente que o crescimento glial na BGS é tão robusto como em FBS. BGS é derivado a partir de soro de vitela fetal, que é suplementado com componentes quimicamente definidos. Além disso, BGS é substancialmente mais económica do que FBS.
7. Prepara-se o crescimento do neurónio e meio de manutenção (Neurobasal-B27, NBG) por preparação de uma solução de 1x suplemento B27 e 0,5 mM de L-glutamina em 500 ml Neurobasal Medium. Armazenar a 4 ° C durante não mais do que 1 a 2 meses. L-glutamina pode ser substituído com Glutamax, que tem sido sugerido para ser mais estável no meio de crescimento.
8. Prepara-se o neurónio plaqueamento médio por preparação de uma solução de glicose a 30 mM (a partir da solução estéril), piruvato de sódio 1 mM (a partir da solução estéril), e 10% BGS em MEM. Armazenar a 4 ° C durante não mais do que 1 a 2 meses.
9. Prepara-se uma solução de 1 mM de citarabina (Ara-C) e filtra-se a esterilizar. Aliquota em porções de 1 ml e armazenar a -20 ° C.
10. Prepara-se uma solução de APV 100 mM em NaOH 100 mN filtro-esterilizado. Armazenar a -20 ° C.
11. Dissolve-se 1 mg / mL de poli-L-lisina em tampão de borato, pH 8,5 (ácido bórico 50 mM e borato de sódio 12 mM) e filtro a esterilizar. Alíquotas e armazenar a -20 ° C. Em vez de poli-L-lisina, pode-se utilizar a poli-L-ornitina, que podem ser menos tóxicos para as células.

2. Preparação Cultura Glia

1. Prepare a cultura de células astróglia cortical
   1. Pulverizar as crias com 70% de etanol e decapitar-los.
   2. Coloque as cabeças em uma placa de 100 mm no gelo contendo 15 mL de CMF-HBSS.
   3. Dissecar cada cérebro através do corte do couro cabeludo, a abertura do crânio, cortando o tronco cerebral, e então transferindo o cérebro para 60 mm de placas de Petri em gelo contendo 3 mL de CMF-HBSS.
   4. Separa-se os hemisférios cerebrais do hipocampo e em seguida retiram as meninges circundantes eles. Exercer as devidas precauções para garantir contaminação mínima a partir de fibroblastos meninges. fibroblastos meninges na cultura pode competir com glia para o crescimento e ser prejudicial para o neurônio saúde. Recolher todos os hemisférios cerebrais em um prato de 60 mm Petri sobre gelo contendo 5 mL de CMF-HBSS.
   5. Remova a CMF-HBSS e depois picar o tecido cortical coletadas tão finamente quanto possível, utilizando micro-dissecando primavera-tesoura.
   6. Adicionar suficiente CMF-HBSS para o choptecido ped. Usando uma pipeta de pasteur de vidro, transferir os pedaços de tecido para um tubo de 15 mL. Levar o volume total a 12 ml por adição de CMF-HBSS.
   7. Adicionar 1,5 mL de cada vez de 2,5% de tripsina e 10 mg / mL de solução de DNase. Incubar a mistura resultante a 37 ° C num banho de água durante 12 min.
   8. Tritura-se o tecido de 10-15 vezes utilizando uma pipeta de Pasteur de vidro, e incuba-se ainda mais num banho de água a 37 ° C durante 3 min.
   9. Filtra-se o sobrenadante através de papel de lentes, ou uma malha de filtro para um tubo de 50 mL contendo 5 mL de BGS. Isto é feito para remover pedaços de tecido não dissociado. Alternativamente, usar filtros celulares disponíveis comercialmente.
   10. Adicionar 13,5 mL de CMF-HBSS e 1,5 mL de 2,5% de tripsina para o tubo contendo os pedas de tecido remanescentes e incubar ainda mais a 37 ° C num banho de água durante um adicional de 10 min.
   11. Tritura-se o restante tecido mais uma vez, e depois filtra-se a suspensão outra vez para dentro do tubo de 50 mL contendo o filtrado inicial. Em seguida, enxaguar a lepapel ns com 3 mL de BGS. O volume final deve ser de aproximadamente 38 ml.
   12. Centrifugar a suspensão contendo as células gliais dissociadas durante 6 minutos a 130 x g. Cuidadosamente descarte do sobrenadante utilizando uma pipeta Pasteur de vidro. Certifique-se que as células peletizadas na parte inferior não sejam perturbados. A parte inferior do pelete aparece ligeiramente avermelhada contendo componentes do sangue.
   13. Transferir as células gliais em 1 ml de meio da glia para um tubo fresco, tendo o cuidado de não perturbar a porção avermelhado do pelete.
   14. Adicionar-se a 2 mL de meio de glial por cachorro para ressuspender o combinado dissociadas de células da glia. Por exemplo, foram usadas se 10 filhotes, e, em seguida, o volume total de ressuspensão seria de 20 mL.
   15. Preparar um frasco de cultura celular de 75 ^cm2 por filhote. Adicionar 18 mL de meio glial pré-aquecido a cada frasco.
   16. Transferência de 2 ml de suspensão de células em cada balão e incubar em 37 ° C, 5% de _CO2.
   17. Após um dia, substituir com 20 mL glial medium. Nesta fase, a cultura é uma mistura de glial e outros tipos de células indesejadas.
   18. Quatro dias após a semeadura das células, agitar vigorosamente os frascos para desalojar as células não-astrócitos. Para fazer isso, lavar os balões uma vez com CMF-HBSS, e, em seguida, adicionam-se 10 ml fresco CMF-HBSS a cada frasco. Agitar vigorosamente os frascos de 5-10 vezes, e em seguida, aspirar para fora da CMF-HBSS. Lavar duas vezes com CMF-HBSS, e, em seguida, adicionar 20 mL de meio de glial.
       NOTA: Este passo é crucial para assegurar a remoção de tipos de células não-alvo, e não deve resultar na perda dos astrócitos desejados.
   19. Substituir com meio glial fresco duas vezes por semana até que as células estão confluentes (Figura 1).
2. congelamento glia
   1. Uma vez que as culturas são confluentes, aspirar fora o meio e lava-se a monocamada de células com 10 mL de CMF-HBSS.
   2. Adicionar 10 mL de 0,25% de tripsina / EDTA a cada bal e incubar a 37 ° C durante 3 min.
   3. Toque em frascos suavemente para desalojar as células. Adicionar 1 mL BGS tO cada balão e transferir as suspensões de células em tubos de 15 mL.
   4. Centrifugar os tubos a 130 xg durante 6 minutos. Descartar o sobrenadante resultante.
   5. Ressuspender o sedimento celular em 2 ml de meio glial.
   6. Prepara-se o meio de congelação da glia (dimetilsulfóxido 1-parte e 4 partes BGS). Adicionar 0,5 mL desta solução a cada uma de 4 frascos criogénicos por frasco.
   7. Transferir 0,5 mL da suspensão de células de cada frasco, e, em seguida, congelar as células lentamente colocando os frascos em um recipiente isolado em um congelador a -80 ° C durante a noite. Após um dia, transferir os tubos de ensaio para um congelador de azoto líquido para o armazenamento a longo prazo.
3. Chapeamento reviveu glia
   1. glia placa 1-2 semanas antes do dia neurónio cultura.
   2. Preparar um tubo de 50 mL com 10 mL de meio aquecido glial.
   3. Descongelar uma ampola congelada de células da glia em um banho de água a 37 ° C durante 2-3 min.
   4. Transferir o conteúdo do frasco para dentro do tubo de 50 mL contendo 10 mL de meio de glial.
   5. centrífugae o tubo durante 5 min a 130 xg e o sobrenadante aspirado fora.
   6. Ressuspender o sedimento em 20 mL de meio de glial.
   7. Adicionar 3 ml de meio fresco glial a cada um dos pratos de cultura (60 mm), e, em seguida, transferir 1 ml da suspensão de células a cada prato. Incubar as culturas em 37 ° C, 5% de _CO2.
   8. Alimentação das células duas vezes por semana. Se a densidade de células atinge% de confluência 50 bem antes do dia neurónio cultura, mudar para meio contendo 5% de células gliais BGS para retardar a taxa de crescimento da glia. A confluência desejado da monocamada de células gliais para neurónio cultura é de 50% - 70%.
   9. Substituir o meio com meio glial BNG (6 mL / prato) 1-2 dias antes da cultura neurónio.

3. Preparação Lamela

1. Limpeza e preparação de parafina Beads
   1. Submerge lamelas em ácido nítrico concentrado (70% p / p; CUIDADO: altamente corrosivo) e sonicar-los durante 30 min à temperatura ambiente. Outros laboratórios têm found que é benéfico para incubar as lamelas em ácido nítrico a 70% em prateleiras de cerâmica durante 12-24 h à temperatura ambiente em vez disso.
   2. Cuidadosamente descartar o ácido nítrico numa hote química, designada de acordo com as orientações institucionais. Lavam-se as lamelas 3-5 vezes com água desionizada.
   3. Submergir as lamelas em água desionizada e sonicar-los de novo durante 30 min (saltar se a seguir o método alternativo).
   4. Remover a água desionizada e enxaguar as lamelas mais três vezes.
   5. Submergir as lamelas em 50 mL de água desionizada e esterilizá-los por autoclavagem. Alternativamente, esterilizar as lamelas a 225 ° C num forno durante 6 h. Se utilizar esta abordagem alternativa, pule para o passo 3.1.9.
   6. Uma vez autoclavado, transferir as lamelas a uma câmara de fluxo laminar estéril para os passos seguintes.
   7. Remover a água desionizada e enxaguar com 20-30 ml de etanol a 100%.
   8. Adicionar 20-30 mL de etanol a 100% e transferir as lamelas eetanol para uma placa de Petri de 100 milímetros.
   9. Use pinças rombas para transferir lamelas de 60 mm de placas de Petri, 4-5 lamelas por placa, e, em seguida, permitir-lhes secar ao ar, inclinando-se as lamelas de cobertura contra a borda do prato. Uma vez que o etanol se ter evaporado, colocar as lamelas sobre a superfície.
   10. Transferir 10 g de parafina para um frasco de vidro resistente ao calor apropriado. Derreter a parafina e mantê-la a cerca de 150-200 ° C, numa placa quente durante pelo menos 1 h. A temperatura ideal para que a parafina deve ser aquecida pode demorar alguns ajustes. temperaturas não ideais pode levar à dificuldade em produzir o tamanho correto das esferas de parafina. O período de espera após fusão ajuda a garantir que a temperatura consistente em todo o líquido.
   11. Mergulhar uma pipeta de Pasteur, em que a parafina, e, em seguida, rapidamente tocá-lo para três pontos perto da borda de cada lamela (cada local sendo de aproximadamente 120 °). As gotas irá solidificar em pérolas de cerca de 0,3-0,5 mm de altura e 1,0-2,0 mm de diameter e funcionam de modo a proporcionar um espaço entre os neurónios sobre a lamela e a monocamada de células gliais abaixo (Figura 2).
   12. Esterilizar os pratos sob luz UV durante 30 min, e em seguida cobrindo-os com folha de alumínio e armazenar à temperatura ambiente. lamelas preparados podem ser armazenados e utilizados por até um mês. contas de parafina devem ser autorizados a aderir as lamelas por pelo menos uma semana antes do uso. Isso vai impedir que a parafina se desprendam durante os passos restantes do protocolo.
2. As lamelas de revestimento com poli-L-Lisina
   1. Obter placas de Petri contendo lamínulas previamente preparadas com as contas de parafina.
   2. Adicionar 200 ul de poli-L-lisina em tampão de borato para a superfície de cada lamela e deixar a solução sentar sobre as lamelas durante a noite, tapada, à temperatura ambiente. Cubra a mesma superfície que aquele em que as contas de parafina estão situados. Observe que, se devidamente limpo, a poli-L-lisina deve se espalhar facilmentepara cobrir a superfície da lamela.
   3. Após um dia, lava-se as lamelas duas vezes por imersão em água desionizada estéril durante 2 horas de cada vez. Após a lavagem final, substituir a água com 4 ml de meio de plaqueamento neuronal por prato. Note-se que é importante que a superfície das lamelas não ser deixada secar, depois de ter sido revestido com poli-L-lisina.
   4. Colocar as cápsulas contendo lamela em um 37 ° C, 5% de _CO2. As lamelas revestidas devem ser incubadas durante pelo menos 24 h antes do neurónio cultura. Isto é feito para preparar o meio para neurônio cultura.

4. Dissecção do hipocampo e chapeamento Neurônios

1. Obter uma rata grávida (dia embrionário 18-19, tal como medido a partir do dia da descoberta rolhão vaginal) e eutanásia por decapitação anestesiados com isoflurano ou outro método aprovado.
2. Pulveriza-se a parte de baixo do rato com etanol a 70%, e, em seguida, fazer uma incisão da região púbica throurg para a extremidade da cavidade abdominal. Para evitar a contaminação, tomar cuidado para cortar apenas através da pele nesta etapa.
3. Enxaguar os instrumentos de dissecção novamente com etanol a 70%, e, em seguida, cortada através da parede abdominal para expor o útero. Remover os dois cornos uterinos e colocá-los em uma placa de Petri de 100 milímetros estéril.
4. Executar os restantes passos em uma câmara de fluxo laminar. Remover a membrana uterina em torno dos fetos. Decapitar-los e colocar as cabeças em um prato de 100 mm Petri contendo 20 ml CMF-HBSS.
5. Dissecar os cérebros imediatamente e colocá-los em uma placa de 60 mm de Petri contendo 2 mL de CMF-HBSS em gelo. Recolhe apenas 2-3 cérebros por placa para permitir espaço suficiente para o passo seguinte.
6. Sob um microscópio de dissecação deformam as meninges da linha média dos hemisférios cerebrais, e em seguida, dissecar os hipocampos e colocá-los em uma placa de 60 mm de Petri contendo 4,5 mL de CMF-HBSS. Note-se que o hipocampo pode ser distinguido como uma estru em forma de crescentetura na face medial do hemisfério cortical, e é fácil de remover, uma vez que é delimitado lateralmente por um ventrículo.
7. Transferir o tecido do hipocampo recolhido e CMF-HBSS para um tubo de 15 mL. Adicionar 0,5 ml de 2,5% de tripsina, e, em seguida, incuba-se a 37 ° C durante 10 min. A papaína pode ser usado em vez de tripsina porque é mais suave e pode aumentar o rendimento.
8. Suavemente remover a solução de tripsina por uma pipeta de Pasteur, deixando o tecido do hipocampo não perturbada na parte inferior do tubo.
9. Lavar cuidadosamente o tecido duas vezes com 5 mL de CMF-HBSS enquanto incubando-a a 37 ° C durante 5 min. Após a segunda lavagem, levar o volume total de, pelo menos, 5 mL através da adição de um volume suficiente de CMF-HBSS para o tecido. Se existem hipocampos de mais do que 10 filhotes, até 8 mL de CMF-HBSS pode ser adicionado.
10. Prepare duas variantes de pipetas polido-fogo para a dissociação de tecidos. A ponta de uma variante é do diâmetro normal da pipeta mas com arestas smoothened polido ao fogo. A outra variformiga é um com o diâmetro da ponta reduzida a metade. Resumidamente expor a ponta de uma pipeta Pasteur de vidro na diagonal a uma fonte de chama, e depois examinar as pontas das pipetas.
    1. Repetir este passo até que a extremidade da ponta tinha sido smoothened ou o diâmetro tiver sido reduzido. É importante para a prática de encontrar o diâmetro ideal para garantir que o tecido é dissociado para produzir células individuais, sem danificar estas células.
11. Tritura-se o tecido do hipocampo pela primeira vez por cerca de 10 passagens através de uma pipeta de Pasteur de vidro normal, com borda lisa, e, em seguida, mais 5 a 10 passagens através da pipeta com o diâmetro reduzido. O objectivo é a obtenção de uma solução homogénea de células sem ou com muito poucos aglomerados de tecido.
12. Determinar a densidade celular utilizando um hemocitetro ou um contador de células automatizado. Tipicamente, 0,8 a 1,0 milhões de células por pup são obtidos quando hipocampos dos dois hemisférios são combinados.
13. Transferir um volume suficiente da suspensão de células a pratoscontendo lamelas de poli-L-lisina-revestidas em 4 mL de meio de plaqueamento para obter uma densidade de revestimento de 300.000 células por milímetro prato 60. A densidade das células pode variar de 100.000 a 500.000, dependendo da experiência destinada.
14. Após 3-4 h, transferir as lamelas com neurónios ligados aos pratos contendo as células gliais em meio de NBG. Isto deve ser feito de tal modo que o lado no qual foram colocadas as neurónios está voltada para baixo para a camada de células da glia. Adicionar um total de 4-5 lamelas por placa de células da glia.
15. Dois ou três dias após o plaqueamento, adicionar a solução de Ara-C para uma concentração final de 5 uM por prato para parar o crescimento da glia.
16. Alimentar as células, uma vez por semana por substituindo a 2 ml do meio velho com 2,5 mL de meio fresco em cada mamada. O meio é extra adicionado para compensar a evaporação ao longo do tempo, e apenas uma porção do meio é mudado para assegurar um condicionamento consistente do meio pelas células gliais. Estas culturas são tipicamente saudável para pelo menos um mês (A Figura 3). a sobrevivência de neurónios pode ser melhorada pela adição de APV para o meio de cultura para uma concentração final de 100 uM. APV é um antagonista do receptor de NMDA e promove a sobrevivência ao reduzir a excitotoxicidade do glutamato.

Representative Results

Neste método de "sanduíche" de cultura de células nervosas primárias, neurónios do hipocampo (Figura 3) crescem sobre uma camada de células da glia (Figura 1), separados por grânulos de parafina (Figura 2). Isto assegura que os neurónios selectivamente crescer em lamelas de vidro com a contaminação de células da glia mínima, mas receber suporte trófico adequada a partir de células da glia que crescem no prato de cultura de tecidos. Tipicamente, os neurónios podem ser mantidas em cultura durante> 3 semanas e desenvolver extensa arborização com axónios bem desenvolvidos e dendritos identificados pela sua típica dephospho-tau e MAP2 imunocoloração, respectivamente (Figura 4). neurios maduros desenvolver espinhas sinápticas identificados por localização selectiva de marcador pós-sináptica Drebrin1 para estes compartimentos. Estas espinhas sinápticas estão intimamente justaposto a especializações pré-sinápticos, os quais são identificados por sináptica vesícula marcador Synapsin1 imunocoloração. oproximidade dos sítios pré- e pós-sinápticos indica bem desenvolvida e sinapses alinhado correctamente. Estes neurónios primários são bem adequados para estudos funcionais e estruturais de neurónios e sinapses. Estes incluem, mas não estão limitados a, os estudos de transdução de sinal, polaridade neuronal, tráfico subcelular e desenvolvimento sinapse e plasticidade.

Figura 1. A fase de imagens de contraste de culturas gliais feita 1 dia, 7 dias, ou 14 dias após o plaqueamento a partir de glial estoque congelada. Barra de escala, de 500 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Imagens de alta resolução de lamelas de prepared com grânulos de parafina. (A, B) Exemplos de devidamente aplicadas grânulos de parafina. (C, D) Exemplos de grânulos de parafina aplicadas incorrectamente. α: Mais do que um grânulo foi aplicado no mesmo local. β: O talão deixou de ser devidamente situado na lamela. χ: O cordão foi aplicado muito perto do centro da lamela. δ: O grânulo foi demasiado alta. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. As imagens de contraste de fase das fases de desenvolvimento dos neurónios primários em cultura. Barra de escala, de 100 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior do thé figura.

Figura 4. imagens de imunof luorescência de neurónios primários em 17 dias in vitro. Os neurónios foram fixados com formaldeído a 4% e 4% de sacarose em PBS durante 12 min, e em seguida permeabilizadas com 0,25% de Triton X-100 durante 5 min. Após o bloqueio com BSA a 10% em PBS durante 30 min, os neurónios foram incubados durante a noite a 4 ° C com os anticorpos primários aplicados em 3% de BSA em PBS. Os anticorpos primários foram utilizados como se segue: anti-sinapsina I (coelho, 1: 2000), anti-drebrin (IgG1 de ratinho, 1: 8, clone M2F6, hibridoma sobrenadante), anti-MAP2 (galinha policlonal IgY, 1: 5000), e anti-tau-1 (IgG2a de ratinho, 1: 2000, clone PC1C6; reconhece tau desfosforilado). As células foram então lavadas com PBS e incubadas com espécies adequadas-ou anticorpos secundários específicos do isotipo em 3% de BSA em PBS durante 1 h a 37 ° C. Os anticorpos secundários utilizados foram os seguinbaixos: Alexa 488-conjugado anti-IgG2a de ratinho (1: 500), Alexa 568-conjugado anti-coelho (1: 500), Alexa 647-conjugado anti-IgG1 de ratinho (1: 500), e AMCA-conjugado anti-galinha IgY (IgG de burro, 1: 200). Barra de escala, 10 ^ m e 2,5? m, tal como indicado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Enquanto o método "sanduíche" de neurônios a cultura de foi bem descrita em outra parte ^{2, 11,} há várias etapas ao longo do protocolo que são bastante difícil de descrever em texto sozinho, que pode levar à frustração para os investigadores que desejam adotá-lo.

O método pode ser dividido em três grandes fluxos de trabalho: cultura da glia, preparação de lamela e de cultura de neurónios e de manutenção. Cada uma das três preparações são críticos para de alta qualidade neurônio culturas e várias considerações importantes devem ser mantidos em mente. Antes do plaqueamento neurónios, a camada alimentadora glial deverá ser idealmente uma população homogénea de astrócitos e situar-se entre 50-70% de confluência. Isto asseguraria suporte trófico suficiente da camada alimentadora glial. É importante assegurar que a cultura tem astroglial contaminação mínima de outros tipos de células, particularmente da microglia, que são frouxamente attaccélulas HED e arredondadas. Citocinas libertação microglia, que são prejudiciais para neurônio saúde e sobrevivência ^12. O soro de soro, quer de soro de cavalo ou de crescimento de bovino, pode ser variável de lote para lote. triagem cuidadosa de vários lotes de soro deve ser realizada antes de decidir usar um lote específico.

preparação lamela é um passo importante. A qualidade do vidro e o protocolo utilizado na sua limpeza são críticos para os neurónios bem desenvolvidos saudáveis. Se o método está sendo recém-adotado em um laboratório, que valeria a pena testar lamínulas de diversos fornecedores. Para a limpeza das lamelas, alguns laboratórios embeber lamelas em ácido nítrico a 70% para 18-36 h enquanto outros fazê-lo por apenas 1 hora em um sonicador. Um critério importante de lamelas limpas é que a solução de poli-L-lisina devem espalhar-se uniformemente sobre a superfície. Outra consideração importante é que os grânulos de cera de parafina aplicadas para as lamelas devem ser de altura adequada ediâmetro e ser aquecida até à temperatura certa, como descrito no protocolo.

Para a obtenção de neurónios, pode ser hipocampos dissecados a partir de embriões dia 17-19 ratos. Embora dissecção, nesta fase, leva a muito poucas células gliais, proliferação glial pode ser interrompida por adição do agente anti-mitótico Ara-C, após 2-3 dias de cultura. A trituração do tecido do hipocampo tripsinizadas por pontas de pipeta de fogo-polido é crítica para dissociar o tecido em células individuais, sem danificar as próprias células. O meio de crescimento e de manutenção neuronal utilizado neste protocolo é Neurobasal + L-glutamina + suplemento B27. L-glutamina pode ser substituído por GlutaMAX, que é mais estável no meio de cultura. A qualidade do suplemento B27 pode variar de lote para lote, e por isso deve ser testado antes de usar um lote específico para a cultura de longo prazo. Um pobre monte de B27 pode causar neurônios a aglutinar-se. produtos alternativos, tais como GS21 e SM1 foram encontrados para ser bons substitutos para B27.Os neurónios cultivados por mais do que uma semana, devem ser alimentadas com meio fresco a cada semana, em que um terço do meio é substituído a cada semana.

Este método de cultura de células nervosas pode provar inestimável para experiências que dependem de populações neuronais puras, com pouca ou nenhuma contaminação da glia. neurónios de baixa densidade que crescem utilizando este método normalmente sobreviver durante várias semanas com mandris bem desenvolvidas, as conexões sinápticas e propriedades de rede.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection Instruments
Micro Dissecting Scissors	Roboz	RS-5910
Micro Dissecting Spring Scissors	Roboz	RS-5650
Micro Dissecting Spring Scissors	Roboz	RS-5605
Dumont Forceps (#5)	Roboz	RS-5045
Dumont Forceps (#PP)	Roboz	RS-4950
Name	Company	Catalog Number	Comments
Tissue Preparation
Trypsin (2.5%)	Gibco	15-090-046
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25-200-072
Swinnex Filter Holder, 25 mm	EMD Millipore	SX0002500	Used as cell strainer. Assemble first with filter and autoclave
Isoflorane	Pharmaceutical Partners of Canada Inc.	CP0406V2
Hemocytometer	Hausser Scientific	1492
Grade 105 Lens Cleaning Tissue	GE Healthcare	2105-841	Used as cell strainer. Assemble first in filter holder and autoclave
Glass Pasteur pipettes with cotton filter	VWR	14672-412
HEPES (1 M)	Gibco	15-630-080
Hank's Balanced Salt Solution without Calcium, Magnesium, Phenol Red (HBSS, 10x)	Gibco	14-185-052
Glass Pasteur pipettes	VWR	14672-380
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (Dnase)	Sigma-Aldrich	DN25-100mg
Butane bunsen burner	Wall-Lenk Mfg. Co.	Model 65
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Name	Company	Catalog Number	Comments
Tissue Culture
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15-140-122
Petri Dish (100 mm)	Fisher	FB0875712
Petri Dish (60 mm)	Fisher	FB0875713A
Horse Serum	Gibco	16050-122	Can be used in place of BGS, but each lot must be tested due to inter-lot variation. Heat-inactivation of serum is recommended.
Sodium Hydroxide	Fisher Scientific	S318-1
Sodium Pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256
Minimum Essential Medium (MEM)	Gibco	11-095-080
Neurobasal Medium	Gibco	21-103-049
L-Glutamine (200 mM)	Gibco	25-030-081
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061	Can be used in place of L-Glutamine in the NBG medium
Culture Dish (60 mm)	Corning, Inc	353002
Culture Flasks (75 cm^2)	Greiner Bio-One	658170
Cytarabine (Ara-C)	Sigma-Aldrich	C3350000
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Bovine Growth Serum (BGS)	HyClone	SH3054103	Heat-inactivation is recommended before use.
B27 Supplement (50x)	Gibco	17-504-044
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418-100ml
Cryogenic Vials	VWR	89094-806
DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (APV)	Sigma-Aldrich	A5282
Name	Company	Catalog Number	Comments
Coverslip Preparation
Sodium tetraborate decahydrate (borax)	Sigma-Aldrich	B9876-1KG
Poly-L-Lysine Hydrobromide	Sigma-Aldrich	P2636
Histoplast Paraffin Wax	Fisher	22-900-700
Gravity Convection Oven	VWR	89511-404	Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol
Ultrasonic Bath (Sonicator)	Fisher Scientific	15337400
Nitric Acid	Anachemia	62786-460
Ceramic Staining Racks	Thomas Scientific	8542E40	Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol
Coverslips	Glaswarenfabrik Karl Hecht GmbH	1001/18	Manufacturer is very important, as neurons do not adhere well to lower quality glass
Boric Acid	Sigma-Aldrich	B0252
Name	Company	Catalog Number	Comments
Miscellaneous
Sterile Syringe Filters	VWR	28145-477	Used with BD syringe for filter-sterilization
Syringe	BD	302832	Used with VWR sterile syringe filters for fliter-sterilization
Water Bath	Fisher Scientific	15-460-16Q
Inverted Microscope	Olympus	CKX41
15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes	ThermoScientific	339650
50 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes	ThermoScientific	339652