A bassa densità primaria ippocampale Cultura Neuron

Summary

Questo articolo descrive il protocollo per la coltura a bassa densità primari neuroni ippocampali crescono su vetrini invertiti su un monostrato gliale. Gli strati neuroni e gliali sono separati da perline di cera di paraffina. I neuroni coltivati ​​con tale metodo adatto per imaging ottico ad alta risoluzione e saggi funzionali.

Abstract

La capacità di sondare la struttura e la fisiologia delle singole cellule nervose in coltura è fondamentale per lo studio della neurobiologia, e consente flessibilità nella manipolazione genetica e chimica delle singole cellule o reti definite. Tale facilità di manipolazione è semplice nel sistema di coltura ridotta rispetto al tessuto cerebrale intatto. Mentre esistono molti metodi per l'isolamento e la crescita di questi neuroni primari, ognuno ha i suoi limiti. Questo protocollo descrive un metodo per la coltura a bassa densità ed elevata purezza roditori embrionali neuroni dell'ippocampo su vetrini, che vengono poi sospesa su un monostrato di cellule gliali. Questo 'coltura a sandwich' consente esclusiva crescita a lungo termine di una popolazione di neuroni pur consentendo supporto trofico dal monostrato gliale sottostante. Quando i neuroni sono in età sufficienti o livello di maturità, i coprioggetti neuroni possono essere capovolte-out del piatto gliali e usati nell'imaging o saggi funzionali. neuroni grown con questo metodo tipicamente sopravvivere per diverse settimane e sviluppare ampie pergole, connessioni sinaptiche, e le proprietà di rete.

Introduction

Il cervello è organizzato in reti complesse di neuroni. Il contributo dei singoli neuroni per attività di rete e la funzione cerebrale può essere studiato alterazione selettiva della loro composizione molecolare e perturbazione delle loro proprietà fisiologiche. Genetica e chimica manipolazione di singoli neuroni è senza dubbio più facile nei neuroni in coltura che in tessuto cerebrale intatto, libera da eterogeneità cellulare di quest'ultimo e la complessità. Neuroni in coltura sviluppano assonale ben definita e arbors dendritiche e formano estese connessioni sinaptiche con l'altro.

Mentre la cultura neurone da animali adulti o da altre regioni del sistema nervoso è possibile, colture ippocampali embrionali sono spesso preferiti a causa della loro popolazione cellulare piramidale definita e densità relativamente bassa gliale ^{1, 2.} neuroni dell'ippocampo coltivati ​​a bassa densità in coltura sono particolarmente amenable allo studio della localizzazione subcellulare, il traffico di proteine, di polarità neuronale e lo sviluppo delle sinapsi. Neuroni in coltura sono anche stati ampiamente impiegati in studio dei processi molecolari nella plasticità sinaptica ^{3, 4, 5, 6.} Preparati cultura Neuron da topi con delezioni genetiche globali che non sopravvivono dopo la nascita sono stati particolarmente utili nello studio ruoli cellulari e sinaptici di alcuni geni ^7.

Come nel cervello, in coltura neuroni dell'ippocampo sono dipendente dal sostegno trofico dalle cellule gliali. Questo complica la loro cultura, e ha portato allo sviluppo di diversi metodi con cui questo supporto è fornita. Un metodo comunemente usato comporta placcatura neuroni direttamente su un monostrato di cellule gliali ^8, o che consentono cellule gliali contaminanti dal hipp acquisitatessuto ocampal a proliferare e formare un monostrato sotto i neuroni ^9. Mentre questo metodo ha trovato un certo successo, l'impurità della cultura neuronale risultante è svantaggioso per esperimenti di imaging. Un altro metodo comunemente usato di cultura neurone è lasciare-out l'alimentatore gliali strato del tutto, e invece fornire supporto trofico nella forma di un mezzo di crescita definito ^10.

Qui, descriviamo il "sandwich" o il metodo "Banker" della cultura neurone ^{2, 11.} Questo metodo comporta placcatura neuroni ippocampali su vetrini, che vengono poi sospesa su un monostrato di cellule gliali separate da perline di cera di paraffina. Questo facilita coltura a lungo termine di una popolazione omogenea di neuroni senza contaminare glia pur consentendo supporto trofico dal monostrato gliale sottostante. Quando i neuroni sono in età sufficiente o livello di maturità,i coprioggetti neuroni possono essere capovolte-out del piatto gliali e usati nell'imaging o saggi funzionali.

Protocol

Tutti gli esperimenti e protocolli che utilizzano animali da laboratorio sono stati approvati dal comitato etico dell'Università di Manitoba animali ed erano conformi alle linee guida del Canadian Council on Animal Care.

1. Preparazione di strumenti, Tamponi e soluzioni

1. Sterilizzare in autoclave tutte le apparecchiature dissezione, pipette Pasteur in vetro, le punte delle pipette, apparecchio filtrante, e acqua deionizzata.
2. Preparare un 20% (w / v; 1,1 M) soluzione madre di glucosio in acqua deionizzata e filtro-sterilizzare. Conservare a 4 ° C.
3. Preparare una soluzione 100 mM di piruvato di sodio in acqua deionizzata e filtro-sterilizzare. Conservare a 4 ° C.
4. Preparare la soluzione salina bilanciata calcio-magnesio e privo di Hank (HBSS-CMF) facendo una soluzione di 10% HBSS (10x), 10 mM HEPES, e 100 U / ml di penicillina-streptomicina in acqua deionizzata. Conservare a 4 ° C per non più di 1 a 2 mesi.
5. Preparare 10 mg / mL deossiribonucleasi I (DNasi) in CMF-HBSS,e poi filtrare-sterilizzare e conservare a -20 ° C.
6. Preparare mezzo gliale facendo una soluzione di 30 mM glucosio (dalla soluzione sterile), 95 U / ml di penicillina-streptomicina, e 10-15% di siero bovino della crescita (BGS) in Minimum Essential Medium (MEM).
   NOTA: Come indicato nel protocollo, una soluzione di 5% BGS può essere utilizzato, se necessario per rallentare la proliferazione cellulare. Cavallo siero può essere usato al posto di BGS, ma si noti che ogni partita deve essere testato prima dell'utilizzo a causa di variazione inter-lotti. Conservare la soluzione preparata a 4 ° C per non più di 1 a 2 mesi. Anche se molti laboratori utilizzano FBS, abbiamo costantemente osservato che la crescita gliali in BGS è così robusta come in FBS. BGS è derivato da siero di vitello fetale che è integrato con componenti chimicamente definite. Inoltre, BGS è sostanzialmente più economico di FBS.
7. Preparare la crescita neurone e mezzo di mantenimento (Neurobasal-B27, ETE) facendo una soluzione di 1x B27 supplemento e 0,5 mM di L-glutammina in 500 mL Neurobasal Medium. Conservare a 4 ° C per non più di 1 a 2 mesi. L-glutammina può essere sostituito con Glutamax, che è stato suggerito di essere più stabili nel mezzo di crescita.
8. Preparare il neurone placcatura mezzo facendo una soluzione di 30 mM glucosio (dalla soluzione sterile), 1 mM sodio piruvato (dalla soluzione sterile), e il 10% in BGS MEM. Conservare a 4 ° C per non più di 1 a 2 mesi.
9. Preparare una soluzione di 1 mM citarabina (Ara-C) e filtro-sterilizzare. Aliquotare in 1 porzioni ml e conservare a -20 ° C.
10. Preparare una soluzione di 100 mM APV in 100 mN sterilizzata per filtrazione NaOH. Conservare a -20 ° C.
11. Sciogliere 1 mg / ml di poli-L-lisina in tampone borato, pH 8,5 (50 mM di acido borico e 12 mM borace) e filtro-sterilizzare. Aliquotare e conservare a -20 ° C. Invece di poli-L-lisina, si può usare poli-L-ornitina che può essere meno tossico per le cellule.

2. Preparazione Glia Culture

1. Preparare coltura cellulare astroglia corticale
   1. Spruzzare i cuccioli con il 70% di etanolo e di decapitarlo.
   2. Posizionare le testine in un piatto 100 mm su ghiaccio contenente 15 mL CMF-HBSS.
   3. Sezionare ogni cervello tagliando il cuoio capelluto, aprendo il cranio, tagliando il tronco cerebrale, e poi trasferire il cervello a 60 mm di Petri su ghiaccio contenente 3 mL CMF-HBSS.
   4. Separare gli emisferi cerebrali dalla dell'ippocampo e poi spogliare le meningi li circondano. Esercitare precauzioni adeguate per garantire la contaminazione minimo da fibroblasti meningei. fibroblasti meningei nella cultura può competere con glia per la crescita ed essere dannoso per la salute dei neuroni. Raccogliere tutti gli emisferi cerebrali in 60 mm Petri su ghiaccio contenente 5 ml di CMF-HBSS.
   5. Rimuovere la CMF-HBSS e poi tritare il tessuto corticale raccolto più finemente possibile utilizzare molle-forbici micro-dissezione.
   6. Aggiungere sufficiente CMF-HBSS per il tagliotessuti PED. Usando una pipetta Pasteur di vetro, trasferire i pezzi di tessuto in una provetta da 15 ml. Portare il volume totale di 12 ml con l'aggiunta di CMF-HBSS.
   7. Aggiungere 1,5 ml ciascuna del 2,5% tripsina e 10 mg / mL di soluzione DNasi. Incubare la miscela risultante a 37 ° C a bagnomaria per 12 min.
   8. Triturare il tessuto 10-15 volte usando una pipetta Pasteur di vetro, e in seguito incubare in un bagno d'acqua a 37 ° C per 3 min.
   9. Filtrare il surnatante con foglio lente o una rete filtrante in una provetta da 50 ml contenente 5 ml di BGS. Questo viene fatto per rimuovere pezzi di tessuto non dissociato. In alternativa, utilizzare filtri cellulari disponibili in commercio.
   10. Aggiungere 13,5 ml di CMF-HBSS e 1,5 ml di 2,5% tripsina al tubo contenente i pezzi di tessuto rimanenti e in seguito incubare a 37 ° C in un bagno d'acqua per altri 10 min.
   11. Triturare il tessuto rimanente ancora una volta, e poi filtrare nuovamente la sospensione nella provetta da 50 ml contenente il filtrato iniziale. Avanti, sciacquare il lecarta ns con 3 mL di BGS. Il volume finale deve essere di circa 38 mL.
   12. Centrifugare la sospensione contenente le cellule gliali dissociate per 6 minuti a 130 x g. Eliminare attentamente il surnatante con una pipetta Pasteur di vetro. Assicurarsi che le cellule pellet in fondo non sono disturbati. Il fondo del pellet appare leggermente rossastro contenenti componenti del sangue.
   13. Trasferire le cellule gliali in 1 ml di mezzo gliale in una nuova provetta, facendo attenzione a non disturbare la porzione rossastra del pellet.
   14. Aggiungere fino a 2 ml di terreno gliali ogni cucciolo per sospendere di nuovo il combinato dissociato cellule gliali. Ad esempio, se 10 cuccioli sono stati utilizzati, e quindi il volume totale risospensione sarebbero 20 mL.
   15. Preparare cultura beuta una compressa da 75 ^cm2 di cellule per cucciolo. Aggiungere 18 ml di pre-riscaldato medio gliale ad ogni pallone.
   16. Trasferire 2 ml di sospensione cellulare a ciascuna beuta e incubare a 37 ° C, 5% CO ₂ incubatore.
   17. Dopo un giorno, sostituirli con 20 mL gliale medium. In questa fase, la cultura è un mix di gliali e di altri tipi di cellule indesiderate.
   18. Quattro giorni dopo la semina delle cellule, vigorosamente scuotere i palloni per staccare le cellule non-astrociti. Per fare questo, lavare i flaconi una volta con CMF-HBSS, e quindi aggiungere 10 ml fresca CMF-HBSS ad ogni pallone. Agitare vigorosamente i palloni 5-10 volte, e quindi aspirare al largo della CMF-HBSS. Risciacquare due volte con CMF-HBSS, e poi aggiungere 20 ml di media gliali.
       NOTA: Questo passaggio è fondamentale per garantire la rimozione di tipi di cellule non bersaglio, e non dovrebbe comportare la perdita delle astrociti desiderati.
   19. Sostituire con terreno gliale fresco due volte a settimana fino a quando le cellule sono confluenti (Figura 1).
2. congelamento glia
   1. Una volta che le colture sono confluenti, aspirare off medio e lavare il monostrato cellulare con 10 mL di CMF-HBSS.
   2. Aggiungere 10 ml di 0,25% tripsina / EDTA a ciascun pallone e incubare a 37 ° C per 3 min.
   3. Toccare fiaschi delicatamente per sloggiare le cellule. Aggiungere 1 ml BGS to ciascun pallone e trasferire le sospensioni cellulari in 15 provette ml.
   4. Centrifugare le provette a 130 xg per 6 min. Eliminare il surnatante risultante.
   5. Risospendere il pellet cellulare in 2 mL di terreno gliale.
   6. Preparare il mezzo di congelamento gliale (1-parte dimetilsolfossido e 4-parti BGS). Aggiungere 0,5 ml di questa soluzione a ciascuno dei 4 fiale criogeniche per bombola.
   7. Trasferire 0,5 ml di sospensione cellulare per ogni fiala, e poi congelare le cellule lentamente ponendo i flaconi in un contenitore isolato in un congelatore C -80 ° durante la notte. Dopo un giorno, trasferire le fiale per un congelatore azoto liquido per la conservazione a lungo termine.
3. Placcatura rivivere glia
   1. glia piastra 1-2 settimane prima del giorno cultura neurone.
   2. Preparare una provetta da 50 ml con 10 ml riscaldato medio gliale.
   3. Scongelare 1 fiala congelata di cellule gliali in un bagno d'acqua a 37 ° C per 2-3 min.
   4. Trasferire il contenuto della fiala nella provetta da 50 ml contenente 10 ml di mezzo gliale.
   5. Centrifuge il tubo per 5 minuti a 130 xg ed aspirare il sopranatante.
   6. Risospendere il pellet in 20 mL di terreno gliale.
   7. Aggiungere 3 mL di terreno fresco gliali a ciascuna delle piastre di coltura (60 mm), e quindi trasferire 1 ml di sospensione cellulare per ogni piatto. Incubare le colture a 37 ° C, 5% CO ₂ incubatore.
   8. Nutrire le cellule due volte a settimana. Se la densità cellulare raggiunge% di confluenza 50 ben prima del giorno cultura neurone, passa a mezzo gliale contenente 5% BGS per rallentare il tasso di crescita gliale. La confluenza desiderato del monostrato gliali cultura neurone è del 50% - 70%.
   9. Sostituire il mezzo gliale con il mezzo NBG (6 mL / piatto) 1-2 giorni prima della cultura neurone.

3. Preparazione Coverslip

1. Pulizia e la preparazione di perline di paraffina
   1. Immergere coprioggetto in acido nitrico concentrato (70% p / p; ATTENZIONE: altamente corrosivo) e sonicare per 30 minuti a temperatura ambiente. Altri laboratori hanno found vantaggioso incubare i vetrini in acido nitrico 70% in scaffali ceramica 12-24 ore a temperatura ambiente invece.
   2. Eliminare attentamente l'acido nitrico in una cappa designata secondo le linee guida istituzionali. Lavare i coprioggetti 3-5 volte con acqua deionizzata.
   3. Immergere i coprioggetti in acqua deionizzata e sonicare nuovamente per 30 min (saltare se seguendo il metodo alternativo).
   4. Rimuovere l'acqua deionizzata e lavare i coprioggetti altre tre volte.
   5. Immergere i coprioggetti in 50 mL di acqua deionizzata e sterilizzare in autoclave. In alternativa, sterilizzare i coprioggetti a 225 ° C in un forno per 6 h. Se si utilizza questo approccio alternativo, passare al punto 3.1.9.
   6. Una volta autoclavato, trasferire i coprioggetti ad una cappa a flusso laminare sterile per le fasi successive.
   7. Rimuovere l'acqua deionizzata e risciacquare con 20-30 ml di etanolo al 100%.
   8. Aggiungere 20-30 ml di etanolo al 100% e trasferire i coprioggetti eetanolo da 100 mm piastra di Petri.
   9. Utilizzare pinzetta smussata per trasferire coprioggetti a 60 mm di Petri, 4-5 coprioggetto per piatto, e poi lasciare asciugare appoggiando i coprioggetti contro il bordo del piatto. Una volta che l'etanolo evaporato, porre i coprioggetti piano sulla superficie.
   10. Trasferire 10 g di paraffina ad un idoneo bottiglia di vetro termoresistente. Sciogliere la paraffina e mantenerla a circa 150-200 ° C su una piastra calda per almeno 1 ora. La temperatura ideale a cui deve essere riscaldata la paraffina può richiedere qualche ritocco. Le temperature non ideali possono portare a difficoltà a produrre la dimensione corretta delle perline di paraffina. Il periodo di attesa dopo la fusione aiuta a garantire la temperatura costante per tutto il liquido.
   11. Immergere una pipetta Pasteur in paraffina, e poi rapidamente toccarla a tre punti vicino al bordo di ogni vetrino (ogni punto essendo di circa 120 °). Le gocce si solidificano in perline alti di circa 0,3-0,5 mm e 1,0-2,0 mm di diametroeter e funziona per fornire uno spazio tra i neuroni sul vetrino e il monostrato gliali sotto (Figura 2).
   12. Sterilizzare i piatti sotto luce UV per 30 minuti, e poi coprire con un foglio di alluminio e conservare a temperatura ambiente. coprioggetto preparati possono essere memorizzati e utilizzati per un massimo di un mese. perle di paraffina dovrebbe essere consentito di rispettare i coprioggetti per almeno una settimana prima dell'uso. Questo consentirà di evitare la paraffina si stacchi durante i passaggi rimanenti del protocollo.
2. Coprioggetto rivestimento con Poli-L-lisina
   1. Ottenere piastre Petri contenenti coprioggetto precedentemente preparate con le perline di paraffina.
   2. Aggiungere 200 ml di poli-L-lisina in tampone borato alla superficie di ciascun coprioggetto e lasciare che la soluzione sedersi sul coprioggetto durante la notte, coperto, a temperatura ambiente. Rivestire la stessa superficie come quella su cui si trovano le perle di paraffina. Si noti che, se adeguatamente puliti, il poli-L-lisina dovrebbe diffondersi facilmenteper coprire la superficie del vetrino.
   3. Dopo un giorno, lavare i coprioggetti due volte immergendoli in acqua deionizzata sterile per 2 ore ogni volta. Dopo l'ultimo lavaggio, sostituire l'acqua con 4 ml di terreno di placcatura neuronale a piatto. Si noti che è importante che la superficie non coprioggetto lasciare asciugare dopo essere stato rivestito con poli-L-lisina.
   4. Porre le capsule contenenti coprioggetto a 37 ° C, 5% CO ₂ incubatore. Il coprioggetto rivestiti devono essere incubate per almeno 24 ore prima della coltura neurone. Questo viene fatto per innescare il mezzo per la cultura neurone.

4. dissezione di ippocampo e placcatura neuroni

1. Ottenere un ratto incinta (embrionale giorno 18-19, misurata dal giorno della scoperta spina vaginale) e eutanasia per decapitazione isoflurano anestetizzati o altro metodo approvato.
2. Spruzzare la parte inferiore del ratto con 70% di etanolo, e poi fare un'incisione della regione pubico through alla estremità della cavità addominale. Per evitare la contaminazione, fare attenzione a tagliare solo attraverso la pelle in questa fase.
3. Risciacquare gli strumenti di dissezione nuovo con etanolo al 70%, e poi tagliare attraverso la parete addominale per esporre l'utero. Rimuovere le due corna uterine e metterli in una sterile 100 millimetri Petri.
4. Eseguire i passaggi rimanenti in una cappa a flusso laminare. Rimuovere la membrana uterina circonda feti. li decapitate e posizionare le teste da 100 mm piastra di Petri contenente 20 mL CMF-HBSS.
5. Sezionare il cervello e immediatamente metterli in una capsula di Petri 60 millimetri contenente 2 mL CMF-HBSS su ghiaccio. Raccogliere solo 2-3 cervello per piatto per lasciare spazio sufficiente per il passaggio successivo.
6. Sotto un microscopio da dissezione spogliare meningi dalla linea mediana degli emisferi cerebrali, e poi sezionare le dell'ippocampo e metterli in una capsula di Petri 60 millimetri contenente 4,5 mL CMF-HBSS. Si noti che l'ippocampo può essere distinto come strut a forma di mezzalunature nella superficie mediale dell'emisfero corticale, ed è facile da rimuovere in quanto è delimitato lateralmente da un ventricolo.
7. Trasferire il tessuto dell'ippocampo raccolto e CMF-HBSS ad una provetta da 15 ml. Aggiungere 0,5 ml di 2,5% tripsina, e incubare a 37 ° C per 10 min. Papaina può essere usato al posto di tripsina perché è più delicato e può aumentare la resa.
8. rimuovere delicatamente la soluzione di tripsina da pipetta Pasteur, lasciando il tessuto dell'ippocampo indisturbati sul fondo della provetta.
9. lavare delicatamente il tessuto due volte con 5 mL di CMF-HBSS mentre incubazione è a 37 ° C per 5 min. Dopo il secondo lavaggio, portare il volume totale ad almeno 5 ml aggiungendo un volume sufficiente di CMF-HBSS al tessuto. Se ci sono ippocampi provenienti da più di 10 cuccioli, fino a 8 mL CMF-HBSS può essere aggiunto.
10. Preparare due varianti di pipette fuoco lucido per la dissociazione dei tessuti. La punta di una variante è del normale diametro della pipetta ma con i bordi levigati incendio lucidato. L'altra Variformica è uno con la punta di diametro ridotto della metà. esporre brevemente la punta di una pipetta Pasteur di vetro diagonalmente ad una sorgente di fiamma, e quindi esaminare le punte delle pipette.
    1. Ripetere questo passaggio finché il bordo punta era stato lisciato o il diametro è stato ridotto. È importante praticare per trovare il diametro ideale per garantire che il tessuto si dissocia per produrre cellule singole senza danneggiare queste cellule.
11. Triturare il tessuto ippocampali primo di circa 10 passa attraverso un normale vetro pipetta Pasteur buon taglio, e quindi un ulteriore 5 a 10 passa attraverso la pipetta con il diametro ridotto. L'obiettivo è quello di ottenere una soluzione omogenea di cellule senza o con qualche ciuffo di tessuto.
12. Determinare la densità delle cellule utilizzando un emocitometro o un contatore automatico di cellule. Tipicamente, 0,8 e 1,0 milioni di cellule per cuccioli vengono ottenuti quando ippocampi dei due emisferi sono combinati.
13. Trasferire un volume sufficiente di sospensione cellulare per piatticontenenti coprioggetto poli-L-lisina rivestite in 4 mL placcatura mezzo per ottenere una densità di placcatura di 300.000 cellule per piastre da 60 mm. La densità delle celle può variare da 100.000 a 500.000, a seconda l'esperimento previsto.
14. Dopo 3-4 ore, trasferire i coprioggetti con neuroni attaccati ai piatti contenenti cellule gliali in terreno NBG. Questo dovrebbe essere fatto in modo tale che il lato in cui sono state piastrate i neuroni sia rivolta verso lo strato di cellule gliali. Aggiungere un totale di 4-5 vetrini per piastra glia.
15. Due o tre giorni dopo la placcatura, aggiungere la soluzione di Ara-C ad una concentrazione finale di 5 mM per ogni piatto di arrestare la crescita gliale.
16. Alimentare le cellule una volta alla settimana, sostituendo 2 mL del vecchio mezzo con 2,5 ml di mezzo fresco ad ogni pasto. Il mezzo supplementare aggiunto è per compensare l'evaporazione nel tempo, e solo una porzione del mezzo viene cambiato di assicurare la coerenza di condizionamento del fluido dalle cellule gliali. Queste culture sono in genere sani per almeno un mese (Figura 3). Neurone sopravvivenza può essere migliorata aggiungendo APV al mezzo di coltura ad una concentrazione finale di 100 pM. APV è un antagonista del recettore NMDA e promuove la sopravvivenza riducendo glutammato eccitotossicità.

Representative Results

In questo metodo "sandwich" della coltura primaria di cellule nervose, neuroni dell'ippocampo (Figura 3) crescono su un letto di cellule gliali (Figura 1) separati da perline di paraffina (Figura 2). Questo assicura che i neuroni crescono selettivamente su vetrini con minima contaminazione delle cellule gliali ma ricevano un adeguato supporto trofico da glia crescente sul piatto di coltura tissutale. Tipicamente, i neuroni possono essere mantenute in coltura per> 3 settimane e si sviluppano vasta arborisation con assoni ben sviluppati e dendriti identificati dalla loro tipica defosfo-Tau e MAP2 immunostaining, rispettivamente (Figura 4). neuroni maturi sviluppano spine sinaptiche identificati per localizzazione selettiva di marcatore postsinaptico Drebrin1 a questi compartimenti. Queste spine sinaptiche sono strettamente apposto specializzazioni presinaptico, che sono identificati dal marcatore vescicole sinaptiche Synapsin1 immunocolorazione. Illa vicinanza dei siti di pre- e post-sinaptici indica ben sviluppato e correttamente allineato sinapsi. Questi neuroni primari sono ben adatti per studi funzionali e strutturali dei neuroni e sinapsi. Questi includono, ma non sono limitati a, studi di trasduzione del segnale, polarità neuronale, il traffico subcellulare e lo sviluppo delle sinapsi e plasticità.

Figura immagini contrasto 1. Fase di colture gliali prese 1 giorno, 7 giorni, o 14 giorni dopo la placcatura da congelato magazzino gliale. barra della scala, 500 micron. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Le immagini ad alta risoluzione di coprioggetti preparEd con perline di paraffina. (A, B) Esempi di corretta applicazione perle di paraffina. (C, D) Esempi di perle di paraffina applicate in modo non corretto. α: Più di un tallone è stato applicato nella stessa posizione. β: Il tallone non è riuscito a essere situato correttamente sul vetrino. χ: Il tallone è stato applicato troppo vicino al centro del vetrino. δ: Il tallone era troppo alto. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. immagini a contrasto di fase delle fasi di sviluppo di neuroni primari in coltura. barra della scala, 100 um. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di Thè figura.

Figura 4. immagini di immunofluorescenza di neuroni primari a 17 giorni in vitro. I neuroni sono stati fissati con formaldeide al 4% e il 4% di saccarosio in PBS per 12 minuti, e quindi permeabilizzate con 0,25% Triton X-100 per 5 min. Dopo il bloccaggio con il 10% di BSA in PBS per 30 minuti, i neuroni sono state incubate overnight a 4 ° C con anticorpi primari applicati in 3% BSA in PBS. Gli anticorpi primari sono stati utilizzati nel modo seguente: anti-sinapsina I (coniglio, 1: 2.000), anti-drebrin (IgG1 mouse, 1: 8, clone M2F6, ibridoma surnatante), anti-MAP2 (pollo policlonale IgY, 1: 5000), e anti-Tau-1 (topo IgG2a, 1: 2.000, clone PC1C6; riconosce tau defosforilato). Le cellule sono state quindi lavate con PBS e incubate con opportune specie-o anticorpi secondari specifici isotipo in 3% BSA in PBS per 1 ora a 37 ° C. Gli anticorpi secondari utilizzati sono stati i folbassi: Alexa 488-coniugato anti-topo IgG2a (1: 500), Alexa 568-coniugato anti-coniglio (1: 500), Alexa 647-coniugato anti-topo IgG1 (1: 500), e AMCA-coniugato anti-pollo IgY (asino IgG, 1: 200). barra della scala, 10 um e 2,5 um, come indicato. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

Mentre il metodo "sandwich" di neuroni in coltura è stata ben descritta-altrove ^{2, 11,} ci sono diversi passaggi in tutto il protocollo che sono molto difficili da descrivere in solo testo, che può portare alla frustrazione per gli investigatori che vogliono adottarlo.

Il metodo può essere suddiviso in tre grandi flussi di lavoro: cultura gliali, preparazione coprioggetto e cultura neurone e manutenzione. Ognuno dei tre preparati sono critici per colture neuronali di alta qualità e diverse considerazioni importanti devono essere tenuti in considerazione. Prima di placcatura neuroni, lo strato alimentatore gliali dovrebbe essere idealmente una popolazione omogenea di astrociti ed essere tra il 50-70% di confluenza. Ciò garantirebbe sufficiente supporto trofico dallo strato alimentatore gliali. È importante garantire che la cultura astrogliale ha contaminazione minima di altri tipi di cellule, in particolare microglia, che sono liberamente attaccellule HED e arrotondate. Citochine rilascio microglia, che sono dannosi per la salute e la sopravvivenza dei neuroni ^12. Il siero siero, sia a cavallo o di siero bovino della crescita, possono variare da lotto a lotto. lo screening attento delle diverse partite di siero deve essere eseguita prima di decidere di utilizzare un lotto specifico.

preparazione coprioggetto è un altro passo importante. La qualità del vetro e il protocollo utilizzato nella sua pulizia sono fondamentali per la buona salute neuroni ben sviluppati. Se il metodo è stato recentemente adottato in un laboratorio, varrebbe la pena di testare vetrini da diversi fornitori. Per la pulizia dei coprioggetto, alcuni laboratori ammollo coprioggetto in acido nitrico 70% per 18-36 h, mentre altri fanno solo per 1 h in un sonicatore. Un criterio importante di vetrini puliti è che la soluzione di poli-L-lisina deve diffondere uniformemente sulla superficie. Un'altra considerazione importante è che le sfere di cera paraffina applicati ai vetrini devono essere di altezza adeguata ediametro e scaldata alla giusta temperatura, come descritto nel protocollo.

Per ottenere i neuroni, ippocampi possono essere sezionati da embrionali giorno 17-19 ratti. Anche se la dissezione in questa fase porta a pochissime cellule gliali, la proliferazione gliale può essere arrestato con l'aggiunta l'agente anti-mitotico Ara-C dopo 2-3 giorni di coltura. La triturazione del tessuto dell'ippocampo tripsinizzate da punte per pipette ribruciate è fondamentale per dissociare il tessuto in singole cellule senza danneggiare le cellule stesse. Il mezzo di crescita e il mantenimento neuronale utilizzato in questo protocollo è supplemento Neurobasal + L-glutammina + B27. L-glutammina può essere sostituita da Glutamax, che è più stabile nel terreno di coltura. La qualità del supplemento B27 può variare da lotto a lotto, e quindi dovrebbe essere testato prima di utilizzare uno specifico lotto per la cultura a più lungo termine. Un povero sacco di B27 può causare neuroni a raggrupparsi. prodotti alternativi come GS21 e SM1 sono stati trovati per essere buoni sostituti per B27.Neuroni coltivati ​​per più di una settimana devono essere alimentati con mezzo fresco ogni settimana, in cui un terzo del terreno viene sostituito ogni settimana.

Questo metodo di coltura di cellule nervose può rivelarsi prezioso per esperimenti che si basano sulle popolazioni neuronali puri con poca o nessuna contaminazione gliale. i neuroni a bassa densità cresciuti con questo metodo tipicamente sopravvivere per diverse settimane con pergole ben sviluppati, connessioni sinaptiche e le proprietà di rete.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection Instruments
Micro Dissecting Scissors	Roboz	RS-5910
Micro Dissecting Spring Scissors	Roboz	RS-5650
Micro Dissecting Spring Scissors	Roboz	RS-5605
Dumont Forceps (#5)	Roboz	RS-5045
Dumont Forceps (#PP)	Roboz	RS-4950
Name	Company	Catalog Number	Comments
Tissue Preparation
Trypsin (2.5%)	Gibco	15-090-046
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25-200-072
Swinnex Filter Holder, 25 mm	EMD Millipore	SX0002500	Used as cell strainer. Assemble first with filter and autoclave
Isoflorane	Pharmaceutical Partners of Canada Inc.	CP0406V2
Hemocytometer	Hausser Scientific	1492
Grade 105 Lens Cleaning Tissue	GE Healthcare	2105-841	Used as cell strainer. Assemble first in filter holder and autoclave
Glass Pasteur pipettes with cotton filter	VWR	14672-412
HEPES (1 M)	Gibco	15-630-080
Hank's Balanced Salt Solution without Calcium, Magnesium, Phenol Red (HBSS, 10x)	Gibco	14-185-052
Glass Pasteur pipettes	VWR	14672-380
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (Dnase)	Sigma-Aldrich	DN25-100mg
Butane bunsen burner	Wall-Lenk Mfg. Co.	Model 65
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Name	Company	Catalog Number	Comments
Tissue Culture
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15-140-122
Petri Dish (100 mm)	Fisher	FB0875712
Petri Dish (60 mm)	Fisher	FB0875713A
Horse Serum	Gibco	16050-122	Can be used in place of BGS, but each lot must be tested due to inter-lot variation. Heat-inactivation of serum is recommended.
Sodium Hydroxide	Fisher Scientific	S318-1
Sodium Pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256
Minimum Essential Medium (MEM)	Gibco	11-095-080
Neurobasal Medium	Gibco	21-103-049
L-Glutamine (200 mM)	Gibco	25-030-081
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061	Can be used in place of L-Glutamine in the NBG medium
Culture Dish (60 mm)	Corning, Inc	353002
Culture Flasks (75 cm^2)	Greiner Bio-One	658170
Cytarabine (Ara-C)	Sigma-Aldrich	C3350000
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Bovine Growth Serum (BGS)	HyClone	SH3054103	Heat-inactivation is recommended before use.
B27 Supplement (50x)	Gibco	17-504-044
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418-100ml
Cryogenic Vials	VWR	89094-806
DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (APV)	Sigma-Aldrich	A5282
Name	Company	Catalog Number	Comments
Coverslip Preparation
Sodium tetraborate decahydrate (borax)	Sigma-Aldrich	B9876-1KG
Poly-L-Lysine Hydrobromide	Sigma-Aldrich	P2636
Histoplast Paraffin Wax	Fisher	22-900-700
Gravity Convection Oven	VWR	89511-404	Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol
Ultrasonic Bath (Sonicator)	Fisher Scientific	15337400
Nitric Acid	Anachemia	62786-460
Ceramic Staining Racks	Thomas Scientific	8542E40	Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol
Coverslips	Glaswarenfabrik Karl Hecht GmbH	1001/18	Manufacturer is very important, as neurons do not adhere well to lower quality glass
Boric Acid	Sigma-Aldrich	B0252
Name	Company	Catalog Number	Comments
Miscellaneous
Sterile Syringe Filters	VWR	28145-477	Used with BD syringe for filter-sterilization
Syringe	BD	302832	Used with VWR sterile syringe filters for fliter-sterilization
Water Bath	Fisher Scientific	15-460-16Q
Inverted Microscope	Olympus	CKX41
15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes	ThermoScientific	339650
50 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes	ThermoScientific	339652