Summary
Dieser Artikel beschreibt das Protokoll zur Kultivierung niedriger Dichte primären hippocampalen Neuronen wachsen auf Glasdeckgläschen über einen einschichtigen glial invertiert. Das Neuron und Glia-Schichten werden durch Paraffinwachsperlen abgetrennt. Die Neuronen durch diese Verfahren gezüchtet sind geeignet für hochauflösende optische Bildgebung und funktionelle Assays.
Abstract
Die Fähigkeit, die Struktur und Physiologie der einzelnen Nervenzellen in Kultur zu untersuchen ist entscheidend für das Studium der Neurobiologie und ermöglicht Flexibilität bei der genetischen und chemischen Manipulation einzelner Zellen oder Netzwerk definiert. Eine solche einfache Manipulation in der reduzierten Kultursystem einfacher, wenn auf den intakten Hirngewebe verglichen. Während viele Verfahren zur Isolierung und Wachstum dieser primären Neuronen vorhanden sind, jeder hat seine eigenen Beschränkungen. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Kultivierung von niedriger Dichte und hohe Reinheit rodent embryonale Hippocampusneuronen auf Glasdeckgläschen, die dann über eine Monoschicht von Gliazellen suspendiert. Diese ‚Sandwich-Kultur‘ ermöglicht exklusives langfristiges Wachstum einer Population von Neuronen während von der darunterliegenden Glia einschichtigen für trophische Unterstützung ermöglicht. Wenn Neuronen ausreichenden Alters oder Reifegrad sind, können die Deckgläser werden in Neuronen Bildgebung oder funktionelle Assays klappt den glial dish und verwendet wird. Neurone grown durch dieses Verfahren typischerweise mehrere Wochen überleben und umfangreiche Dorne, synaptische Verbindungen entwickeln und Netzwerkeigenschaften.
Introduction
Das Gehirn ist in komplizierte Netzwerke von Neuronen organisiert. Der Beitrag der einzelnen Neuronen zu Netzwerk-Aktivität und Funktion des Gehirns kann durch selektive Veränderung ihrer molekularen Zusammensetzung und perturbance ihrer physiologischen Eigenschaften untersucht werden. Genetische und chemische Manipulation einzelner Neuronen ist wohl einfacher in kultivierten Neuronen als in intakten Hirngeweben, unbelastet von dem zellulären Heterogenität und Komplexität des letzteren. Neurone in Kultur entwickelt wohldefinierte axonalen und dendritischen Dorne und miteinander umfangreiche synaptischen Verbindungen bilden.
Während Neuron Kultur von erwachsenen Tieren oder aus anderen Regionen des Nervensystems möglich ist, werden embryonale Hippocampus - Kulturen aufgrund ihrer definierten Pyramidenzellpopulation häufig bevorzugt und eine relativ geringe Dichte Glia 1, 2. Hippocampus-Neuronen bei niedriger Dichte in Kultur gezüchtet sind besonders ameNable auf die Untersuchung von subzellulärer Lokalisierung, Protein Handel, Entwicklung neuronaler Polarität und Synapse. Neuronen in Kultur wird auch bei der Untersuchung molekulare Prozesse in der synaptischen Plastizität 3, 4, 5, 6 extensiv verwendet worden. Neuron Kultur Präparate von Mäusen , die mit globalen genetischen Deletionen , die postnatal nicht überleben haben sich als besonders nützlich erwiesen in 7 zellulären und synaptischen Rollen bestimmter Gene zu studieren.
Wie im Gehirn, kultiviert Hippocampus-Neuronen abhängig von trophischen Unterstützung von Gliazellen. Dies erschwert ihre Kultur, und hat zur Entwicklung verschiedener Methoden geführt, durch die diese Unterstützung geliefert wird. Ein allgemein verwendetes Verfahren beinhaltet Neuronen direkt auf eine Monoschicht von Gliazellen Plattierung 8 oder Verunreinigung ermöglichen Gliazellen aus dem erfassten Hippocampal Gewebe proliferieren und eine Monoschicht unter den Neuronen 9 zu bilden. Während dieses Verfahren einen gewissen Erfolg gefunden hat, ist die Verunreinigung der resultierenden neuronalen Kultur für die Bildgebung Experimente unvorteilhaft. Eine weitere , häufig verwendete Methode der Neuronenkultur verlassen den glial-out feeder insgesamt Schicht und stattdessen trophische Unterstützung in der Form eines definierten Wachstumsmediums 10 bereitzustellen.
Hier beschreiben wir das „Sandwich“ oder „Banker“ Methode der Neuron Kultur 2, 11. Dieses Verfahren beinhaltet die Hippokampus-Neuronen auf Glasdeckgläschen Plattierung, die dann über eine Monoschicht von Gliazellen durch Paraffinwachsperlen abgetrennt suspendiert. Dies erleichtert die langfristige Kultur einer homogenen Population von Neuronen ohne Glia kontaminiert, während für trophische Unterstützung von dem darunterliegenden Glia einschichtigen ermöglicht. Wenn Neuronen sind von ausreichendem Alter oder Reifegrad,die Neuronendeckgläser kann der glial Schale und verwendet in Bildgebung oder funktionelle Assays klappten werden.
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Protocol
Alle Experimente und Protokolle Versuchstiere wurden von der University of Manitoba Tierethikkommission genehmigt und mit den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care-konform waren.
1. Herstellung von Instrumenten, Puffer und Lösungen
- Sterilisieren durch alle Dissektion Ausrüstung Autoklavierung, Glas Pasteur-Pipetten, Pipettenspitzen, Filtervorrichtung und deionisiertes Wasser.
- Vorbereiten einer 20% (w / v; 1,1 M) stock Glucoselösung in entionisiertem Wasser und Filter-Sterilisieren. Lagerung bei 4 ° C.
- Vorbereiten einer 100 mM Natriumpyruvat-Lösung in entionisiertem Wasser und Filter-Sterilisieren. Lagerung bei 4 ° C.
- Bereiten calcium- und magnesiumfreier Hank Balanced Salt Solution (CMF-HBSS) durch eine Lösung aus 10% HBSS (10x) zu machen, 10 mM HEPES und 100 U / ml Penicillin-Streptomycin in deionisiertem Wasser. Lagerung bei 4 ° C für nicht mehr als 1 bis 2 Monate.
- Bereiten 10 mg / ml Desoxyribonuclease I (DNase) in CMF-HBSS,und dann filtrieren sterilisieren und bei -20 ° C.
- Bereiten glial Medium durch eine Lösung von 30 mM Glucose-Herstellung (von der sterilen Lösung), 95 U / ml Penicillin-Streptomycin und 10-15% Rinderwachstumsserum (BGS) in Minimum Essential Medium (MEM).
HINWEIS: Wie im Protokoll angegeben, kann eine Lösung von 5% BGS verwendet werden, wenn erforderlich, die Zellproliferation zu verlangsamen. Pferdeserum anstelle von BGS verwendet werden, aber beachten Sie, dass jede Partie muss aufgrund inter-batch Variation vor dem Einsatz getestet werden. Lagern Sie die zubereitete Lösung bei 4 ° C für nicht mehr als 1 bis 2 Monate. Obwohl viele Laboratorien FBS verwenden, beobachteten wir immer wieder, dass in BGS Glia-Wachstum wie in FBS so robust ist. BGS ist aus fötalem Kälberserum abgeleitet sind, die mit chemisch definierten Komponenten ergänzt wird. Darüber hinaus ist BGS wesentlich wirtschaftlicher als FBS. - Vorbereiten des Neurons Wachstum und Erhaltungsmedium (Neurobasal-B27, NBG), indem eine Lösung von 1x B27 Herstellung Ergänzung und 0,5 mM L-Glutamin in 500 mL Neurobasalmedium MediÄh. Lagerung bei 4 ° C für nicht mehr als 1 bis 2 Monate. L-Glutamin kann mit GlutaMAX substituiert sein, die vorgeschlagen wurde, in dem Wachstumsmedium stabiler zu sein.
- Vorbereiten das Neurons Plattierungsmedium eine Lösung von 30 mM Glukose, indem sie (von der sterilen Lösung), 1 mM Natriumpyruvat (von der sterilen Lösung) und 10% BGS in MEM. Lagerung bei 4 ° C für nicht mehr als 1 bis 2 Monate.
- Es wird eine Lösung von 1 mM Cytarabin (Ara-C) und Filter-Sterilisieren. Aliquot in 1 ml-Portionen und bei -20 ° C.
- Bereiten einer Lösung von 100 mM APV in 100 mN NaOH sterilfiltriert. Lagerung bei -20 ° C.
- Man löst 1 mg / ml Poly-L-Lysin in Boratpuffer, pH 8,5 (50 mM Borsäure und 12 mM Borax) und Filter-Sterilisieren. Aliquot und Lagerung bei -20 ° C. Anstelle von Poly-L-Lysin, kann ein Poly-L-Ornithin verwendet werden, die auf Zellen weniger toxisch sein können.
2. Glia Kultur Vorbereitung
- Bereiten Sie kortikale Astroglia-Zellkultur
- Sprühen Sie die Jungen mit 70% Ethanol und enthaupten sie.
- Platzieren Sie die Köpfe in einer 100 mm-Schale auf Eis mit 15 ml CMF-HBSS.
- Jedes Gehirn seziert, indem die Kopfhaut zu schneiden, das Öffnen des Schädels, die brainstem Abtrennen und dann Transferieren, das Gehirn auf 60 mm Petrischalen auf Eis, enthaltend 3 ml CMF-HBSS.
- Trenne die zerebralen Hemisphären vom Hippocampi und dann die Meningen sie umgebenden abstreifen. Übung ausreichend Vorsorge minimale Kontamination von meningeal Fibroblasten zu gewährleisten. Meningeale Fibroblasten in der Kultur kann mit Glia für Wachstum konkurrieren und für Neuron Gesundheit schädlich sein. Sammle alle zerebralen Hemisphären in einer 60 mm-Petrischale auf Eis mit 5 ml CMF-HBSS.
- Entfernen Sie den CMF-HBSS und dann zerkleinert das gesammelte Rindengewebe so fein wie möglich unter Verwendung von Mikro-seziert feder Schere.
- Gebe ausreichend CMF-HBSS zum hackenped Gewebe. Unter Verwendung einer Glaspasteurpipette übertragen die Gewebestücke in ein 15 ml Röhrchen. Bringt das Gesamtvolumen auf 12 ml durch Zugabe von CMF-HBSS.
- 1,5 ml jeweils von 2,5% Trypsin und 10 mg / ml DNase-Lösung. Inkubieren der resultierenden Mischung bei 37 ° C in einem Wasserbad für 12 min.
- Man reibt das Gewebe 10-15 mal mit einer Glaspasteurpipette, und weiter für 3 min in einem 37 ° C Wasserbad inkubiert.
- Filtriere den Überstand durch Linsenpapier oder Filtergewebe in ein 50 ml-Röhrchen, die 5 ml BGS. Dies geschieht, Stücke von undissoziierten Gewebe zu entfernen. Alternativ können Sie auch im Handel erhältliche Zellsiebe.
- Hinzufügen 13,5 ml CMF-HBSS und 1,5 ml 2,5% Trypsin zu dem Rohr um die verbleibenden Gewebestücke enthält, und weiter inkubieren bei 37 ° C in einem Wasserbad für weitere 10 min.
- Man reibt das verbleibende Gewebe noch einmal, und dann die Suspension Filter wieder in die 50 ml-Röhrchen das anfängliche Filtrat enthalten. Als nächstes spült die lens Papier mit 3 ml BGS. Das endgültige Volumen sollte ca. 38 ml sein.
- Zentrifugieren der Suspension, die die dissoziierten Gliazellen für 6 min bei 130 x g enthält. verwerfen Sie vorsichtig den Überstand mit einer Glaspasteurpipette. Stellen Sie sicher, dass die pelletierten Zellen am Boden nicht gestört werden. Die Unterseite des Pellets erscheint leicht rötliche Blutkomponenten enthält.
- Übertragen die Gliazellen in 1 ml glial Medium in ein frisches Röhrchen, dabei nicht den rötlichen Teil des Pellets zu stören.
- Fügen Sie bis zu 2 ml Glia-Medium pro pup die kombinierte distanzierten Gliazellen zu suspendieren. Zum Beispiel wurden, wenn 10 Welpen verwendet wird, und dann würde die Gesamt Resuspension Volumen 20 ml betragen.
- Bereiten einer 75 cm 2 Zellkulturflasche pro Pup. Fügen Sie 18 ml vorgewärmtem glial Medium zu jedem Kolben.
- Transfer 2 ml der Zellsuspension zu jedem Kolben und Inkubieren bei 37 ° C, 5% CO 2 -Inkubator.
- Nach einem Tag ersetzen mit 20 ml Glia mittel. In diesem Stadium ist die Kultur eine Mischung aus Glia und anderen unerwünschten Zelltypen.
- Vier Tage nach den Zellen Aussaat, kräftig schütteln die Flaschen nicht-Astrozyten Zellen zu entfernen. Um dies zu tun, spülen Sie die Kolben einmal mit CMF-HBSS, und fügen Sie dann 10 ml frisch CMF-HBSS in jeden Kolben. Schütteln Sie die Kolben kräftig 5-10 mal, und dann die CMF-HBSS absaugen. Spülen zweimal mit CMF-HBSS, und dann 20 ml glial Medium.
HINWEIS: Dieser Schritt ist entscheidend, um die Entfernung von Nicht-Zielzelltypen zu gewährleisten, und nicht zum Verlust der gewünschten Astrozyten führen. - Ersetzen mit frischem Glia - Medium zweimal pro Woche , bis die Zellen konfluent sind (Abbildung 1).
- Einfrieren Glia
- Nachdem die Kulturen konfluent sind, um das Medium absaugen und die Zellschicht mit 10 ml CMF-HBSS waschen.
- 10 ml 0,25% Trypsin / EDTA zu jedem Kolben und Inkubieren bei 37 ° C für 3 min.
- Tap-Kolben sanft um die Zellen zu entfernen. 1 ml BGS to Jeder Kolben übertragen und die Zellsuspensionen in 15 ml-Röhrchen.
- Zentrifugiere die Röhrchen bei 130 x g für 6 min. Entsorgen Sie den resultierenden Überstand.
- Resuspendieren des Zellpellets in 2 ml Medium glial.
- Bereiten Sie die glial Einfriermedium (1-Teil Dimethylsulfoxid und 4-Teilen BGS). 0,5 mL dieser Lösung in jedem von 4 Kryoröhrchen pro Kolben.
- Übertragung von 0,5 ml der Zellsuspension zu jedem Fläschchen, und dann die Zellen einzufrieren langsam, indem die Phiolen in einem isolierten Behälter in einen -80 ° C Gefrierschrank über Nacht platziert. Nach einem Tag überträgt die Fläschchen in einem flüssigen Stickstoff Gefrierschrank für die Langzeitlagerung.
- Plating wieder Glia
- Platte Glia 1-2 Wochen vor dem Neuron Kultur Tag.
- Vorbereiten ein 50 ml-Röhrchen mit 10 ml Medium glial erwärmt.
- Auftauen 1 gefrorene Ampulle von Gliazellen in einem Wasserbad 37 ° C für 2-3 min.
- Transferieren des Inhalts des Fläschchens in das 50 ml-Röhrchen, das 10 ml Medium glial.
- Zentrifugee das Röhrchen für 5 min bei 130 xg und absaugen Überstand.
- Das Pellet in 20 ml Medium glial.
- 3 ml frisches Medium glial zu jedem der Kulturschalen (60 mm), und übertragen dann 1 ml der Zellsuspension zu jeder Schale. Inkubieren der Kulturen in einem 37 ° C, 5% CO 2 -Inkubator.
- Führen Sie die Zellen zweimal pro Woche. Wenn die Zelldichte 50% Konfluenz gut, bevor das Neuron Kultur Tag erreicht, schalen Sie auf Glia Medium 5% BGS mit der Glia-Wachstumsrate zu verlangsamen. Die gewünschte Einmündung der glial einschichtigen für neuron Kultur beträgt 50% - 70%.
- Ersetzen des Mediums mit glial NBG-Medium (6 ml / Schale) 1-2 Tage vor dem Neuron Kultur.
3. Coverslip Vorbereitung
- Reinigung und Herstellung von Paraffin Beads
- Unterzutauchen Deckgläser in konzentrierter Salpetersäure (70% wt / wt; VORSICHT: hochkorrosiven) und beschallen sie für 30 min bei Raumtemperatur. Andere Laboratorien haben found es vorteilhaft, die Deckgläser in 70% iger Salpetersäure in Keramikträgern für 12-24 h bei Raumtemperatur statt inkubieren.
- die Salpetersäure in einer bestimmten chemischen Abzugshaube nach institutionellen Richtlinien sorgfältig entsorgen. Spülen Sie das Deck 3-5 mal mit entsalztem Wasser.
- Unterzutauchen die Deckgläser in entionisiertem Wasser und beschallen sie wieder für 30 min (überspringen, wenn die alternative Methode folgende).
- Entfernen Sie die VE-Wasser und spülen Sie die Deckgläser noch dreimal.
- Unterzutauchen die Deckgläser in 50 ml deionisiertem Wasser und sterilisieren, sie durch Autoklavierung. Alternativ sterilisiert die Deckgläser bei 225 ° C in einem Ofen für 6 h. Bei Verwendung dieses alternativen Ansatz überspringen 3.1.9 Schritt.
- Sobald autoklaviert, übertragen die Deckgläser in einen sterilen Laminarströmungshaube für die folgenden Schritte.
- Entfernen des entionisierten Wassers und Spülen mit 20-30 ml 100% igem Ethanol.
- In 20 bis 30 ml 100% Ethanol und übertragen Sie die Deckgläser undEthanol zu einem 100 mm-Petrischale.
- Verwenden stumpfen Pinzette Deckgläser bis 60 mm Petrischalen zu übertragen, 4-5 Deckgläschen pro Schale, und dann lassen sie an der Luft trocknen, indem die Deckgläser gegen den Rand des Tellers lehnt. Nachdem das Ethanol verdampft ist, liegt die Deckgläser auf der Oberfläche flach.
- Übertragung von 10 g Paraffin auf eine geeignete hitzebeständigen Glasflasche. Schmelzen des Paraffins und halten sie auf etwa 150-200 ° C auf einer heißen Platte für mindestens 1 h. Die ideale Temperatur, an der das Paraffin erhitzt werden kann, einige Optimierungen nehmen. Nicht-ideale Temperaturen können zu Schwierigkeiten führen, die richtige Größe der Paraffinkügelchen. Die Wartezeit nach dem Schmelzen hilft einheitliche Temperatur der Flüssigkeit zu gewährleisten.
- Tauchen einer Pasteur-Pipette in das Paraffin, und dann schnell berühren drei Flecken in der Nähe der Kante jedes Deckglas (jeder Punkt etwa 120 ° voneinander entfernt sind). Die Tropfen werden ca. 0,3-0,5 mm hoch und 1,0-2,0 mm im Durchmesser zu Perlen erstarreneter und funktioniert einen Raum zwischen den Neuronen auf dem Deckglas zur Verfügung zu stellen und die gliale einschichtigen unten (Abbildung 2).
- Sterilisieren des Geschirrs unter UV-Licht für 30 min und dann bedecken sie mit Aluminiumfolie und bei Raumtemperatur lagern. Vorbereitete Deck kann für bis zu einem Monat gespeichert und verwendet werden. Paraffinkügelchen sollte das Deck für mindestens eine Woche vor dem Gebrauch haftet gelassen werden. Dadurch wird das Paraffin von Ablösen während der verbleibenden Schritte des Protokolls verhindern.
- Beschichtung mit Deckgläsern Poly-L-Lysin
- Erhalten Petrischalen zuvor hergestelltes Deck mit dem Paraffinkügelchen enthalten.
- Füge 200 & mgr; l Poly-L-Lysin in Boratpuffer auf der Oberfläche jedes Deckglases und ließ die Lösung auf die Deckgläser sitzen, über Nacht, bedeckt, bei Raumtemperatur. Coat die gleiche Oberfläche wie der, auf dem die Paraffinperlen liegen. Beachten Sie, dass, wenn sie richtig gereinigt, sollte das Poly-L-Lysin leicht verbreitendie Oberfläche des Deckglases zu bedecken.
- Nach einem Tag wäscht die Deckgläser zweimal mit ihnen in sterilem, deionisiertem Wasser für 2 h bei jedem Einweichen. Nach der letzten Wäsche das Wasser mit 4 ml neuronaler Plattierungsmedium pro Schale ersetzen. Man beachte, dass es, dass die Oberfläche der Deckgläser wichtig ist, nicht erlaubt werden, nach dem trocknet nachdem mit Poly-L-Lysin beschichtet wurde.
- Platzieren Sie die Deckhaltigen Speisen in einem 37 ° C, 5% CO 2 -Inkubator. Die beschichteten Deck sollte mindestens 24 Stunden vor dem Neuron Kultur inkubiert werden. Dies wird prime Medium für Neuron Kultur getan.
4. Dissection von Hippocampus und Plating Neurons
- Erhalten eine schwangere Ratte (Embryonaltag 18-19, wie aus dem Tag der Vaginalpfropfens Entdeckung gemessen) und euthanize durch Isofluran-narkotisierten Enthauptung oder andere anerkannte Methode.
- Sprühen der Unterseite der Ratte mit 70% igem Ethanol, und dann einen Einschnitt von der Schamgegend machen through bis zum Ende der Bauchhöhle. Um Verunreinigungen zu vermeiden, achten Sie darauf bei diesem Schritt nur durch die Haut zu schneiden.
- Spülen Sie die Dissektionsinstrumente erneut mit 70% Ethanol und dann geschnitten durch die Bauchdecke in die Gebärmutter zu belichten. Entfernen Sie die beiden Uterushörner und sie in einem sterilen 100 mm Petrischale.
- Führen Sie die verbleibenden Schritte in einer laminaren Strömungshaube. Entfernen Sie die Gebärmutter-Membran, die Föten umgeben. Köpfen und legen sie die Köpfe in einer 100 mm Petrischale mit 20 ml CMF-HBSS.
- Sezieren die Gehirne sofort und sie in eine 60 mm Petrischale mit 2 ml CMF-HBSS auf Eis. Sammeln Sie nur 2-3 Gehirne pro Schale ausreichend Platz für den nächsten Schritt zu ermöglichen.
- Unter einem Binokular abzustreifen die Meningen von der Mittellinie der zerebralen Hemisphären entfernt, und dann die Hippocampi sezieren und legen sie in eine 60 mm Petrischale, enthaltend 4,5 ml CMF-HBSS. Beachten Sie, dass der Hippocampus kann als sichelförmigen struk unterscheidentur in der medialen Oberfläche des kortikalen Hemisphäre, und ist leicht zu entfernen, wie es von einem Ventrikel seitlich begrenzt wird.
- Übertragen der gesammelten Hippocampusgewebe und CMF-HBSS in ein 15 ml Röhrchen. Mit 0,5 ml 2,5% Trypsin, und dann bei 37 ° C inkubieren für 10 min. Papain kann anstelle von Trypsin verwendet werden, da es sanfter ist und die Ausbeute erhöhen.
- Sanft entfernen, indem Pasteurpipette die Trypsinlösung, das Hippocampus-Gewebe am Boden des Röhrchens ungestört bleibt.
- zweimal mit 5 ml CMF-HBSS sanft in das Gewebe waschen, während sie bei 37 ° C für 5 min inkubiert. Nach dem zweiten Waschen, bringen das Gesamtvolumen auf mindestens 5 mL, indem ein ausreichendes Volumen von CMF-HBSS zum Gewebe hinzugefügt wird. Wenn es Hippocampi von mehr als 10 Welpen sind, bis zu 8 ml CMF-HBSS kann hinzugefügt werden.
- Bereiten Sie zwei Varianten von feuerpolierten Pipetten für Gewebedissoziation. Die Spitze einer Variante ist das Normaldurchmesser der Pipette aber mit feuerpolierten geglätteten Kanten. Die andere Variant ist eine mit dem Spitzendurchmesser auf die Hälfte reduziert. belichten kurz auf die Spitze einer Pipette Glas Pasteur diagonal zu einer Flammenquelle, und dann die Spitzen der Pipetten untersuchen.
- Wiederholen dieses Schritts, bis die Spitzenkante Smoothened worden oder der Durchmesser verringert wurde. Es ist wichtig, den idealen Durchmesser zu finden zu üben, um sicherzustellen, dass das Gewebe einzelne Zellen zu erhalten, ohne zu beschädigen, diese Zellen dissoziiert.
- Verreibe das Hippocampusgewebe zuerst von etwa 10 Durchgängen durch eine glattrandige normale Glaspasteurpipette, und dann mit dem reduzierten Durchmesser die Pipette weiteren 5 bis 10 durch. Das Ziel ist es, eine homogene Lösung von Zellen ohne oder mit nur sehr wenigen Gewebeklumpen zu erhalten.
- Bestimmt die Zelldichte einen Hämozytometers oder einen automatisierten Zellzähler verwenden. Typischerweise werden 0,8 bis 1,0 Millionen Zellen pro Pup erhalten, wenn Hippocampi aus den beiden Hemisphären kombiniert sind.
- Bringen Sie ein ausreichendes Volumen der Zellsuspension zu Gerichtendie Poly-L-Lysin beschichtete Deckgläser in 4 ml Plattierungsmedium eine Plattierung Dichte von 300.000 Zellen pro 60 mm-Schale zu erhalten. Die Dichte der Zellen kann von 100.000 bis 500.000 variiert, abhängig von dem beabsichtigten Experiment.
- Nach 3-4 h, übertragen die Deckgläser mit Neuronen Geschirr angebracht Gliazellen in NBG-Medium enthält. Dies sollte so erfolgen, dass die Seite, auf die die Neuronen überzogen wurden, wird nach unten in Richtung der Glia-Zellschicht. In insgesamt 4-5 Deckgläser pro Glia Gericht.
- Zwei oder drei Tage nach dem Ausplattieren, fügen die Ara-C-Lösung auf eine Endkonzentration von 5 & mgr; M pro Schal glialen Wachstum zu verhaften.
- Führen Sie die Zellen einmal in der Woche durch Ersetzen von 2 ml des alten Mediums, das mit 2,5 ml frischem Medium bei jeder Fütterung. Das zusätzliche Medium gegeben ist für die Verdampfung über die Zeit zu kompensieren, und nur ein Teil des Mediums verändert wird konsistent Konditionierung des Mediums von den Gliazellen zu gewährleisten. Diese Kulturen sind in der Regel gesund für mindestens einen Monat (Abbildung 3). Neuron überleben kann durch Zugabe von APV zu dem Kulturmedium bis zu einer Endkonzentration von 100 uM verbessert werden. APV ist ein NMDA-Rezeptor-Antagonist und das Überleben fördert durch Glutamatexzitotoxizität reduzieren.
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Representative Results
In diesem „Sandwich“ -Methode von Primärnervenzellkultur wachsen Hippocampusneuronen (Figur 3) auf einem Bett von Gliazellen (Abbildung 1) , getrennt durch Paraffinkügelchen (Abbildung 2). Dadurch wird sichergestellt, dass Neuronen wächst selektiv auf Glasplättchen mit minimalen Gliazellen Kontamination aber eine angemessene trophische Unterstützung von Gliazellen auf der Gewebekulturschale wachsen. Typischerweise können Neuronen> 3 Wochen in Kultur gehalten werden und mit gut entwickelten Axonen und Dendriten durch ihre typische dephospho-Tau und MAP2 Immunfärbung bzw. (Abbildung 4) identifiziert umfangreiche Verästelungen entwickeln. Reifen Neuronen entwickeln synaptischen Dorne durch selektive Lokalisation von postsynaptischen Marker Drebrin1 diesen Kompartimenten identifiziert. Diese synaptischen Stacheln sind eng mit präsynaptischen Spezialisierungen apposed, die durch synaptische Vesikel Marker Synapsin1 Immunofärbung identifiziert. DasNähe von prä- und postsynaptischen Seiten gibt gut entwickelte und richtig ausgerichtet Synapsen. Diese primären Neuronen sind gut geeignet für die funktionelle und strukturelle Studien von Neuronen und Synapsen. Diese umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Untersuchungen der Signaltransduktion, neuronale Polarität, subzellulärer Handels und Synapse Entwicklung und Plastizität.
Abbildung 1. Phasenkontrastbilder von Glia - Kulturen 1 Tag genommen, 7 Tage oder 14 Tage nach der von gefrorenen Glia Lager Plattierung. Maßstabsbalken 500 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Hochauflösende Bilder von Deck prepared mit Paraffin Perlen. (A, B) Beispiele für richtig angewandt Paraffinperlen. (C, D) Beispiele für falsch angewendet Paraffinperlen. α: Mehr als eine Perle wurde an der gleichen Stelle aufgebracht. β: Der Wulst nicht richtig auf dem Deckglas entfernt werden. χ: Die Perle wurde zu nahe an der Mitte des Deckglases aufgebracht. δ: Der Wulst zu hoch war. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Phasenkontrastbilder der Entwicklungsstadien der primären Neuronen in der Kultur. Maßstabsbalken 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version zu sehen thFigur.
Abbildung 4. Immunofluoreszenz Bilder von primären Neuronen bei 17 Tagen in vitro. Die Neuronen wurden für 12 min mit 4% Formaldehyd und 4% Saccharose in PBS fixiert und dann mit 0,25% Triton X-100 5 Minuten permeabilisiert. Nach der Blockierung mit 10% BSA in PBS für 30 Minuten wurden die Neuronen über Nacht bei 4 ° C inkubiert, mit primärem in 3% BSA in PBS-Antikörper aufgetragen. Primäre Antikörper wurden wie folgt verwendet: anti-Synapsin I (Kaninchen, 1: 2000), Anti-Drebrin (Maus IgG1, 1: 8, Klon M2F6, Hybridomüberstands), anti-MAP2 (Huhn polyklonalen IgY, 1: 5000), und Anti-Tau-1 (Maus-IgG2a, 1: 2.000, Klon PC1C6, erkennt dephosphoryliert tau). Die Zellen wurden dann mit PBS gewaschen und mit geeigneten spezies oder isotypspezifischen Sekundärantikörpern in 3% BSA in PBS für 1 h bei 37 ° C gewaschen. Sekundäre Antikörper waren wie folTiefs: Alexa 488-konjugiertem anti-Maus-IgG2a (1: 500), Alexa 568-konjugierten anti-Kaninchen (1: 500), Alexa647-konjugiertem Anti-Maus-IgG1 (1: 500), und AMCA-konjugierten anti-Huhn IgY (Esel-IgG, 1: 200). Maßstabsleiste, 10 & mgr; m und 2,5 & mgr; m, wie angegeben. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Während das „Sandwich“ Verfahren zur Kultivierung Neuronen gut beschrieben worden ist , an anderer Stelle 2, 11, gibt es mehrere Schritte im gesamten Protokoll , das ziemlich schwer allein zu beschreiben , in Text, der für die Ermittler zu Frustration führen kann , die es annehmen wollen.
Glia-Kultur, Deck Vorbereitung und Neuron Kultur und Unterhaltung: Das Verfahren kann in drei großen Workflows unterteilt werden. Jede der drei Präparate sind entscheidend für hochwertige Neuronenkulturen und einige wichtige Überlegungen müssen im Auge behalten werden. Vor der Beschichtung Neuronen sollte die Glia-Feeder-Schicht idealerweise eine homogene Population von Astrozyten und zwischen 50-70% Konfluenz sein. Dies wäre ausreichend trophische Unterstützung der Glia-Feeder-Schicht zu gewährleisten. Es ist wichtig, um sicherzustellen, dass die Astroglia-Kultur minimale Kontamination anderer Zelltypen hat, besonders Mikroglia, die lose sind attached und abgerundete Zellen. Mikroglia Freisetzung Zytokine, die 12 bis Neuron Gesundheit und das Überleben schädlich sind. Das Serum, entweder Pferdeserum oder Rinderwachstumsserum kann von Charge zu Charge variabel sein. Eine sorgfältige Screening mehrerer Chargen Serum sollte vor der Entscheidung durchgeführt werden, um eine bestimmte Menge zu verwenden.
Coverslip Zubereitung ist ein weiterer wichtiger Schritt. Die Qualität des Glases und das Protokoll in seiner Reinigung verwendet werden, sind entscheidend für eine gesunde gut entwickelten Neuronen. Wenn die Methode neu in einem Labor angenommen wird, würde es sich lohnen, zu testen Glasplättchen von mehreren Lieferanten. Zur Reinigung der Deckgläser, Deckgläser in 70% Salpetersäure einige Labors für 18-36 h einweichen, während andere tun dies für nur 1 h in einem Beschallungsgerät. Ein wichtiges Kriterium für saubere Deckgläser ist, dass die Poly-L-Lysin-Lösung auf der Oberfläche gleichmäßig verteilen soll. Ein weiterer wichtiger Aspekt ist, dass die Paraffinwachsperlen auf die Deckgläser aufgebracht sollten geeigneter Höhe sein undDurchmesser und auf die richtige Temperatur erwärmt wird, wie in dem Protokoll beschrieben.
Zum Erhalt von Neuronen können Hippocampi aus embryonalen Tag 17-19 Ratten seziert werden. Obwohl Dissektion in dieser Phase nur sehr wenig Gliazellen führt, kann Gliaproliferation durch Zugabe der anti-mitotische Mittel Ara-C nach 2-3 Tagen Kultur verhaftet werden. Verreiben von Trypsin behandelt Hippocampus-Gewebe durch feuerpolierte Pipettenspitzen ist entscheidend, um das Gewebe in einzelne Zellen zu trennen, ohne sich die Zellen zu schädigen. Das neuronale Wachstum und Erhaltungsmedium in diesem Protokoll verwendet wird Neurobasal + L-Glutamin + B27 ergänzen. L-Glutamin kann durch GlutaMAX substituiert sein können, die stabiler in dem Kulturmedium ist. Die Qualität der B27 Ergänzung kann von Charge zu Charge variieren und so sollte es vor der Verwendung eine spezifische Menge für längerfristige Kultur getestet werden. Eine schlechte viel B27 kann Neuronen verursachen, verklumpen. Alternativen wie GS21 und SM1 gefunden für B27 guter Ersatz zu sein.Neurone für länger als eine Woche gewachsen soll jede Woche mit frischem Medium zugeführt werden, wobei ein Drittel des Mediums jede Woche ersetzt.
Diese Methode der Nervenzellen Kultivierung kann von unschätzbarem Wert für Experimente beweisen, dass mit wenig oder gar keiner Glia Kontamination auf reine neuronale Populationen verlassen. Low-Density-Neuronen dieses Verfahrens gezüchtet unter Verwendung der Regel überleben mehrere Wochen mit gut entwickelten Dorne, synaptische Verbindungen und Netzwerkeigenschaften.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von CIHR MOP-142209 auf TJS unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection Instruments | |||
| Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5910 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5650 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5605 | |
| Dumont Forceps (#5) | Roboz | RS-5045 | |
| Dumont Forceps (#PP) | Roboz | RS-4950 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Preparation | |||
| Trypsin (2.5%) | Gibco | 15-090-046 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25-200-072 | |
| Swinnex Filter Holder, 25 mm | EMD Millipore | SX0002500 | Used as cell strainer. Assemble first with filter and autoclave |
| Isoflorane | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | CP0406V2 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| Grade 105 Lens Cleaning Tissue | GE Healthcare | 2105-841 | Used as cell strainer. Assemble first in filter holder and autoclave |
| Glass Pasteur pipettes with cotton filter | VWR | 14672-412 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15-630-080 | |
| Hank's Balanced Salt Solution without Calcium, Magnesium, Phenol Red (HBSS, 10x) | Gibco | 14-185-052 | |
| Glass Pasteur pipettes | VWR | 14672-380 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (Dnase) | Sigma-Aldrich | DN25-100mg | |
| Butane bunsen burner | Wall-Lenk Mfg. Co. | Model 65 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Culture | |||
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15-140-122 | |
| Petri Dish (100 mm) | Fisher | FB0875712 | |
| Petri Dish (60 mm) | Fisher | FB0875713A | |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | Can be used in place of BGS, but each lot must be tested due to inter-lot variation. Heat-inactivation of serum is recommended. |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-1 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) | Gibco | 11-095-080 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21-103-049 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25-030-081 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | Can be used in place of L-Glutamine in the NBG medium |
| Culture Dish (60 mm) | Corning, Inc | 353002 | |
| Culture Flasks (75 cm^2) | Greiner Bio-One | 658170 | |
| Cytarabine (Ara-C) | Sigma-Aldrich | C3350000 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Bovine Growth Serum (BGS) | HyClone | SH3054103 | Heat-inactivation is recommended before use. |
| B27 Supplement (50x) | Gibco | 17-504-044 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418-100ml | |
| Cryogenic Vials | VWR | 89094-806 | |
| DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (APV) | Sigma-Aldrich | A5282 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coverslip Preparation | |||
| Sodium tetraborate decahydrate (borax) | Sigma-Aldrich | B9876-1KG | |
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| Histoplast Paraffin Wax | Fisher | 22-900-700 | |
| Gravity Convection Oven | VWR | 89511-404 | Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol |
| Ultrasonic Bath (Sonicator) | Fisher Scientific | 15337400 | |
| Nitric Acid | Anachemia | 62786-460 | |
| Ceramic Staining Racks | Thomas Scientific | 8542E40 | Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol |
| Coverslips | Glaswarenfabrik Karl Hecht GmbH | 1001/18 | Manufacturer is very important, as neurons do not adhere well to lower quality glass |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B0252 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Miscellaneous | |||
| Sterile Syringe Filters | VWR | 28145-477 | Used with BD syringe for filter-sterilization |
| Syringe | BD | 302832 | Used with VWR sterile syringe filters for fliter-sterilization |
| Water Bath | Fisher Scientific | 15-460-16Q | |
| Inverted Microscope | Olympus | CKX41 | |
| 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | ThermoScientific | 339650 | |
| 50 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | ThermoScientific | 339652 |
References
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- Adamantidis, A., et al. Optogenetics: 10 years after ChR2 in neurons--views from the community. Nat Neurosci. 18, 1202-1212 (2015).
- Ho, V. M., Lee, J. A., Martin, K. C. The cell biology of synaptic plasticity. Science. 334, 623-628 (2011).
- Huganir, R. L., Nicoll, R. A. AMPARs and synaptic plasticity: the last 25 years. Neuron. 80, 704-717 (2013).
- Luscher, C., et al. Role of AMPA receptor cycling in synaptic transmission and plasticity. Neuron. 24, 649-658 (1999).
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- Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. J Neurosci. 6, 3044-3060 (1986).
- Lester, R. A., Quarum, M. L., Parker, J. D., Weber, E., Jahr, C. E. Interaction of 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione with the N-methyl-D-aspartate receptor-associated glycine binding site. Mol Pharmacol. 35, 565-570 (1989).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35, 567-576 (1993).
- Banker, G., Goslin, K. Rat hippocampal neurons in low-density culture. Culturing nerve cells. 2, 339-370 (1998).
- Hanisch, U. K. Microglia as a source and target of cytokines. Glia. 40, 140-155 (2002).
