Summary
Bu makalede, bir glial tek tabakalı üzerinde ters cam lamelleri büyüyen düşük yoğunluklu birincil hipokampal nöronlar kültürleme için protokol açıklar. nöron ve glial tabakalar parafin mumu ile ayrılır. Bu yöntem ile yetiştirilen nöronlar yüksek çözünürlüklü optik görüntüleme ve işlevsel tahliller için uygundur.
Abstract
kültür içinde tek tek sinir hücrelerinin yapısı ve fizyolojisi sonda yeteneği nörobiyolojisinin çalışma için çok önemlidir, ve tek tek hücreler veya tanımlanmış ağlar genetik ve kimyasal manipülasyonu esnekliğe olanak sağlamaktadır. sağlam beyin doku ile karşılaştırıldığında manipülasyon gibi kolaylığı düşük kültür sisteminde daha basittir. Bu birincil nöronların izolasyonu ve büyümesi için birçok yöntemler varsa da, her biri kendi sınırlamaları vardır. Bu protokol daha sonra glial hücrelerin tek bir tabakası üzerinde asılı duran cam lameller, düşük yoğunluklu ve yüksek saflıkta kemirgen embriyonik hippokampal nöronlar yetiştirmek için kullanılan bir yöntem tarif eder. Bu 'sandviç kültürü' altta yatan glial tek tabaka trofik destek için izin verirken nöronların nüfusu münhasır uzun vadeli büyüme için izin verir. nöronlar yeterli yaş ve olgunluk seviyesi olduğunda, nöron lamelleri glial çanak Çıkış ters çevrilmekte ve görüntüleme ya da işlevsel tahlillerde kullanılabilir. Nöronlar gBu yöntemle rown genellikle birkaç hafta boyunca hayatta ve kapsamlı milleri, sinaptik bağlantıları ve ağ özelliklerini geliştirir.
Introduction
Beyin nöronların karmaşık ağlar halinde düzenlenmiştir. ağ etkinliği ve beyin fonksiyonu için bireysel nöronların katkı molekül bileşimi ve bunların fizyolojik özelliklerinin perturbance seçici değiştirilmesi ile incelenebilir. bireysel nöronların genetik ve kimyasal işleme sonrakinin hücresel heterojenlik ve karmaşıklığı ile serbest, sağlam beyin dokusunda daha kültüre edilmiş nöronlarda muhtemelen daha kolaydır. kültürde Nöronlar iyi tanımlanmış aksonal ve dendritik milleri geliştirmek ve birbirleriyle kapsamlı sinaptik bağlantıları oluşturur.
Yetişkin hayvanların veya sinir sisteminin diğer bölgelerden nöron kültürü mümkün olsa da, embriyonik hippokampal kültürler sık sık tarif piramidal hücre popülasyonu ve nispeten düşük glial yoğunluğu 1, 2 nedeniyle tercih edilir. kültürde düşük yoğunlukta yetiştirilir hipokampal nöronlar bilhassa ame olanalt hücresel lokalizasyonu, protein değiş tokuşunu, nöronal polarite ve sinaps gelişimini çalışmaya nable. Kültür nöronlar da kapsamlı sinaptik plastisite 3, 4, 5, 6, moleküler süreçler üzerinde çalışılması olarak kullanılmıştır. Doğum sonrası hayatta olmayan küresel genetik delesyonu olan farelerden alınan Nöron kültürü hazırlıkları belli genlerin 7 hücresel ve sinaptik roller okuyan özellikle yararlıdır olmuştur.
Beyinde gibi, kültürlenmiş hipokampal nöronlar glial hücrelerden trofik desteğine bağlıdır. Bu kendi kültür zorlaştırmaktadır ve bu destek verilir hangi birkaç farklı yöntemlerin geliştirilmesine yol açmıştır. Yaygın olarak kullanılan bir yöntem, glial hücreler 8 ya da edinilmiş Hipp kirletici glial hücreler sağlayan bir tek tabaka üzerine direkt olarak nöronlar kaplama içerirocampal doku çoğalır ve nöronlar 9 altında bir tek katman oluşturmak için. Bu yöntem bazı başarılar sağlamasına rağmen, ortaya çıkan nöronal kültürün kirlilik görüntüleme deneyleri için sakıncalıdır. Nöron kültürü Bir başka sık kullanılan yöntem, tamamen tabaka glial besleyici Çıkış bırakın ve bunun yerine belirli bir büyüme ortamında 10 şeklinde trofik destek sağlamaktır.
Burada, "sandviç" ya da nöron kültürü 2, 11 "Banker" yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntem, daha sonra parafin mumu ile ayrılmış, glial hücrelerin tek bir tabakası üzerinde asılı duran cam lameller üzerinde hipokampal nöronlar kaplama içerir. Bu altta yatan glial tek tabaka trofik destek için izin verirken glia kirletmeden nöronların homojen nüfusun uzun vadeli kültürü kolaylaştırır. Nöronlar yeterli yaş ve olgunluk düzeyine ait olduğunda,nöron lamelleri-çevrilmiş üzerinden glial çanak ve görüntüleme ya da işlevsel tahlillerde kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneyler ve laboratuar hayvanları kullanarak protokolleri Manitoba Üniversitesi Hayvan Etik Kurulu tarafından onaylandı ve Hayvan Bakımı Kanada Konseyi yönergelerine uyumlu idi.
Aletler, Tamponlar ve Solüsyonlar 1. Solüsyonun hazırlanması a
- tüm diseksiyon ekipman, cam Pasteur pipet, pipet uçları, filtre düzeneği ve deiyonize su otoklav ile sterilize edin.
- iyonu giderilmiş su ve filtre-sterilize stok glukoz çözeltisi,% 20 (1.1 M / h) hazırlayın. 4 ° C'de saklayın.
- iyonu giderilmiş su ve filtre-sterilize 100 mM sodyum piruvat çözeltisi hazırlayın. 4 ° C'de saklayın.
- Hazırlama 10% (HBSS 10x), 10 mM HEPES, 100 U / ml penisilin-streptomisin, deiyonize su içinde bir çözelti yapmak suretiyle kalsiyum ve magnezyum içermeyen Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (CMF-HBSS). en fazla 1 veya 2 ay için 4 ° C 'de muhafaza edin.
- 10 mg / ml deoksiribonükleaz hazırlayın I CMF-HBSS içinde (DNaz),ve daha sonra filtre-sterilize ve -20 ° C'de saklayın.
- (Steril çözeltiden), 30 mM glukoz ihtiva eden bir çözelti yaparak glial orta Minimum Esansiyel Ortam (MEM) içinde, 95 U / ml penisilin-streptomisin ve% 10-15 büyükbaş hayvan büyüme serumu (BGS) hazırlayın.
Not: protokol belirtildiği üzere hücre çoğalmasını yavaş gerekirse,% 5 BGS bir çözeltisi kullanılabilir. At Serum yerine BGS kullanılır, ancak her parti nedeniyle arası toplu varyasyonuna kullanılmadan önce test edilmesi gerektiğine dikkat edilebilir. en fazla 1 veya 2 ay için 4 ° C'de hazır çözelti saklayın. Birçok laboratuarlar FBS kullanmak rağmen, sürekli olarak BGS glial büyüme FBS olduğu kadar sağlam olduğunu gözlemledik. BGS kimyasal olarak tanımlanmış bileşenleri ile takviye edilmektedir cenin buzağı serumundan elde edilir. Buna ek olarak, BGS FBS büyük ölçüde daha ekonomiktir. - ihtiva eden bir çözelti yaparak nöron büyümesi ve bakım ortamı (Neuro temelli B27 NBG) Hazırlama 1 x B27 takviyesi ve 500 ml Neurobasal Medi içinde 0.5 mM L-Glutaminum. en fazla 1 veya 2 ay için 4 ° C 'de muhafaza edin. L-Glutamin büyüme ortamı içinde daha stabil olduğu ileri sürülmüştür Glutamax, ile ikame edilebilir.
- MEM (steril çözeltiden), 30 mM glukoz ihtiva eden bir çözelti yaparak orta kaplama nöron (steril çözeltiden), 1 mM sodyum piruvat ve% 10 BGS hazırlayın. en fazla 1 veya 2 ay için 4 ° C 'de muhafaza edin.
- 1 mM sitarabin (Ara-C) çözeltisi ve filtre-sterilize hazırlayın. -20 ° C'de 1 ml kısımlar halinde kısım ve mağaza.
- 100 mN filtre ile sterilize edilmiş NaOH içinde 100 mM APV bir çözelti hazırlayın. -20 ° C'de saklayın.
- 1 mg borat tamponu içinde / mL poli-L-lizin, pH 8.5 (50 mM borik asit ve 12 mM boraks) ve filtre-sterilize çözülür. -20 ° C'de kısım ve mağaza. Bunun yerine, poli-L-lizin, tek hücreler için daha az toksik olabilir poli-L-ornitin kullanabilir.
2. Glia Kültür Hazırlık
- kortikal astroglia hücre kültürü hazırlayın
- % 70 etanol ile yavrular Sprey ve bunları başını kesmek.
- 15 ml CMF-HBSS içeren buz üzerinde 100 mm çanak kafaları yerleştirin.
- , Kafa derisi kesme kafatası açma, beyin sapı ayırma ve daha sonra 3 ml CMF-HBSS içeren buz üzerinde 60 mm Petri tabaklarına beyin aktararak her beyin teşrih.
- Hipokampuslardan gelen hemisferdeki ayırın ve bunları çevreleyen meninks kaldırdığını. meningeal fibroblastlardan az kirlenmesini sağlamak için yeterli önlem olun. kültürde meningeal fibroblastlar büyüme için glia ile rekabet ve nöron sağlığı için zararlı olabilir. 5 ml CMF-HBSS içeren buz üzerinde 60 mm Petri tabağına tüm hemisferdeki toplayın.
- CMF-HBSS çıkarın ve sonra mikro diseksiyon yay makas kullanılarak ince mümkün olduğunca toplanan kortikal doku kıyma.
- pirzola için yeterli CMF-HBSS ekleyinped dokusu. bir cam Pasteur pipeti kullanılarak, bir 15 ml tüp doku parçaları aktarın. CMF-HBSS eklenerek 12 mL toplam hacim getirin.
- 1.5 mL% 2.5 tripsin ve 10 mg / ml DNaz çözüm her ekleyin. 12 dakika için bir su banyosu içinde 37 ° C 'de elde edilen karışımın inkübe edin.
- Doku bir cam Pasteur pipet kullanılarak 10-15 kez Karışım, ve 3 dakika daha bir 37 ° C su banyosu içinde inkübe edilir.
- Lens kağıt veya BGS 5 mL içeren bir 50 ml tüp içine bir filtre keçesi süpernatanın filtre. Bu ayrışmamış doku parçalarını kaldırmak için yapılır. Seçenek olarak ise, ticari olarak temin edilebilen hücre gericileri kullanın.
- Geri kalan doku parçaları içeren tüp CMF-HBSS ve% 2.5 tripsin 1.5 mL, 13.5 mL ekleyin ve ayrıca ilave bir 10 dakika için bir su banyosu içinde 37 ° C sıcaklıkta inkübe edilir.
- bir kez daha geri kalan doku toz haline getirilir, ve daha sonra, ilk filtre ürünü ihtiva eden 50 ml tüp içine yeniden süspansiyon filtre. Daha sonra, durulama leBGS 3 mL ns kağıdı. Nihai hacim yaklaşık 38 ml olmalıdır.
- Santrifüj 130 x g 6 dakika ayrışmış glial hücreler içeren süspansiyon. Dikkatlice cam Pasteur pipeti kullanarak süpernatant atın. altta edilen hücreler rahatsız emin olun. pelet alt kan bileşenleri içeren hafif kırmızımsı görünür.
- pelet kırmızımsı kısmı bozmamaya özen taze tüpe glial orta 1 mL glial hücreler aktarın.
- glial hücreler ayrışmış Birleştirilen yeniden askıya almak için yavru başına glial orta 2 mL kadar ekleyin. Örneğin, 10 köpek yavruları kullanılmıştır, ve daha sonra, toplam yeniden süspansiyon hacmi 20 ml olur.
- Yavru başına bir 75 cm2 hücre kültür şişesi hazırlayın. Her bir şişeye 18 mL önceden ısıtılmış glial orta ekleyin.
- Transferi 2 Her şişeye hücre süspansiyonu ml ve 37 ° C,% 5 CO2 inkübatörü içinde inkübe edilir.
- Bir gün sonra, 20 ml glial m yerineedium. Bu aşamada, kültür glial ve diğer istenmeyen hücre tiplerinin bir karışımıdır.
- Dört gün tohum hücreleri sonra, şiddetli bir şekilde olmayan astrosit hücreleri çıkarmak için şişeler. Bunu yapmak için, CMF-HBSS ile bir kez şişeler durulama ve daha sonra her bir şişeye 10 ml taze CMF-HBSS ekleyin. kuvvetli bir şekilde 5-10 kez çalkalama cam deney şişesinin ve CMF-HBSS aspire. CMF-HBSS ile iki kez durulanır ve daha sonra 20 mL olmak glial orta ekleyin.
NOT: Bu adım hedef olmayan hücre tiplerinin kaldırılmasını sağlamak için çok önemlidir ve istenen astrositlerin kaybına neden olmamalıdır. - Hücreler birleştiklerinde, (Şekil 1) kadar haftada iki kez, taze glial ortamla değiştirin.
- Dondurucu glia
- Kültürler konfluent sonra, ortam aspire edilmiş ve 10 mL CMF-HBSS, hücre tekli tabakası yıkayın.
- Her bir şişeye,% 0.25 tripsin / EDTA, 10 mL ilave edin ve 3 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Musluk şişeler hafifçe hücreleri çıkarmak için. 1 ml BGS t eklemeo, her şişe ve 15 mL tüpler içine hücre süspansiyonları aktarın.
- 6 dakika boyunca 130 x g'de tüpler santrifüjleyin. Elde edilen süpernatant atılır.
- 2 ml glial ortamda hücre pelletini.
- Glial dondurma ortamı (1-kısım dimetil sülfoksit ve 4-parçaları BGS) hazırlayın. şişe başına 4 kriyojenik şişelerin her birine Bu çözeltiye 0.5 mL ekleyin.
- Her bir şişeye, hücre süspansiyonu, 0.5 mL transferi ve daha sonra gece boyunca -80 ° C'de derin dondurucuda, yalıtılmış bir kap içinde şişeleri yerleştirerek yavaşça hücreler dondurma. Bir gün sonra, uzun süreli saklama için sıvı nitrojen dondurucuya şişeleri aktarın.
- Kaplama glia canlandı
- Plaka glia nöron kültürü gününden önce 1-2 hafta.
- ml glial orta ısıtıldı, 10 ile 50 ml tüp hazırlanır.
- 2-3 dakika boyunca, 37 ° C su banyosu içinde glia 1 dondurulmuş şişe çözülme.
- 10 ml glial ortamı içeren 50 ml tüp içine şişe içeriğini aktarın.
- santrifüjyüzer kapalı 5 130 x g'de dakika ve aspirat e tüpü.
- 20 ml glial ortamda pelletini.
- kültür tabaklarına (60 mm) her birine 3 ml taze glial ortamı ilave edin ve daha sonra her bir tabak için hücre süspansiyonu 1 mL aktarın. 37 ° C,% 5 CO2 inkübatörü içinde kültürleri inkübe edin.
- Haftada iki kez hücreleri besleyin. Hücre yoğunluğu,% 50 kaynaşmaya önce de nöron kültürü gün ulaşırsa, glial büyüme hızını yavaşlatmak için,% 5 BGS ihtiva eden glial ortama geçer. % 70 - nöron kültürü için glial tek tabaka istenen izdiham 50% 'dir.
- 1-2 gün nöron kültürü önce NBG ortamı ile glial ortamı (6 ml / tabak) değiştirin.
3. Lamel hazırlanması
- Temizlik ve Parafin Boncuk Hazırlanması
- ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca ultrasonik titremeye maruz bırakılır onları: (yüksek derecede aşındırıcı DİKKAT% 70 ağırlık / ağırlık) konsantre nitrik asit içinde lamelleri daldırın. Diğer laboratuvarlar f varound bu yararlı yerine oda sıcaklığında 12-24 saat boyunca seramik raflar içinde% 70 nitrik asit içinde lamelleri kuluçkalanması.
- Dikkatle kurumsal kurallarına uygun olarak belirlenen bir kimyasal davlumbaz nitrik asit atın. lamelleri deiyonize su ile 3-5 kez yıkayın.
- (Alternatif bir yöntem, aşağıdaki durumların atlama) deiyonize su içinde lamelleri daldırın ve 30 dakika boyunca tekrar sonikasyon.
- deiyonize su çıkarıp lamelleri başka üç kez yıkayın.
- 50 mL deiyonize su içinde lamelleri daldırın ve otoklavlama ile sterilize. Seçenek olarak ise, 6 saat süre ile bir fırında 225 ° C'de lamelleri sterilize edin. Bu alternatif bir yaklaşım kullanılıyorsa, 3.1.9 adıma geçin.
- otoklava sonra aşağıdaki adımlar için steril bir laminer akış başlığı lamelleri aktarın.
- iyonu giderilmiş su çıkarın ve% 100 etanol içinde 20-30 mL ile durulayın.
- % 100 etanol 20-30 ml ilave edilir ve lamelleri transferi ve100 mm Petri tabağına etanol.
- 60 mm Petri tabaklarına, çanak başına 4-5 lamelleri lamelleri aktarmak ve sonra çanak kenarına lamelleri yaslanarak kurumaya izin verilecek şekilde küt bir cımbız kullanarak. Etanol buharlaştırıldıktan sonra, yüzeyde lamelleri düz bir şekilde.
- uygun bir ısıya dayanıklı bir cam şişeye, 10 g parafin aktarın. parafin eritin ve en az 1 saat için bir sıcak plaka üzerinde yaklaşık 150-200 ° C de muhafaza. parafin ısıtılmasının gerektiği için ideal sıcaklık bazı verdiği alabilir. İdeal olmayan sıcaklıklar parafin boncuk doğru boyutu üreten zorluk yol açabilir. erime sonra bekleme süresi sıvı boyunca tutarlı bir sıcaklık sağlamak için yardımcı olur.
- (Her nokta, yaklaşık 120 ° aralıklar ile olmak üzere) her lamel kenarına yakın üç noktalar için dokunun hemen sonra parafin içine Pasteur pipeti Dip ve. damla yaklaşık 0.3-0.5 mm yüksekliğinde boncuk ve çap olarak 1.0-2.0 mm içine katılaşacaktıreter lamel nöronlar ve aşağıdaki glial tek tabaka (Şekil 2) arasında bir boşluk temin etmek üzere işlev görür ve.
- 30 dakika boyunca UV ışığı altında yemekler sterilize ve daha sonra oda sıcaklığında alüminyum folyo ve mağaza ile kapak. Hazırlanan lamelleri saklanır ve bir ay kadar kullanılabilir. Parafin boncuklar kullanmadan önce en az bir hafta süreyle lamelleri uymak izin verilmelidir. Bu protokolün kalan adımları sırasında koparmasını parafin önleyecektir.
- Poli-L-Lisin ile kaplama Lameller
- parafin boncuklar ile daha önce hazırlanmış lamelleri içeren Petri kapları alın.
- Her bir lamel yüzeyine borat tamponu içinde poli-L-lizin, 200 uL ilave edin ve çözelti, oda sıcaklığında, kapalı, bir gece boyunca lamelleri bekletin. Kaplama parafin boncuklar üzerine konulduğu aynı yüzey. uygun şekilde temizlenmiş, poli-L-lizin, kolayca yayılan gerektiğini notlamel yüzeyini kapsayacak şekilde.
- Bir gün sonra, 2 saat her steril deiyonize su içinde ıslatarak iki kez lamelleri yıkayın. Son yıkamadan sonra, çanak başına nöronal kaplama ortamının 4 ml su ile değiştirin. kapak slipleri olmayan yüzey poli-L-lizin ile kaplanmış sonra kurumaya bırakılır önemli olduğunu not edin.
- 37 ° C,% 5 CO2 inkübatörü içinde lamel içeren yemekler yerleştirin. kaplı kapak nöron kültürü önce en az 24 saat süre ile inkübe edilmelidir. Bu nöron kültürü için asal ortam için yapılır.
Hipokampüs ve Kaplama nöronlar 4. Diseksiyon
- (Vajinal fiş keşif gün ölçülen embriyonik gün 18-19) hamile bir sıçan elde edilir ve izofluran anestezi başları kesilerek ya da başka kabul yöntemle euthanize.
- % 70 etanol ile sıçan alt püskürtme ve daha sonra kasık bölgesinde bir uçtan bir uca bir kesikarın boşluğuna sonuna öf. kirlenmesini önlemek için, sadece bu adımda deri yoluyla kesmek için özen gösterin.
- % 70 etanol ile yeniden tahlil durulayın ve rahim maruz karın duvarı içinden kesin. İki rahim boynuzları çıkarın ve steril bir 100 mm Petri tabağına yerleştirin.
- Laminer akış kaputu içinde kalan adımları gerçekleştirin. fetüsleri çevreleyen rahim zarı çıkarın. bunları başını kesmek ve 20 ml CMF-HBSS içeren bir 100 mm petri kafaları yerleştirin.
- beynini inceleyin ve hemen buz üzerine 2 mL CMF-HBSS içeren 60 mm Petri tabağına yerleştirin. bir sonraki aşama için yeterli bir boş alan bırakacak tabak başına 2-3 beyinleri toplayın.
- bir mikroskop altında iki hemisferdeki orta hat meninks kaldırdığını ve hipokampusların teşrih ve 4.5 ml CMF-HBSS içeren 60 mm Petri tabağına yerleştirin. Hipokampus hilal biçimli Struc olarak ayırt edilebilir unutmayınkortikal yarımkürede medial yüzeyinde Ture ve bir ventrikül tarafından yanal sınırlanmıştır olarak çıkarmak kolaydır.
- 15 ml tüp toplandı hipokampal doku ve CMF-HBSS aktarın. % 2.5 tripsin 0.5 mL ekleyin ve daha sonra 10 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. bu nazik ve verimini artırmak, çünkü papain yerine tripsin kullanılabilmektedir.
- Yavaşça tüpün altındaki rahatsız hipokampal doku bırakarak Pasteur pipeti ile tripsin solüsyonu çıkarın.
- 5 dakika boyunca 37 ° C'de kuluçka sırasında yavaşça 5 ml CMF-HBSS ile iki kez doku yıkayın. İkinci yıkamadan sonra, dokuya CMF-HBSS yeterli bir hacminin eklenmesiyle, en az 5 mL toplam hacmi getirmek. 8'e kadar fazla 10 yavrularından hipokampi varsa ml CMF-HBSS eklenebilir.
- Doku disosiasyon için yangın cilalı pipetler iki çeşidini hazırlayın. Bir varyant uç pipet ama ateş cilalı pürüzsüzleştirilmiş kenarları olan normal bir çaptadır. diğer varikarınca yarı yarıya azaltılmış uç çapı olan bir tanesidir. Kısaca, bir alev kaynağı ile çapraz bir cam Pasteur pipet ucu açığa, ve daha sonra pipet uçları inceleyin.
- uç kenarı pürüzsüzleştirilmiş edilmiş ya da çapı azaltılmış kadar yineleyin. Doku bu hücrelerin zarar vermeden tek hücreler elde ayrışmış olduğundan emin olmak için ideal bir çapa bulmak için pratik önemlidir.
- bir düz kenarlı, normal cam Pasteur pipeti ile önce yaklaşık 10 geçiş ile hipokampal doku toz haline getirilir ve indirgenmiş çaplı pipeti ile daha sonra 5 ila 10 geçer. Amaç hiçbir ile hücre veya çok az doku kümeleri homojen çözelti elde etmektir.
- Hemasitometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak hücre yoğunluğu belirleyin. iki hemisferden hipokampi bir araya getirildiğinde tipik olarak, yavru başına 0,8 milyon 1.0 hücreler elde edilir.
- yemekleri hücre süspansiyonu yeterli hacmi aktarın60 mm tabak başına 300,000 hücrelik bir kaplama yoğunluğu elde etmek için orta kaplama 4 mL poli-L-lizin kaplı lamelleri içeren. hücre yoğunluğu amaçlanan deney bağlı olarak, 100,000 ila 500,000 arasında değişebilir.
- 3-4 saat sonra, NBG ortamı glial hücrelerini içeren tabaklar bağlı nöronlarla lamelleri aktarın. Bu nöronlar kaplanmıştır üzerinde tarafı aşağı glial hücre tabakası doğru bakacak şekilde yapılmalıdır. glia çanak başına 4-5 lamelleri toplam ekleyin.
- İki ya da üç gün sonra kaplama, glial büyüme tutuklama çanak başına 5 uM'lik bir son konsantrasyona Ara-C çözüm ekleyin.
- Her bir besleme taze ortam 2.5 mL eski orta 2 mL değiştirerek haftada bir kez hücreler besleyin. eklenen ekstra ortamı zaman içinde buharlaştırma telafi etmek, ve ortamın yalnızca bir kısmı glial hücreler tarafından ortamın sürekli kurutma sağlamak için değiştirilir. Bu kültürler (en az bir ay süreyle tipik sağlıklıŞekil 3). Nöronun hayatta kalması, 100 uM'lik bir son konsantrasyon elde etmek için kültür ortamına APV eklenerek geliştirilebilir. APV bir NMDA reseptör antagonisti olup, glutamat eksitotoksisitesi azaltarak hayatta kalmasını teşvik eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Birincil sinir hücresi kültürünün bu "sandviç" yönteminde, hipokampal nöronlar (Şekil 3) parafin boncuklar (Şekil 2) ile ayrılan glial hücreler (Şekil 1) bir yatakta büyür. Bu nöronlar selektif asgari glial hücre kontaminasyonu ile cam lameller üzerinde büyüyecek ama doku kültürü çanak büyüyen glia yeterli trofik destek almasını sağlamaktadır. Tipik olarak, nöronlar> 3 hafta kültür içinde muhafaza edildi ve bunların tipik defosfo-Tau ve map2 immün sırasıyla (Şekil 4) tarafından tanımlanan, iyi gelişmiş aksonlara ve dentritlere kapsamlı arborisation geliştirmek olabilir. Olgun nöronlar bu bölmelere postsinaptik işaretleyici Drebrin1 seçici lokalizasyon tarafından tanımlanan sinaptik dikenleri geliştirmek. Bu sinaptik dikenleri yakından sinaptik vezikül işaretleyici Synapsin1 imüno lekelenme ile tanımlanan presinaptik uzmanlık için kapatılan edilir.öncesi ve postsinaptik sitelerin yakınlık iyi gelişmiş gösterir ve doğru olarak sinaps hizalanmış. Bu birincil nöronları ve sinaps yapısal ve fonksiyonel çalışmalar için çok uygundur. Bunlar arasında, ancak sinyal iletimi, nöronal polarite, hücre içi trafiği ve sinaps gelişimi ve plastisitenin çalışmalar, bunlarla sınırlı değildir.
Glial kültürlerin Şekil 1. Faz kontrastlı görüntüler dondurulmuş glial stoktan kaplama sonrası, 1 gün 7 gün veya 14 gün kaldırıldı. Ölçek çubuğu, 500 um. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Şekil lamelleri Prepar 2. Yüksek çözünürlüklü görüntülerparafin boncuklar ile ed. (A, B) uygun bir şekilde örnek olarak parafin boncuklar uygulanır. (C, D), yanlış uygulanan parafin boncuk örnekler. α: birden fazla boncuk aynı yerde uygulanmıştır. β: boncuk düzgün lamel üzerinde yer olması başarısız oldu. χ: boncuk lamel merkezine çok yakın uygulanmıştır. δ: boncuk çok yüksekti. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Şekil kültüründe birincil nöronların gelişim aşamaları 3. Faz kontrastlı görüntüler. Ölçek çubuğu, 100 um. Th daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınrakamdır.
Şekil in vitro olarak 17 gün sonra primer nöron 4. immünofloresan ve görüntüler. Nöronlar 12 dakika boyunca PBS içinde% 4 formaldehit,% 4 sukroz ile sabitlenmiş, ve daha sonra 5 dakika süre ile,% 0.25 Triton X-100 ile geçirgen hale getirildi. Birincil antikorlar, PBS içinde% 3 BSA içinde uygulanmış, 30 dakika boyunca PBS içinde% 10 BSA ile bloke edildikten sonra, nöronlar, 4 ° C de bir gece boyunca inkübe edildi. aşağıdaki gibi Birincil antikorlar kullanılmıştır: Anti-sinapsin I (tavşan, 1: 2.000), anti-drebrin (fare IgG1, 1: 8, klon M2F6 hibridoma üst faz), anti-MAP2 (tavuk poliklonal IgY, 1: 5,000), ve anti-Tau-1 (fare IgG2a, 1: 2.000, klon PC1C6; defosforile tau tanır). Hücreler daha sonra, PBS ile yıkandı ve 37 ° C'de 1 saat boyunca PBS içerisinde% 3 BSA içinde uygun türlerin ya da izotip spesifik antikorlarla inkübe edildi. kullanılan ikincil antikorlar, fol gibidiralçak: Alexa anti-fare IgG2a (1: 500) 488 ile konjüge edilmiş, Alexa 568-konjuge anti-tavşan (1: 500), Alexa 647-konjuge edilmiş anti-fare IgG1 (1: 500) ve AMCA-konjuge anti-tavuk IgY (eşek, IgG, 1: 200). Ölçek çubuğu, aşağıda gösterildiği gibi 10 um ve 2.5 um. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kültürleme nöronların "sandviç" yöntemi başka yerlerde iyi anlatılmış olmasına rağmen 2, 11, bunu kabul etmek isteyen araştırmacılar için hayal kırıklığı yol açabilir sadece metin olarak tarif etmek oldukça zordur protokol boyunca çeşitli adımlar vardır.
Glial kültür, lamel hazırlanması ve nöron kültürü ve bakım: yöntem, üç ana iş akışları ayrılabilir. Üç hazırlıkları Her akılda tutulmalıdır yüksek kaliteli nöron kültürlerinde ve çok sayıda önemli hususlar için kritik öneme sahiptir. nöronlar kaplama önce, glial besleyici tabaka ideal olarak astrositlerin homojen nüfus olmalı ve 50-70% izdiham arasında. Bu glial besleyici tabakanın yeterli trofik destek sağlayacaktır. Astroglial kültür attac gevşek olan diğer hücre tiplerinde, özellikle mikroglia, minimal kirlenmesini sahip olmasını sağlamak için önemlidirhed ve yuvarlak hücreler. Nöron sağlık ve hayatta kalma 12 için zararlı olan mikroglia salma sitokinler,. Serum ya at serumu ya da sığır büyüme serumu, partiden partiye değişken olabilir. Serumun kaç seferde dikkatli tarama belirli çok kullanmaya karar vermeden önce yapılmalıdır.
Lamel hazırlık başka önemli bir adımdır. cam ve temizlikte kullanılan protokolün kaliteli sağlıklı iyi gelişmiş nöronlar için kritik öneme sahiptir. yöntem yeni bir laboratuvarda kabul ediliyorsa, birkaç tedarikçilerden cam lamelleri test değerinde olacaktır. Diğer bir sonikatöre sadece 1 saat için bunu yaparken lamelleri temizleme, bazı laboratuar 18-36 saat% 70 nitrik asit içinde lamelleri ıslatın. Temiz lamelleri önemli bir kriter, poli-L-lizin çözeltisi yüzeyi üzerine düzgün biçimde yayılmış olmasıdır. Diğer bir önemli mesele kapak-sliplerine uygulanmış parafin boncuklar uygun yükseklikte olması ve gerektiğidirprotokolde belirtilen çapı ve doğru bir sıcaklığa ısıtılabilir.
nöronlar elde etmek için, hipokampi embriyonik gün 17-19 sıçan disekte edilebilir. Bu aşamada diseksiyon çok az glial hücreler neden olsa da, glial proliferasyon kültür 2-3 gün sonra anti-mitotik ajan Ara-C eklenerek durdurulabilir. Yangın cilalı pipet uçları ile tripsinize hipokampal doku toz haline getirilmesi hücrelerini kendileri zarar vermeden bireysel hücrelere doku ayırmak önemlidir. Bu protokolde kullanılan nöronal büyüme ve bakım ortamı Neurobasal + L-Glutamin + B27 ekidir. L-Glutamin, kültür ortamı içinde daha stabil olduğu Glutamax, ile ikame edilebilir. B27 takviyesi kalite partiden partiye değişebilir ve böylece daha uzun süreli kültürü için özel bir yeri kullanmadan önce test edilmelidir. B27 Zayıf bir sürü nöronlar gelme neden olabilir. Böyle GS21 ve SM1 gibi alternatif ürünler B27 iyi yerine olduğu tespit edilmiştir.orta üçte her hafta değiştirilmiştir, burada daha uzun bir süre bir hafta için yetiştirilir Nöronlar, her hafta taze ortam ile beslenmelidir.
sinir hücrelerinin kültürlenmesi Bu yöntem, çok az veya hiç glial kirlenme saf nöron popülasyonu kullanan deneyler için paha biçilmez olabilir. Bu yöntem kullanılarak yetiştirilen Düşük yoğunluklu nöronlar genellikle iyi gelişmiş milleri, sinaptik bağlantıları ve ağ özelliklerine sahip haftalarca hayatta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma CIHR MOP-142209 TJs için destek verdi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection Instruments | |||
| Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5910 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5650 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5605 | |
| Dumont Forceps (#5) | Roboz | RS-5045 | |
| Dumont Forceps (#PP) | Roboz | RS-4950 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Preparation | |||
| Trypsin (2.5%) | Gibco | 15-090-046 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25-200-072 | |
| Swinnex Filter Holder, 25 mm | EMD Millipore | SX0002500 | Used as cell strainer. Assemble first with filter and autoclave |
| Isoflorane | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | CP0406V2 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| Grade 105 Lens Cleaning Tissue | GE Healthcare | 2105-841 | Used as cell strainer. Assemble first in filter holder and autoclave |
| Glass Pasteur pipettes with cotton filter | VWR | 14672-412 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15-630-080 | |
| Hank's Balanced Salt Solution without Calcium, Magnesium, Phenol Red (HBSS, 10x) | Gibco | 14-185-052 | |
| Glass Pasteur pipettes | VWR | 14672-380 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (Dnase) | Sigma-Aldrich | DN25-100mg | |
| Butane bunsen burner | Wall-Lenk Mfg. Co. | Model 65 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Culture | |||
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15-140-122 | |
| Petri Dish (100 mm) | Fisher | FB0875712 | |
| Petri Dish (60 mm) | Fisher | FB0875713A | |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | Can be used in place of BGS, but each lot must be tested due to inter-lot variation. Heat-inactivation of serum is recommended. |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-1 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) | Gibco | 11-095-080 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21-103-049 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25-030-081 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | Can be used in place of L-Glutamine in the NBG medium |
| Culture Dish (60 mm) | Corning, Inc | 353002 | |
| Culture Flasks (75 cm^2) | Greiner Bio-One | 658170 | |
| Cytarabine (Ara-C) | Sigma-Aldrich | C3350000 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Bovine Growth Serum (BGS) | HyClone | SH3054103 | Heat-inactivation is recommended before use. |
| B27 Supplement (50x) | Gibco | 17-504-044 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418-100ml | |
| Cryogenic Vials | VWR | 89094-806 | |
| DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (APV) | Sigma-Aldrich | A5282 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coverslip Preparation | |||
| Sodium tetraborate decahydrate (borax) | Sigma-Aldrich | B9876-1KG | |
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| Histoplast Paraffin Wax | Fisher | 22-900-700 | |
| Gravity Convection Oven | VWR | 89511-404 | Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol |
| Ultrasonic Bath (Sonicator) | Fisher Scientific | 15337400 | |
| Nitric Acid | Anachemia | 62786-460 | |
| Ceramic Staining Racks | Thomas Scientific | 8542E40 | Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol |
| Coverslips | Glaswarenfabrik Karl Hecht GmbH | 1001/18 | Manufacturer is very important, as neurons do not adhere well to lower quality glass |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B0252 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Miscellaneous | |||
| Sterile Syringe Filters | VWR | 28145-477 | Used with BD syringe for filter-sterilization |
| Syringe | BD | 302832 | Used with VWR sterile syringe filters for fliter-sterilization |
| Water Bath | Fisher Scientific | 15-460-16Q | |
| Inverted Microscope | Olympus | CKX41 | |
| 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | ThermoScientific | 339650 | |
| 50 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | ThermoScientific | 339652 |
References
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Res. 126, 397-425 (1977).
- Kaech, S., Banker, G.
- Adamantidis, A., et al. Optogenetics: 10 years after ChR2 in neurons--views from the community. Nat Neurosci. 18, 1202-1212 (2015).
- Ho, V. M., Lee, J. A., Martin, K. C. The cell biology of synaptic plasticity. Science. 334, 623-628 (2011).
- Huganir, R. L., Nicoll, R. A. AMPARs and synaptic plasticity: the last 25 years. Neuron. 80, 704-717 (2013).
- Luscher, C., et al. Role of AMPA receptor cycling in synaptic transmission and plasticity. Neuron. 24, 649-658 (1999).
- Varoqueaux, F., et al. Neuroligins determine synapse maturation and function. Neuron. 51, 741-754 (2006).
- Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. J Neurosci. 6, 3044-3060 (1986).
- Lester, R. A., Quarum, M. L., Parker, J. D., Weber, E., Jahr, C. E. Interaction of 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione with the N-methyl-D-aspartate receptor-associated glycine binding site. Mol Pharmacol. 35, 565-570 (1989).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35, 567-576 (1993).
- Banker, G., Goslin, K. Rat hippocampal neurons in low-density culture. Culturing nerve cells. 2, 339-370 (1998).
- Hanisch, U. K. Microglia as a source and target of cytokines. Glia. 40, 140-155 (2002).
