Summary
Dit artikel beschrijft het protocol voor het kweken van lage dichtheid primaire hippocampale neuronen groeien op dekglaasjes omgedraaid naar een gliale monolaag. Het neuron en gliale lagen worden gescheiden door paraffinewas kralen. De neuronen gekweekt volgens deze methode geschikt voor hoge-resolutie optische beeldvorming en functionele assays.
Abstract
De mogelijkheid om de structuur en fysiologie van afzonderlijke zenuwcellen in kweek sonde is cruciaal voor de studie van neurobiologie en zorgt voor flexibiliteit in genetische en chemische manipulatie van afzonderlijke cellen of bepaalde netwerken. Dergelijke gemak van manipulatie is eenvoudiger in de gereduceerde cultuur systeem in vergelijking met de intacte hersenweefsel. Hoewel veel methoden voor de isolatie en groei van deze primaire neuronen bestaan, elk heeft zijn eigen beperkingen. Dit protocol beschrijft een werkwijze voor het kweken van lage-dichtheid en hoge zuiverheid knaagdier embryonale hippocampale neuronen op dekglaasjes, die vervolgens over een monolaag van gliale cellen gesuspendeerd. Deze 'sandwich cultuur' zorgt voor een exclusieve lange termijn groei van een populatie van neuronen en tegelijkertijd zorgen voor trofische steun van de onderliggende gliale monolaag. Wanneer neuronen van voldoende leeftijd of volwassenheid kan de neuron dekglaasjes worden omgedraaid-out van de gliale schaal en gebruikt bij beeldvorming of functionele assays. neuronen grown met deze methode meestal overleven gedurende enkele weken en de ontwikkeling van uitgebreide priëlen, synaptische verbindingen, en het netwerk eigenschappen.
Introduction
De hersenen is georganiseerd in ingewikkelde netwerken van neuronen. De bijdrage van individuele neuronen netwerkactiviteit en hersenfunctie kan bestudeerd worden door selectieve verandering van hun moleculaire samenstelling en perturbance hun fysiologische eigenschappen. Genetische en chemische manipulatie van individuele neuronen is misschien wel makkelijker in gekweekte neuronen dan in intacte hersenweefsel, vrij van cellulaire heterogeniteit en complexiteit van laatstgenoemde. Neuronen in kweek te ontwikkelen welbepaalde axonale en dendritische assen en vormen uitgebreide synaptische verbindingen met elkaar.
Terwijl neuron kweek van volwassen dieren of uit andere gebieden van het zenuwstelsel kan worden embryonale hippocampuskweken vaak de voorkeur vanwege hun gedefinieerde piramidale celpopulatie en relatief lage dichtheid gliale 1, 2. Hippocampale neuronen gekweekt bij lage dichtheid in kweek bijzonder ameNable de studie van subcellulaire lokalisatie, eiwittransport, neuronale polariteit en synaps ontwikkeling. Neuronen in cultuur zijn ook op grote schaal gebruikt in het bestuderen van moleculaire processen in synaptische plasticiteit 3, 4, 5, 6. Neuron cultuur bereidingen van muizen met een wereldwijde genetische deleties die niet postnataal wel overleefd hebben zijn vooral nuttig bij het bestuderen van cellulaire en synaptische functies van bepaalde genen 7 geweest.
Zoals in de hersenen, gekweekte hippocampale neuronen afhankelijk trofische ondersteuning van gliacellen. Dit bemoeilijkt hun cultuur, en heeft geleid tot de ontwikkeling van de verschillende manieren waarop deze ondersteuning wordt geleverd. Een algemeen gebruikte werkwijze omvat plating neuronen rechtstreeks op een monolaag van gliacellen 8 of waarbij verontreinigende gliacellen van het verkregen hippocampal weefsel prolifereren en vormen een monolaag onder de neuronen 9. Hoewel deze methode enig succes heeft gevonden, de onzuiverheid van de resulterende neuronale kweek is nadelig voor afbeeldexperimenten. Een andere veel gebruikte werkwijze voor het neuron cultuur te laten-de gliale feeder-laag geheel, en in plaats daarvan trofische ondersteuning in de vorm van een gedefinieerd kweekmedium 10.
Hier beschrijven we de "sandwich" of "Banker" methode van neuron cultuur 2, 11. Deze werkwijze omvat het uitplaten van de hippocampale neuronen op dekglaasjes, die vervolgens over een monolaag van gliacellen gescheiden door paraffinewas kralen gesuspendeerd. Dit vergemakkelijkt langetermijnkweek van een homogene populatie van neuronen zonder verontreinigende glia terwijl voor trofische ondersteuning van de onderliggende gliale monolaag. Wanneer neuronen van voldoende leeftijd of niveau van volwassenheid,het neuron dekglaasjes kan worden omgedraaid-out van de gliale schaal en gebruikt bij beeldvorming of functionele assays.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten en protocollen het gebruik van proefdieren werden goedgekeurd door de Universiteit van Manitoba dier ethische commissie en waren in overeenstemming met de richtlijnen van de Canadian Council on Animal Care.
1. Voorbereiding van de instrumenten, Buffers en oplossingen
- Steriliseren in autoclaaf alle dissectie apparatuur, glas Pasteur pipetten, pipetpunten, filterapparaat, en gedeïoniseerd water.
- Bereid een 20% (w / v; 1.1 M) stock glucoseoplossing in gedeïoniseerd water en filter-steriliseren. Bewaren bij 4 ° C.
- Bereid een 100 mM natriumpyruvaat in gedeïoniseerd water en filter-steriliseren. Bewaren bij 4 ° C.
- Bereid calcium- en magnesium-vrije Hank's gebalanceerde zoutoplossing (CMF-HBSS) door een oplossing van 10% HBSS (10x), 10 mM HEPES en 100 U / ml penicilline-streptomycine in gedeïoniseerd water. Bewaar bij 4 ° C voor niet meer dan 1 tot 2 maanden.
- Bereid 10 mg / ml deoxyribonuclease I (DNase) in CMF-HBSS,en filter-steriliseren en bewaren bij -20 ° C.
- Bereid gliale medium door een oplossing van 30 mM glucose (uit de steriele oplossing), 95 U / ml penicilline-streptomycine, en 10-15% groei runderserum (BGS) in minimaal essentieel medium (MEM).
Opmerking: Zoals in het protocol, kan een oplossing van 5% BGS gebruiken indien vereist om celproliferatie te remmen. Horse serum kan worden gebruikt in plaats van BGS, maar merk op dat elke partij worden getest voor gebruik door inter-batch variatie. Bewaar het bereide oplossing bij 4 ° C voor niet meer dan 1-2 maanden. Hoewel veel laboratoria gebruiken FBS, we consequent waargenomen dat gliale groei van de BGS is zo robuust als in FBS. BGS is afgeleid van foetaal kalfsserum dat wordt aangevuld met chemisch gedefinieerde bestanddelen. Bovendien BGS is aanzienlijk voordeliger dan FBS. - Bereid de groei neuron handhavingsmedium (Neurobasal-B27, NBG) door een oplossing van 1 x B27 supplement en 0,5 mM L-glutamine in 500 ml Neurobasal Medium. Bewaar bij 4 ° C voor niet meer dan 1 tot 2 maanden. L-Glutamine kan zijn gesubstitueerd met GlutaMAX, waarmee gesuggereerd stabieler in het kweekmedium zijn.
- Bereid het neuron plating medium door een oplossing van 30 mM glucose (uit de steriele oplossing), 1 mM natriumpyruvaat (uit de steriele oplossing) en 10% BGS in MEM. Bewaar bij 4 ° C voor niet meer dan 1 tot 2 maanden.
- Bereid een oplossing van 1 mM Cytarabine (Ara-C) en filter-steriliseren. Aliquot in 1 ml porties en bewaar bij -20 ° C.
- Bereid een oplossing van 100 mM APV in 100 mN filter-gesteriliseerd NaOH. Bewaar bij -20 ° C.
- Los 1 mg / ml poly-L-lysine in boraatbuffer, pH 8,5 (50 mM boorzuur, 12 mM borax) en filter-steriliseren. Aliquot en bewaar bij -20 ° C. In plaats van poly-L-lysine kan een poly-L-ornithine die minder toxisch zijn voor cellen kunnen gebruiken.
2. Glia kweekbereiding
- Bereid corticale astroglia celcultuur
- Spuit de pups met 70% ethanol en onthoofden hen.
- Leg de koppen in een 100 mm schaal op ijs met 15 ml CMF-HBSS.
- Ontleden elke hersenen door het snijden van de hoofdhuid, het openen van de schedel, doorsnijden van de hersenstam, en vervolgens over de hersenen tot 60 mm petrischaaltjes op ijs bevattende 3 ml CMF-HBSS.
- Scheid de hersenhelften van de hippocampus en vervolgens ontdoen van de hersenvliezen eromheen. Oefening adequate voorzorgsmaatregelen om minimale besmetting van meningeale fibroblasten te garanderen. Meningeale fibroblasten in de cultuur kan concurreren met glia voor groei en nadelig zijn voor de gezondheid neuron. Verzamel alle hersenhelften in een 60 mm petrischaal op ijs bevattende 5 ml CMF-HBSS.
- Verwijder de CMF-HBSS en vervolgens gehakt de verzamelde corticale weefsel zo fijn mogelijk met behulp van micro-ontleden spring-schaar.
- Voeg voldoende CMF-HBSS aan de chopped weefsel. Met een glazen Pasteur pipet de stukken weefsel een 15 ml buis. Breng het totale volume op 12 ml door toevoegen CMF-HBSS.
- Voeg 1,5 ml elk van 2,5% trypsine en 10 mg / ml DNase oplossing. Incubeer het verkregen mengsel bij 37 ° C in een waterbad gedurende 12 min.
- Vermaal het weefsel 10-15 keer met een glazen Pasteur pipet, en verder incuberen in een 37 ° C waterbad gedurende 3 min.
- Filtreer de bovenstaande vloeistof op lenspapier of filterzeef in een 50 ml buis met 5 ml BGS. Dit wordt gedaan om brokken van ongedissocieerde weefsel te verwijderen. Als alternatief, in de handel verkrijgbare cel zeven.
- Voeg 13,5 ml CMF-HBSS en 1,5 ml 2,5% trypsine aan de buis bevattende de overblijvende weefselstukken en verder incuberen in bij 37 ° C in een waterbad gedurende nog 10 min.
- Vermaal het restmateriaal weer, en filtreer de suspensie opnieuw in de buis 50 mL met het oorspronkelijke filtraat. Vervolgens, spoel de lens papier met 3 ml BGS. Het eindvolume moet ongeveer 38 ml.
- Centrifugeer de suspensie die het gedissocieerde gliacellen gedurende 6 min bij 130 x g. Verwijder voorzichtig het supernatant met behulp van een glas Pasteur pipet. Zorg ervoor dat de gepelleteerde cellen op de bodem niet worden verstoord. De bodem van de pellet wordt lichte rode die bloedbestanddelen.
- Breng de gliale cellen in 1 ml gliale medium in een nieuwe buis, verzorgen het rode gedeelte van de pellet te verstoren.
- Voeg tot 2 ml medium per gliale pup resuspendeer de gecombineerde gedissocieerde gliacellen. Bijvoorbeeld, werden als 10 pups gebruikt, en het totale resuspensie volume 20 ml zou zijn.
- Bereid een 75 cm 2 celkweek kolf per pup. Voeg 18 ml voorverwarmd medium gliale aan elke kolf.
- Overdracht 2 ml celsuspensie aan elke kolf en geïncubeerd in een 37 ° C, 5% CO2 incubator.
- Na een dag, te vervangen door 20 ml gliale medium. In dit stadium, de cultuur is een mix van gliacellen en andere ongewenste celtypen.
- Vier dagen na het zaaien van de cellen, schud de kolven niet-astrocyten cellen los te maken. Hiertoe spoel de flessen een keer met CMF-HBSS en voeg 10 ml vers CMF-HBSS aan elke kolf. Schud de kolven krachtig 5-10 maal, en zuig af CMF-HBSS. Spoel tweemaal met CMF-HBSS en voeg 20 mL gliale medium.
OPMERKING: Deze stap is van cruciaal belang voor de verwijdering van niet-target celtypen te waarborgen, en mag niet leiden tot het verlies van de gewenste astrocyten. - Vervangen door vers medium gliale tweemaal per week totdat de cellen confluent (figuur 1).
- Invriezen glia
- Zodra de kweken confluent zuigen uit het medium en was de celmonolaag met 10 ml CMF-HBSS.
- Voeg 10 ml 0,25% trypsine / EDTA aan elke kolf en geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 3 min.
- Tik kolven voorzichtig om de cellen los te maken. Voeg 1 mL BGS to elke kolf en plaats de celsuspensies in 15 ml buizen.
- Centrifugeer de buizen bij 130 xg gedurende 6 min. Gooi de resulterende supernatant.
- Resuspendeer de celpellet in 2 ml gliale medium.
- Bereid de gliale freezing medium (1-part dimethylsulfoxide en 4-onderdelen BGS). Voeg 0,5 ml van deze oplossing aan elk van 4 cryogene flesjes per kolf.
- Overdracht 0,5 ml celsuspensie aan elk flesje, en vervolgens bevriezen van de cellen langzaam door het plaatsen van de flesjes in een geïsoleerde container in een -80 ° C vriezer gedurende de nacht. Na een dag, dragen de flesjes een vloeibare stikstof vriezer voor langetermijnopslag.
- Plating nieuw leven ingeblazen glia
- Plate glia 1-2 weken voor de neuron cultuur dag.
- Bereid een 50 ml buis met 10 ml verwarmd medium gliale.
- Ontdooi 1 flesje bevroren glia in een 37 ° C waterbad gedurende 2-3 min.
- De inhoud van het flesje in de 50 ml buis met 10 ml gliale medium.
- centrifugee de buis gedurende 5 minuten bij 130 xg en zuig de bovenstaande vloeistof af.
- Resuspendeer de pellet in 20 ml gliale medium.
- Voeg 3 ml vers medium gliale elk van de kweekschalen (60 mm), en vervolgens over 1 ml van de celsuspensie aan elk schaaltje. Incubeer de kweken in een 37 ° C, 5% CO2 incubator.
- Voeden de cellen twee keer per week. Als de celdichtheid van 50% confluentie ruim voor de neuron cultuur dag bereikt, overschakelen naar gliale medium met 5% BGS de gliale groei vertragen. De gewenste samenvloeiing van de gliale monolaag van neuron cultuur is 50% - 70%.
- Vervang het medium met gliale NBG medium (6 ml / plaat) 1-2 dagen voor de neuron cultuur.
3. Bereiding Coverslip
- Reiniging en de voorbereiding van de Paraffine Beads
- Dompelen dekglaasjes in geconcentreerd salpeterzuur (70% w / w; LET zeer corrosief) en ultrasone trillingen ze gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geroerd. Andere laboratoria hebben found het gunstig zijn de dekglaasjes in 70% salpeterzuur incuberen in keramische rekken gedurende 12-24 uur bij kamertemperatuur plaats.
- Verwijder voorzichtig het salpeterzuur in een aangewezen zuurkast volgens de institutionele richtlijnen. Spoel de dekglaasjes 3-5 keer met gedemineraliseerd water.
- Dompel de dekglaasjes in gedeïoniseerd water en ultrasone trillingen ze opnieuw voor 30 min (overslaan als de alternatieve werkwijze).
- Verwijder het gedeïoniseerde water en spoel de dekglaasjes nog drie keer.
- Dompel de dekglaasjes in 50 ml gedeïoniseerd water en steriliseren in de autoclaaf. Alternatief Steriliseer de dekglaasjes bij 225 ° C in een oven gedurende 6 uur. Bij gebruik van deze alternatieve aanpak, verder met stap 3.1.9.
- Eenmaal geautoclaveerd, breng de dekglaasjes in een steriele laminaire stroming kap voor de volgende stappen.
- Verwijder het gedeïoniseerde water en spoel met 20-30 ml 100% ethanol.
- Voeg 20-30 ml 100% ethanol en de overdracht van de dekglaasjes enethanol in een 100 mm petrischaal.
- Stompe pincet om dekglaasjes dragen aan 60 mm petrischalen 4-5 dekglaasjes per schaal, en laat ze aan de lucht drogen leunt de dekglaasjes tegen de rand van de schaal. Zodra de ethanol is verdampt, lag de dekglaasjes plat op het oppervlak.
- Transfer 10 g paraffine met een geschikt hittebestendig glazen fles. Smelt de paraffine en handhaven bij ongeveer 150-200 ° C op een hete plaat gedurende tenminste 1 uur. De ideale temperatuur waaraan de paraffine moet worden verwarmd kunnen sommige tweaking nemen. Niet-ideale temperaturen kunnen leiden tot problemen het produceren van de juiste grootte van de paraffine kralen. De wachttijd na het smelten helpt bij constante temperatuur in de gehele vloeistof.
- Dip een Pasteur pipet in paraffine, en dan snel aanraken drie plekken nabij de rand van elk dekglaasje (elke vlek bij benadering 120 ° uit elkaar). De druppels stollen tot parels van ongeveer 0,3-0,5 mm en 1,0-2,0 mm diameter en zal dienen om een ruimte tussen de neuronen op het dekglaasje en gliale monolaag hieronder (figuur 2) te verschaffen.
- Steriliseer de schotels onder UV-licht gedurende 30 minuten en bedek ze met aluminiumfolie en bewaar bij kamertemperatuur. Voorbereide dekglaasjes kunnen worden opgeslagen en gebruikt voor maximaal een maand. Paraffine kralen moet worden toegestaan om zich te houden aan de dekglaasjes gedurende ten minste één week voor gebruik. Dit voorkomt dat de paraffine losraakt tijdens de overige stappen van het protocol.
- Coverslips bekleden met poly-L-lysine
- Het verkrijgen van platen met vooraf bereide dekglaasjes met de paraffine kralen.
- Voeg 200 ul van poly-L-lysine in boraatbuffer op het oppervlak van elk dekglaasje en laat de oplossing zitten op de dekglaasjes gedurende de nacht behandeld bij kamertemperatuur. Coat hetzelfde oppervlak als dat waarop de paraffine korrels bevinden. Merk op dat als goed schoongemaakt, moet de poly-L-lysine gemakkelijk verspreidenhet oppervlak van het dekglaasje te dekken.
- Na één dag was de dekglaasjes tweemaal door het weken in steriel gedemineraliseerd water gedurende 2 uur elke keer. Na de laatste wassing vervangen het water door 4 ml neuronaal uitplaatmedium per schaal. Merk op dat het belangrijk dat het oppervlak van de dekglaasjes niet opdrogen na te zijn gecoat met poly-L-lysine.
- Plaats het dekglaasje met schotels in een 37 ° C, 5% CO2 incubator. De beklede dekglaasjes worden gedurende ten minste 24 uur vóór het neuron cultuur. Dit wordt gedaan om prime het medium voor neuron cultuur.
4. Dissection van Hippocampus en Plating Neuronen
- Verkrijgen van een zwangere ratten (embryonale dag 18-19, gemeten vanaf de dag van vaginale plug discovery) en euthanaseren met isofluraan verdoofd en onthoofd ander erkend middel.
- Spuit de onderzijde van de rat met 70% ethanol, en vervolgens een snede uit de schaamstreek through aan het einde van de buikholte. Om besmetting te voorkomen, zorg te snijden alleen via de huid op deze stap.
- Spoel de dissectie instrumenten opnieuw met 70% ethanol, en vervolgens dwars door de buikwand naar de baarmoeder bloot. Verwijder de twee eileiders en plaats ze in een steriele 100 mm petrischaal.
- Voer de overige stappen in een laminaire stroming kap. Verwijder het baarmoederslijmvlies rond de foetussen. Onthoofden hen en plaatst de koppen in een 100 mm petrischaal met 20 ml CMF-HBSS.
- Ontleden de hersenen en onmiddellijk plaats ze in een 60 mm petrischaal met 2 ml CMF-HBSS op ijs. Verzamel slechts 2-3 hersenen per gerecht om voldoende ruimte voor de volgende stap mogelijk te maken.
- Onder een dissectiemicroscoop ontdoen van de hersenvliezen van de middellijn van de hersenhelften, en ontleden de hippocampus en plaats ze in een 60 mm petrischaal met 4,5 ml CMF-HBSS. Merk op dat de hippocampus te onderscheiden als een sikkelvormig structuur in het mediale corticale oppervlak van de halve bol, en is gemakkelijk te verwijderen als het zijdelings wordt begrensd door een hartkamer.
- Breng de verzamelde hippocampus weefsel en CMF-HBSS met 15 ml buis. Voeg 0,5 ml 2,5% trypsine, en incubeer bij 37 ° C gedurende 10 minuten. Papaïne kan worden gebruikt in plaats van trypsine omdat het zachter en kunnen opbrengst te verhogen.
- Verwijder de trypsine oplossing Pasteur pipet, waardoor de hippocampus weefsel ongestoord op de bodem van de buis.
- Voorzichtig het weefsel tweemaal wassen met 5 ml CMF-HBSS terwijl incubatie bij 37 ° C gedurende 5 minuten. Na de tweede wassing, breng het totale volume tenminste 5 ml van een voldoende hoeveelheid CMF-HBSS toevoegen aan het weefsel. Als er hippocampus uit meer dan 10 pups tot 8 ml CMF-HBSS worden toegevoegd.
- Bereid twee varianten van-het-vuren gepolijst pipetten voor weefsel dissociatie. De punt van een variant van de normale diameter van de pipet maar met vuur gepolijst glad randen. De andere variant is een met de tip diameter gehalveerd. Kort blootstellen het uiteinde van een glazen Pasteur pipet diagonaal een vlambron, en onderzoekt de uiteinden van de pipetten.
- Herhaal deze stap totdat de bovenrand was glad en de diameter is verkleind. Het is belangrijk om te oefenen om de ideale diameter vinden zodat het weefsel wordt gedissocieerd tot losse cellen werd verkregen zonder beschadiging van deze cellen.
- Vermaal de hippocampus weefsel eerst met ongeveer 10 gaat door een gladde randen normaal glas Pasteur pipet, en daarna nog eens 5-10 gaat door de pipet met de gereduceerde diameter. Het doel is om een homogene oplossing van cellen met geen of zeer weinig weefsel klonten te verkrijgen.
- Bepaal de celdichtheid met behulp van een hemocytometer of geautomatiseerde celteller. Typisch 0,8-1,0 miljoen cellen per pup worden verkregen wanneer hippocampus van de twee hersenhelften worden gecombineerd.
- Overdracht een voldoende volume van de celsuspensie om gerechtenbevattende poly-L-lysine beklede dekglaasjes in 4 ml plaatmedium een uitplaatdichtheid van 300.000 cellen per 60 mm schaal te verkrijgen. De dichtheid van de cellen kan variëren van 100.000 tot 500.000, afhankelijk van het beoogde experiment.
- Na 3-4 uur en spoel de dekglaasjes met neuronen verbonden schalen met gliacellen in NBG medium. Dit moet zodanig gebeuren dat de zijde waarop de neuronen werden geplaat wordt naar beneden naar de gliale cellaag. Voeg een totaal van 4-5 dekglaasjes per glia gerecht.
- Twee of drie dagen na plating, voeg de Ara-C-oplossing tot een uiteindelijke concentratie van 5 uM per schotel naar gliale groei te arresteren.
- Voeden de cellen eenmaal per week vervanging van 2 ml van het oude medium met 2,5 ml vers medium bij elke voeding. De extra medium toegevoegd om te compenseren voor verdamping in de tijd, en slechts een gedeelte van het medium wordt veranderd in overeenstemming conditionering van het medium te verzekeren door de gliacellen. Deze culturen zijn meestal gezond gedurende ten minste één maand (Figuur 3). Neuron overleving kan worden verbeterd door het toevoegen van APV aan het kweekmedium tot een uiteindelijke concentratie van 100 uM. APV is een NMDA-receptorantagonist en bevordert de overleving door het verminderen glutamaat excitotoxiciteit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In deze "sandwich" Werkwijze zenuw primaire celkweek, hippocampale neuronen (Figuur 3) groeien op een bed van gliale cellen (Figuur 1), gescheiden door paraffine kralen (figuur 2). Dit zorgt ervoor dat neuronen selectief groeien op dekglaasjes met een minimale gliacellen besmetting maar voldoende trofische steun van glia groeien op de weefselkweek schotel te ontvangen. Meestal kan neuronen in kweek worden gehandhaafd gedurende> 3 weken en ontwikkelen veel arborisation met goed ontwikkelde axonen en dendrieten die door hun typische dephospho-tau en MAP2 immunokleuring (Figuur 4). Ouder neuronen ontwikkelen synaptische stekels geïdentificeerd door selectieve lokalisatie van postsynaptische marker Drebrin1 om deze compartimenten. Deze synaptische stekels zijn nauw apposed presynaptische specialisaties, die worden gekenmerkt door synaptischeblaasjeseiwit marker Synapsin1 immunokleuring. Denabijheid van pre- en postsynaptische plaatsen geeft een goed ontwikkelde en in de juiste richting synapsen. Deze primaire neuronen zijn zeer geschikt voor functionele en structurele studies van neuronen en synapsen. Deze omvatten, maar zijn niet beperkt tot studies van signaaltransductie, neuronale polariteit subcellulaire handel en synaps ontwikkeling en plasticiteit.
Figuur 1. Fase contrastrijke beelden van glialculturen genomen 1 dag, 7 dagen, of 14 dagen na plating uit bevroren gliale voorraad. Schaalbalk 500 urn. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Hoge-resolutie afbeeldingen van dekglaasjes prepared met paraffine kralen. (A, B) Voorbeelden van juist toegepast paraffine kralen. (C, D) Voorbeelden van onjuist toegepast paraffine kralen. α: Meer dan één korrel werd aangebracht op dezelfde locatie. β: De kraal niet juist geplaatst worden op het dekglaasje. χ: De kraal is te dicht bij het centrum van het dekglaasje aangebracht. δ: De kraal is te hoog. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Fase contrast beelden van de ontwikkelingsstadia van primaire neuronen in de cultuur. Schaalbalk 100 urn. Klik hier om een grotere versie van th bekijkenis figuur.
Figuur 4. Immunofluorescentie beelden van primaire neuronen 17 dagen in vitro. De neuronen werden gefixeerd met 4% formaldehyde en 4% sucrose in PBS gedurende 12 min, en vervolgens gepermeabiliseerd met 0,25% Triton X-100 gedurende 5 minuten. Na het blokkeren met 10% BSA in PBS gedurende 30 minuten werden de neuronen overnacht geïncubeerd bij 4 ° C met primaire antilichamen in 3% BSA in PBS toegepast. Primaire antilichamen werden als volgt gebruikt: anti-synapsin I (konijn, 1: 2000), anti-drebrin (muizen IgG1, 1: 8, kloon M2F6, hybridoma supernatant), anti-MAP2 (kippen polyklonaal IgY, 1: 5000), en anti-tau-1 (muizen IgG2a, 1: 2.000, kloon PC1C6; erkent gedefosforyleerd tau). De cellen werden vervolgens gewassen met PBS en geïncubeerd met geschikte species-of isotype specifieke secundaire antilichamen in 3% BSA in PBS gedurende 1 uur bij 37 ° C. Secundaire antilichamen waren als follows: Alexa 488-geconjugeerde anti-muizen IgG2a (1: 500), Alexa 568-geconjugeerde anti-konijn (1: 500), Alexa 647-geconjugeerde anti-muizen IgG1 (1: 500) en AMCA-geconjugeerd anti-chicken IgY (ezel IgG, 1: 200). Schaalstaaf, 10 urn en 2,5 urn, zoals aangegeven. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Terwijl de "sandwich" methode voor het kweken van neuronen is elders goed beschreven 2, 11, zijn er verschillende stappen in het hele protocol dat heel moeilijk om alleen te beschrijven in de tekst zijn, wat kan leiden tot frustratie voor onderzoekers die wensen aan te nemen.
De methode kan worden onderverdeeld in drie brede workflows: gliale cultuur, dekglaasje voorbereiding en neuron cultuur en onderhoud. Elk van de drie voorbereidingen zijn van cruciaal belang voor hoogwaardige neuron culturen en een aantal belangrijke overwegingen moeten in gedachten worden gehouden. Voordat plating neuronen, zou de gliale feeder-laag idealiter een homogene populatie van astrocyten zijn en tussen de 50-70% samenvloeiing. Zulks zou voldoende trofische ondersteuning van de gliale feeder-laag. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de astroglial cultuur heeft een minimale besmetting van andere celtypen, in het bijzonder microglia, die losjes zijn Attached en afgeronde cellen. Microglia vrijlating cytokines, die schadelijk zijn voor neuron gezondheid en overleving 12 zijn. Het serum, hetzij paardenserum of rundergroeihormoon serum, kan verschillende van partij tot partij zijn. Zorgvuldige screening van verschillende percelen van het serum dient te worden uitgevoerd alvorens te besluiten tot een specifieke partij te gebruiken.
Coverslip voorbereiding is een belangrijke stap. De kwaliteit van het glas en het protocol dat wordt gebruikt in de reiniging zijn van cruciaal belang voor een gezonde goed ontwikkelde neuronen. Als de methode pas in een laboratorium wordt aangenomen, zou het de moeite waard het testen van glas dekglaasjes van verschillende leveranciers. Voor het reinigen van de dekglaasjes sommige laboratoria geniet dekplaatjes in 70% salpeterzuur gedurende 18-36 uur, terwijl anderen dat slechts 1 h in een sonicator. Een belangrijk criterium schone dekglaasjes is dat de poly-L-lysine oplossing gelijkmatig moet over het oppervlak. Een andere belangrijke overweging is dat de paraffinewas kralen aangebracht op de dekglaasjes van voldoende hoogte moeten zijn endiameter en worden verwarmd tot de juiste temperatuur, zoals in het protocol.
Voor het verkrijgen van neuronen, hippocampus kan worden ontleed uit embryonale dag 17-19 ratten. Hoewel dissectie in dit stadium leidt tot zeer weinig gliacellen, kan gliaproliferatie worden gearresteerd door het toevoegen van de anti-mitotische middel Ara-C na 2-3 dagen van de cultuur. Trituratie van getrypsineerd hippocampus weefsel door een brand-gepolijste pipet tips is van cruciaal belang om het weefsel in afzonderlijke cellen te scheiden zonder schade aan de cellen zelf. Neuronale groei en het onderhoud medium toegepast in dit protocol Neurobasal + L-glutamine + B27 supplement. L-Glutamine kan zijn gesubstitueerd met GlutaMAX, die stabieler in het kweekmedium. De kwaliteit van de B27 supplement kan variëren van partij tot partij, en dus het moet worden getest voordat het gebruik van een specifieke partij voor langere cultuur termijn. Een slechte veel B27 kan veroorzaken neuronen te klonteren. Alternatieve producten zoals GS21 en SM1 zijn gevonden om goede vervangers voor B27 zijn.Neuronen gekweekt langer dan een week te worden gevoed met vers medium elke week, waarbij een derde van het medium wordt elke week vervangen.
Deze methode van het kweken van zenuwcellen onschatbare waarde voor experimenten die afhankelijk zuivere neuronale populaties met weinig of geen verontreiniging gliale bewijzen. Low-density neuronen geteeld met behulp van deze methode meestal overleven gedurende enkele weken met goed ontwikkelde priëlen, synaptische verbindingen en het netwerk eigenschappen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door CIHR MOP-142209 naar TJS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection Instruments | |||
| Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5910 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5650 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5605 | |
| Dumont Forceps (#5) | Roboz | RS-5045 | |
| Dumont Forceps (#PP) | Roboz | RS-4950 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Preparation | |||
| Trypsin (2.5%) | Gibco | 15-090-046 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25-200-072 | |
| Swinnex Filter Holder, 25 mm | EMD Millipore | SX0002500 | Used as cell strainer. Assemble first with filter and autoclave |
| Isoflorane | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | CP0406V2 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| Grade 105 Lens Cleaning Tissue | GE Healthcare | 2105-841 | Used as cell strainer. Assemble first in filter holder and autoclave |
| Glass Pasteur pipettes with cotton filter | VWR | 14672-412 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15-630-080 | |
| Hank's Balanced Salt Solution without Calcium, Magnesium, Phenol Red (HBSS, 10x) | Gibco | 14-185-052 | |
| Glass Pasteur pipettes | VWR | 14672-380 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (Dnase) | Sigma-Aldrich | DN25-100mg | |
| Butane bunsen burner | Wall-Lenk Mfg. Co. | Model 65 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Culture | |||
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15-140-122 | |
| Petri Dish (100 mm) | Fisher | FB0875712 | |
| Petri Dish (60 mm) | Fisher | FB0875713A | |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | Can be used in place of BGS, but each lot must be tested due to inter-lot variation. Heat-inactivation of serum is recommended. |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-1 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) | Gibco | 11-095-080 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21-103-049 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25-030-081 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | Can be used in place of L-Glutamine in the NBG medium |
| Culture Dish (60 mm) | Corning, Inc | 353002 | |
| Culture Flasks (75 cm^2) | Greiner Bio-One | 658170 | |
| Cytarabine (Ara-C) | Sigma-Aldrich | C3350000 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Bovine Growth Serum (BGS) | HyClone | SH3054103 | Heat-inactivation is recommended before use. |
| B27 Supplement (50x) | Gibco | 17-504-044 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418-100ml | |
| Cryogenic Vials | VWR | 89094-806 | |
| DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (APV) | Sigma-Aldrich | A5282 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coverslip Preparation | |||
| Sodium tetraborate decahydrate (borax) | Sigma-Aldrich | B9876-1KG | |
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| Histoplast Paraffin Wax | Fisher | 22-900-700 | |
| Gravity Convection Oven | VWR | 89511-404 | Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol |
| Ultrasonic Bath (Sonicator) | Fisher Scientific | 15337400 | |
| Nitric Acid | Anachemia | 62786-460 | |
| Ceramic Staining Racks | Thomas Scientific | 8542E40 | Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol |
| Coverslips | Glaswarenfabrik Karl Hecht GmbH | 1001/18 | Manufacturer is very important, as neurons do not adhere well to lower quality glass |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B0252 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Miscellaneous | |||
| Sterile Syringe Filters | VWR | 28145-477 | Used with BD syringe for filter-sterilization |
| Syringe | BD | 302832 | Used with VWR sterile syringe filters for fliter-sterilization |
| Water Bath | Fisher Scientific | 15-460-16Q | |
| Inverted Microscope | Olympus | CKX41 | |
| 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | ThermoScientific | 339650 | |
| 50 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | ThermoScientific | 339652 |
References
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Res. 126, 397-425 (1977).
- Kaech, S., Banker, G.
- Adamantidis, A., et al. Optogenetics: 10 years after ChR2 in neurons--views from the community. Nat Neurosci. 18, 1202-1212 (2015).
- Ho, V. M., Lee, J. A., Martin, K. C. The cell biology of synaptic plasticity. Science. 334, 623-628 (2011).
- Huganir, R. L., Nicoll, R. A. AMPARs and synaptic plasticity: the last 25 years. Neuron. 80, 704-717 (2013).
- Luscher, C., et al. Role of AMPA receptor cycling in synaptic transmission and plasticity. Neuron. 24, 649-658 (1999).
- Varoqueaux, F., et al. Neuroligins determine synapse maturation and function. Neuron. 51, 741-754 (2006).
- Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. J Neurosci. 6, 3044-3060 (1986).
- Lester, R. A., Quarum, M. L., Parker, J. D., Weber, E., Jahr, C. E. Interaction of 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione with the N-methyl-D-aspartate receptor-associated glycine binding site. Mol Pharmacol. 35, 565-570 (1989).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35, 567-576 (1993).
- Banker, G., Goslin, K. Rat hippocampal neurons in low-density culture. Culturing nerve cells. 2, 339-370 (1998).
- Hanisch, U. K. Microglia as a source and target of cytokines. Glia. 40, 140-155 (2002).
