Summary
Denne artikel beskriver protokollen for dyrkning lav massefylde primære hippocampale neuroner vokser på dækglas inverterede over en glial monolag. Neuron og gliale lag er adskilt af paraffin perler. Neuronerne dyrket ved denne fremgangsmåde er egnede til høj opløsning optisk billeddannelse og funktionelle assays.
Abstract
Evnen til at probe struktur og fysiologi af individuelle nerveceller i kultur er afgørende for studiet af neurobiologi, og giver mulighed for fleksibilitet i genetisk og kemisk manipulation af de enkelte celler eller definerede netværk. Sådan lethed af manipulation er enklere i det reducerede dyrkningssystem sammenlignet med det intakte hjernevæv. Mens mange metoder til isolering og vækst af disse primære neuroner findes, hver har sine egne begrænsninger. Denne protokol beskriver en fremgangsmåde til dyrkning med lav massefylde og høj renhed gnaver embryoniske hippocampale neuroner på dækglas, som derefter ophængt over et monolag af gliaceller. Denne 'sandwich kultur' giver mulighed for eksklusiv langsigtet vækst af en population af neuroner samtidig med at trofisk støtte fra den underliggende glial monolag. Når neuroner er af tilstrækkelig alder eller modenhed kan neuron dækglas vendes ud af den glial skålen og anvendes ved billeddannelse eller funktionelle assays. neuroner grown ved denne metode typisk overleve i flere uger og udvikle omfattende dorne, synaptiske forbindelser og netværk egenskaber.
Introduction
Hjernen er organiseret i indviklede netværk af neuroner. Bidrag individuelle neuroner til netværksaktivitet og hjernens funktion kan studeres ved selektiv ændring af deres molekylære sammensætning og perturbance af deres fysiologiske egenskaber. Genetisk og kemisk manipulation af individuelle neuroner er velsagtens lettere i dyrkede neuroner end i intakt hjernevæv, er behæftet med sidstnævntes celleheterogenitet og kompleksitet. Neuroner i kultur udvikle veldefineret aksonal og dendritiske dorne og danner omfattende synaptiske forbindelser med hinanden.
Mens neuron kultur fra voksent dyr eller fra andre regioner i nervesystemet er muligt, embryonale hippocampuskulturer ofte foretrækkes på grund af deres definerede pyramideformet cellepopulation og relativt lave glial tæthed 1, 2. Hippocampale neuroner dyrket ved lav densitet i kultur er særligt amenable til studiet af subcellulær lokalisering, protein trafficking, neuronal polaritet og synapse udvikling. Neuroner i kultur er også blevet ekstensivt anvendt i at studere molekylære processer i synaptisk plasticitet 3, 4, 5, 6. Neuron kultur præparater fra mus med globale genetiske sletninger, som ikke overlever postnatalt har været særligt nyttigt til at studere cellulære og synaptiske roller visse gener 7.
Som i hjernen, dyrkede hippocampale neuroner er afhængige af trofisk støtte fra gliaceller. Dette komplicerer deres kultur, og har ført til udviklingen af flere forskellige metoder, hvorved denne støtte gives. En almindeligt anvendt metode involverer plating neuroner direkte på et monolag af gliaceller 8 eller tillader forurenende gliaceller fra den erhvervede hippocampal væv til at formere sig og danne et monolag under neuronerne 9. Selv om denne fremgangsmåde har fundet en vis succes, urenhed af den resulterende neuronal kultur er ufordelagtig for billeddannelse eksperimenter. En anden almindeligt anvendt fremgangsmåde til neuron kultur er at forlade-out glial fødelag helt, og i stedet tilvejebringe trofisk støtte i form af et defineret vækstmedium 10.
Her beskriver vi den "sandwich" eller "Banker" metode til neuron kultur 2, 11. Denne fremgangsmåde involverer udpladning af de hippocampale neuroner på dækglas, som derefter ophængt over et monolag af gliaceller adskilt af paraffin perler. Dette letter langsigtede kultur af en homogen population af neuroner uden at forurene glia samtidig med at trofisk støtte fra den underliggende glial monolag. Når neuroner er af tilstrækkelig alder eller modenhed,Neuron dækglas kan vendes ud af den glial skålen og anvendes ved billeddannelse eller funktionelle assays.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter og protokoller anvender forsøgsdyr blev godkendt af University of Manitoba dyreetik udvalg og var i overensstemmelse med retningslinjerne fra den canadiske Rådet om Animal Care.
1. Fremstilling af Instrumenter, Buffere og opløsninger
- Der steriliseres ved autoklavering alle dissektion udstyr, glas Pasteur-pipetter, pipettespidser, filterapparat, og deioniseret vand.
- Fremstil en 20% (vægt / volumen; 1,1 M) lager glucoseopløsning i deioniseret vand og filter-sterilisere. Opbevares ved 4 ° C.
- Forberede en 100 mM natriumpyruvat opløsning i deioniseret vand og filter-sterilisere. Opbevares ved 4 ° C.
- Forberede calcium- og magnesium-fri Hanks Balanced Salt Solution (CMF-HBSS) ved at gøre en opløsning af 10% HBSS (10x), 10 mM HEPES, og 100 U / ml penicillin-streptomycin i deioniseret vand. Opbevares ved 4 ° C i ikke mere end 1 til 2 måneder.
- Forbered 10 mg / ml deoxyribonuclease I (DNase) i CMF-HBSS,og derefter foretage-sterilisere og opbevare ved -20 ° C.
- Forberede glial medium ved at gøre en opløsning af 30 mM glucose (fra den sterile opløsning), 95 U / ml penicillin-streptomycin og 10-15% bovint vækst serum (BGS) i Minimum Essential Medium (MEM).
BEMÆRK: Som anført i protokollen, kan en opløsning af 5% BGS om nødvendigt anvendes for at bremse celleproliferation. Hest Serum kan anvendes i stedet for BGS, men bemærk, at hvert parti skal afprøves før brug på grund af inter-batch variation. den fremstillede opløsning ved 4 ° C lagre i ikke mere end 1 til 2 måneder. Selvom mange laboratorier anvender FBS, vi konsekvent observeret, at glia vækst i BGS er så robust som i FBS. BGS er afledt af føtalt kalveserum som suppleres med kemisk definerede komponenter. Desuden BGS er væsentligt mere økonomisk end FBS. - Forbered neuron vækst og vedligeholdelsesmedium (Neurobasal-B27, NBG) ved at gøre en opløsning af 1x B27 supplement og 0,5 mM L-glutamin i 500 ml Neurobasal Medium. Opbevares ved 4 ° C i ikke mere end 1 til 2 måneder. L-Glutamin kan være substitueret med GlutaMAX, der er blevet foreslået at være mere stabil i vækstmediet.
- Forbered neuron udpladningsmedium ved at gøre en opløsning af 30 mM glucose (fra den sterile opløsning), 1 mM natriumpyruvat (fra den sterile opløsning), og 10% BGS i MEM. Opbevares ved 4 ° C i ikke mere end 1 til 2 måneder.
- Fremstil en opløsning af 1 mM cytarabin (Ara-C) og filter-sterilisere. Alikvot i 1 ml portioner og opbevares ved -20 ° C.
- Forberede en opløsning af 100 mM APV i 100 mN filtersteriliseret NaOH. Opbevares ved -20 ° C.
- Opløs 1 mg / ml poly-L-lysin i boratbuffer, pH 8,5 (50 mM borsyre og 12 mM borax) og filter-sterilisere. Alikvot og opbevares ved -20 ° C. I stedet for poly-L-lysin, kan man anvende poly-L-ornithin, som kan være mindre toksiske for celler.
2. Glia Culture Fremstilling
- Forberede kortikal astroglia cellekultur
- Spray hvalpene med 70% ethanol og halshugge dem.
- Placer hovederne i en 100 mm skål på is indeholdende 15 ml CMF-HBSS.
- Dissekere ud hver hjerne ved at skære hovedbunden, åbning af kraniet, overskæring hjernestammen, og derefter overføre hjernen til 60 mm petriskåle på is indeholdende 3 ml CMF-HBSS.
- Adskil de cerebrale halvkugler fra hippocampi og derefter fratage væk meninges omgiver dem. Udvis tilstrækkelig forholdsregler for at sikre minimal forurening fra meningeal fibroblaster. Meningiale fibroblaster i kultur kan konkurrere med glia for vækst og være til skade for neuron sundhed. Indsamle alle de cerebrale hemisfærer i en 60 mm petriskål på is indeholdende 5 ml CMF-HBSS.
- Fjern CMF-HBSS, og derefter hakke de indsamlede cortexvæv så fint som muligt under anvendelse af mikro-dissekere forår-saks.
- Tilføj tilstrækkelig CMF-HBSS til chopped væv. Ved anvendelse af en glas Pasteur pipette vævsstykkerne til et 15 ml rør. Bringe det totale volumen til 12 ml ved tilsætning af CMF-HBSS.
- Tilføje 1,5 ml af hver af 2,5% trypsin og 10 mg / ml DNase-opløsning. Inkubere den resulterende blanding ved 37 ° C i et vandbad i 12 min.
- Udriv vævet 10-15 gange ved anvendelse af en glas Pasteur-pipette, og yderligere inkubere det i et 37 ° C vandbad i 3 minutter.
- Filtrere supernatanten gennem linsepapir eller en filtermåtten ind i et 50 ml rør, der indeholder 5 ml BGS. Dette gøres for at fjerne klumper af udissocieret væv. Alternativt anvende kommercielt tilgængelige celle sier.
- Tilføje 13,5 ml CMF-HBSS, og 1,5 ml 2,5% trypsin til røret indeholdende de resterende vævsstykker og længere inkubere det ved 37 ° C i et vandbad i yderligere 10 min.
- Udriv resterende væv en gang mere, og derefter filtrere suspensionen igen ind i 50 ml rør indeholdende det oprindelige filtrat. Dernæst skylles lens papir med 3 ml af BGS. Slutvolumenet skal være ca. 38 ml.
- Centrifuger suspensionen indeholdende de dissocierede gliaceller i 6 min ved 130 x g. kassere omhyggeligt supernatanten under anvendelse af en glas Pasteur-pipette. Sørg for, at de pelleterede celler i bunden ikke forstyrres. Bunden af pelleten vises lidt rødlig indeholdende blodkomponenter.
- Overfør gliaceller i 1 ml glial medium i et frisk rør, pas på ikke at forstyrre den rødlige del af pelleten.
- Tilføje op til 2 ml af glial medium pr pup at opblande kombinerede dissocierede gliaceller. For eksempel blev hvis 10 hvalpe bruges, og derefter den samlede resuspension volumen blev 20 ml.
- Forberede en 75 cm2 cellekulturkolbe per pup. Tilføje 18 ml foropvarmet glial medium til hver kolbe.
- Transfer 2 ml cellesuspension til hver kolbe og inkuber i et 37 ° C, 5% CO2 inkubator.
- Efter én dag udskifte med 20 ml glial medium. På dette stadium, at kultur er en blanding af glia og andre uønskede celletyper.
- Fire dage efter podning af cellerne, energisk ryste kolberne at fordrive ikke-astrocytceller. For at gøre dette, skylles kolberne en gang med CMF-HBSS, og derefter tilføje 10 ml frisk CMF-HBSS til hver kolbe. Rystes kraftigt 5-10 gange, og derefter suge fra CMF-HBSS. Skylles to gange med CMF-HBSS, og derefter tilsættes 20 ml glial medium.
BEMÆRK: Dette trin er afgørende for at sikre fjernelse af ikke-mål-celletyper, og bør ikke resultere i tab af de ønskede astrocytter. - Erstatte med frisk glial medium to gange om ugen, indtil cellerne er sammenflydende (figur 1).
- nedfrysning glia
- Når kulturerne sammenflydende, aspireres fra mediet og vaskes cellemonolaget med 10 ml CMF-HBSS.
- Tilsættes 10 ml 0,25% trypsin / EDTA til hver kolbe og inkuberes ved 37 ° C i 3 minutter.
- Tap kolber forsigtigt for at løsne cellerne. Tilsæt 1 ml BGS to hver kolbe og overføre cellesuspensionerne i 15 ml rør.
- Centrifuger rørene ved 130 xg i 6 min. Kassere den resulterende supernatant.
- Resuspender cellepelleten i 2 ml glial medium.
- Forbered glial frysning medium (1-del dimethylsulfoxid og 4-dele BGS). Tilsæt 0,5 ml af denne opløsning til hver af 4 kryogene hætteglas pr kolbe.
- Overfør 0,5 ml cellesuspension til hvert hætteglas, og derefter fryse cellerne langsomt ved at anbringe hætteglassene i en isoleret beholder i en -80 ° C fryser natten over. Efter én dag overføre hætteglassene til en fryser med flydende nitrogen til langtidsopbevaring.
- Belægning genoplivet glia
- Plate glia 1-2 uger før neuron kultur dag.
- Fremstille en 50 ml rør med 10 ml opvarmet glial medium.
- Tø 1 frosset hætteglas af glia i et 37 ° C vandbad i 2-3 minutter.
- Overfør indholdet af hætteglasset ind i 50 ml rør indeholdende 10 ml glial medium.
- centrifugee røret i 5 minutter ved 130 xg og aspirat fra supernatanten.
- Pellet resuspenderes i 20 ml glial medium.
- Tilsæt 3 ml frisk glial medium til hver af dyrkningsskåle (60 mm), og derefter overføre 1 ml af cellesuspensionen til hver skål. Inkuber kulturerne i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator.
- Foder cellerne to gange om ugen. Hvis celletætheden når 50% konfluens godt før neuron kultur dag, skifte til glial medium indeholdende 5% BGS at bremse glial vækst. Den ønskede sammenløbet af glial monolag for neuron kultur er 50% - 70%.
- Erstatte den glial medium med NBG medium (6 ml / skål) 1-2 dage før neuron kultur.
3. Coverslip Fremstilling
- Rengøring og Fremstilling af Paraffin Beads
- Nedsænkes dækglas i koncentreret salpetersyre (70% vægt / vægt; ADVARSEL: stærkt ætsende) og sonikeres dem i 30 minutter ved stuetemperatur. Andre laboratorier har found det gavnligt at inkubere dækglassene i 70% salpetersyre i keramiske stativer til 12-24 timer ved stuetemperatur i stedet.
- kassere forsigtigt salpetersyre i en udpeget stinkskab i overensstemmelse med de institutionelle retningslinier. Skyl dækglassene 3-5 gange med deioniseret vand.
- Dykke dækglassene i deioniseret vand og lydbehandling dem igen i 30 minutter (spring hvis ved den alternative metode).
- Fjern deioniseret vand og skyl dækglas yderligere tre gange.
- Dykke dækglassene i 50 ml deioniseret vand, og der steriliseres dem ved autoklavering. Alternativt sterilisere dækglassene ved 225 ° C i en ovn i 6 timer. Hvis du bruger denne alternative tilgang, gå til trin 3.1.9.
- Når autoklaveret, overføre dækglassene til en steril laminar strømning hætte til de følgende trin.
- Fjerne det deioniserede vand og skyl med 20-30 ml 100% ethanol.
- Tilføj 20-30 ml 100% ethanol og overføre dækglas ogethanol til en 100 mm petriskål.
- Brug stumpe pincet til at overføre dækglas til 60 mm petriskåle, 4-5 dækglas pr fad, og derefter lade dem lufttørre ved at læne dækglassene mod kanten af skålen. Når ethanol er fordampet, lå dækglassene fladt på overfladen.
- Overfør 10 g paraffin til en egnet varmebestandigt glasflaske. Smelt paraffin og vedligeholde det ved ca. 150-200 ° C på en varmeplade i mindst 1 time. Den ideelle temperatur, til hvilken paraffin bør opvarmes kan tage nogle tilpasse. Ikke-ideelle temperaturer kan føre til vanskeligheder ved at producere den korrekte størrelse af paraffin perler. Venteperioden efter smeltning med til at sikre ensartet temperatur i hele væsken.
- Dyp en pasteurpipette ind i paraffin, og derefter hurtigt røre den til tre pletter nær kanten af hvert dækglas (hver plet er ca. 120 ° fra hinanden). Dråberne vil størkne til perler ca. 0,3-0,5 mm høje og 1,0-2,0 mm i diameter og vil fungere for at tilvejebringe et rum mellem neuronerne på dækglasset og glial monolag nedenfor (figur 2).
- Sterilisere retterne under UV lys i 30 minutter, og derefter dække dem med aluminiumsfolie og opbevares ved stuetemperatur. Tilberedt dækglas kan gemmes og anvendes i op til en måned. Paraffin perler skal have lov til at overholde de dækglas i mindst en uge før brug. Dette vil hindre paraffin går løs under de resterende trin i protokollen.
- Coating Dækglas med Poly-L-lysin
- Opnå Petriskåle indeholdende tidligere fremstillede dækglas med paraffin perler.
- Tilsæt 200 pi af poly-L-lysin i boratbuffer til overfladen af hver dækglas og lad opløsningen sidde på dækglassene natten overdækket ved stuetemperatur. Belægge samme overflade som den, hvorpå de paraffin perler er beliggende. Bemærk, at hvis ordentligt rengjort, skal poly-L-lysin let spredesat dække overfladen af dækglasset.
- Efter én dag vaskes dækglassene to gange ved opblødning dem i sterilt deioniseret vand i 2 timer hver gang. Efter den sidste vask, erstatte vandet med 4 ml af neuronal udpladningsmedium per skål. Bemærk at det er vigtigt, at overfladen af dækglassene ikke lov at tørre efter at være blevet coatet med poly-L-lysin.
- Placer dækglasset-holdige retter i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator. De coatede dækglas skal inkuberes i mindst 24 timer før neuron kultur. Dette gøres for at prime medium for neuron kultur.
4. Dissektion af Hippocampus og Plating Neuroner
- Opnå en gravid rotte (embryonisk dag 18-19, som målt fra den dag vaginalprop opdagelse) og aflive ved isofluran bedøvet halshugning eller anden godkendt metode.
- Spray undersiden af rotte med 70% ethanol, og derefter foretage et snit fra pubesregionen throUH til enden af bughulen. For at undgå forurening, sørge for at skære kun gennem huden på dette trin.
- Skyl dissektion instrumenter igen med 70% ethanol, og derefter skære gennem bugvæggen for at blotlægge livmoderen. Fjern de to uterine horn og placere dem i en steril 100 mm petriskål.
- Udføre de resterende trin i en laminar strøm-hætte. Fjern livmoderen membran, der omgiver fostrene. Halshugge dem og placere lederne i en 100 mm petriskål indeholdende 20 ml CMF-HBSS.
- Dissekere ud hjerner og straks placere dem i en 60 mm petriskål indeholdende 2 ml CMF-HBSS på is. Indsamle kun 2-3 hjerner pr skål at give tilstrækkelig plads til det næste trin.
- Under et dissektionsmikroskop strimler væk meninges fra midterlinien af de cerebrale hemisfærer, og derefter dissekere ud hippocampusen og placere dem i en 60 mm petriskål indeholdende 4,5 ml CMF-HBSS. Bemærk, at hippocampus kan skelnes som en halvmåneformet strukTURE i den mediale flade af den kortikale halvkugle, og er let at fjerne som det er omkranset sideværts af en ventrikel.
- Overfører de indsamlede hippocampusvæv og CMF-HBSS til en 15 ml rør. Tilsæt 0,5 ml 2,5% trypsin, og derefter inkuberes ved 37 ° C i 10 min. Papain kan anvendes i stedet for trypsin, fordi det er mere skånsom og kan øge udbyttet.
- forsigtigt fjerne trypsinopløsningen ved Pasteur-pipette og efterlod hippocampusvæv uforstyrret i bunden af røret.
- Forsigtigt vaske vævet to gange med 5 ml CMF-HBSS mens inkubering ved 37 ° C i 5 minutter. Efter den anden vask, at det samlede rumfang til mindst 5 ml ved tilsætning af et tilstrækkeligt rumfang af CMF-HBSS til vævet. Hvis der er hippocampi fra mere end 10 unger, op til 8 kan tilsættes ml CMF-HBSS.
- Forbered to varianter af brand-poleret pipetter til væv dissociation. Spidsen af én variant er af den normale diameter af pipetten, men med brand-poleret smoothened kanter. Den anden variant er ét med spidsdiameteren halveret. Kortvarigt blotlægge spidsen af en glas Pasteur-pipette diagonalt for en flamme kilde, og derefter undersøge spidserne af pipetterne.
- Gentage dette trin, indtil spidsen kant var blevet glattet eller diameteren er reduceret. Det er vigtigt at øve at finde den ideelle diameter for at sikre, at vævet dissocieres til at give enkelte celler uden at beskadige disse celler.
- Udriv hippocampusvæv først ved omkring 10 passager gennem en glat kanter normalt glas Pasteur-pipette, og derefter en yderligere 5 til 10 passager gennem pipetten med reduceret diameter. Målet er at opnå en homogen opløsning af celler med ingen eller meget få vævsklumper.
- Bestemme celletætheden anvendelse af et hæmocytometer eller en automatiseret celletæller. Typisk opnås 0,8 til 1,0 millioner celler pr pup når hippocampi fra de to halvdele kombineres.
- Overføre tilstrækkelig volumen af cellesuspensionen til retterindeholdende poly-L-lysin-overtrukne dækglas i 4 ml udpladningsmedium til opnåelse af en udpladningsdensitet på 300.000 celler pr 60 mm skål. Tætheden af cellerne kan variere fra 100.000 til 500.000, afhængig af den tilsigtede eksperiment.
- Efter 3-4 timer, overføre dækglassene med neuroner knyttet til skåle indeholdende gliaceller i NBG medium. Dette bør ske således, at den side, hvor neuronerne blev udpladet vender ned mod glial cellelag. Tilføj alt 4-5 dækglas pr glia fad.
- To eller tre dage efter udpladning, tilsæt Ara-C opløsning til en slutkoncentration på 5 uM per skål til at standse glial vækst.
- Fodre cellerne en gang om ugen ved at erstatte 2 ml af det gamle medium med 2,5 ml frisk medium ved hver fodring. Den ekstra medium tilsættes, er for at kompensere for fordampning over tid, og kun en del af mediet ændres for at sikre ensartet konditionering af mediet ved gliaceller. Disse kulturer er typisk sundt for mindst en måned (Figur 3). Neuronoverlevelse kan forbedres ved tilsætning af APV til dyrkningsmediet til en endelig koncentration på 100 uM. APV er en NMDA-receptorantagonist og fremmer overlevelse ved at reducere glutamatexcitotoksicitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne "sandwich" metode til primær nerve cellekultur, hippocampusneuroner (figur 3) vokser på et leje af gliaceller (figur 1) adskilt af paraffin perler (figur 2). Dette sikrer, at neuroner selektivt vokse på dækglas med minimal forurening glial celle, men modtager tilstrækkelig trofisk støtte fra glia vokser på Vævsdyrkningsskålen. Typisk kan neuroner opretholdes i kultur i> 3 uger og udvikle omfattende arborisation med veludviklede axoner og dendritter identificeret ved deres typiske dephospho-Tau og MAP2 immunofarvning henholdsvis (figur 4). Modne neuroner udvikle synaptiske pigge identificeret ved selektiv lokalisering af postsynaptisk markør Drebrin1 til disse rum. Disse synaptiske spines er tæt apposed til præsynaptiske specialiseringer, der er identificeret ved synaptisk vesikel markør Synapsin1 immunfarvning. Detnærhed af præ- og postsynaptiske steder indikerer veludviklet og korrekt justeret synapser. Disse primære neuroner velegnet til funktionelle og strukturelle studier af neuroner og synapser. Disse indbefatter, men er ikke begrænset til, analyser af signaltransduktion, neuronal polaritet, subcellulær handel og synapser udvikling og plasticitet.
Figur 1. fasekontrast billeder af gliale kulturer taget 1 dag, 7 dage eller 14 dage efter udpladning af frossen glial lager. Skala bar, 500 pm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. høj opløsning billeder af dækglas prepared med paraffin perler. (A, B) Eksempler på korrekt anvendt paraffin perler. (C, D) Eksempler på forkert anvendte paraffin perler. α: Mere end én perle blev påført på samme sted. β: Vulsten ikke være korrekt placeret på dækglasset. χ: Perlen blev påført for tæt på midten af dækglasset. δ: Perlen var for høj. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. fasekontrast billeder af de udviklingsmæssige stadier af primære neuroner i kultur. Skala bar, 100 pm. Klik her for at se en større version af ther figur.
Figur 4. Immunofluorescens billeder af primære neuroner ved 17 dage in vitro. Neuronerne blev fikseret med 4% formaldehyd og 4% saccharose i PBS i 12 min, og derefter permeabiliseret med 0,25% Triton X-100 i 5 min. Efter blokering med 10% BSA i PBS i 30 minutter blev de neuroner, inkuberet natten over ved 4 ° C med primære antistoffer anvendt i 3% BSA i PBS. Primære antistoffer blev anvendt som følger: anti-synapsin I (kanin, 1: 2.000), anti-drebrin (muse lgG1, 1: 8, klon M2F6, hybridomsupernatant), anti-MAP2 (kylling polyklonalt IgY, 1: 5.000), og anti-tau-1 (muse-IgG2a, 1: 2.000, klon PC1C6; genkender dephosphoryleret tau). Cellerne blev derefter vasket med PBS og inkuberet med passende arter-eller isotypespecifikke sekundære antistoffer i 3% BSA i PBS i 1 time ved 37 ° C. Sekundære antistoffer var som folnedture: Alexa 488-konjugeret anti-muse-IgG2a (1: 500), Alexa 568-konjugeret anti-kanin (1: 500), Alexa 647-konjugeret anti-muse IgG1 (1: 500), og AMCA-konjugeret anti-kylling IgY (æsel IgG, 1: 200). Skala bar, 10 um og 2,5 um, som angivet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mens metoden "sandwich" med dyrkning neuroner er blevet godt beskrevet andetsteds 2, 11, der er flere trin i hele den protokol, der er ganske vanskeligt at beskrive i tekst alene, hvilket kan føre til frustration for efterforskerne, der ønsker at vedtage det.
Fremgangsmåden kan opdeles i tre brede arbejdsgange: glial kultur, dækglas forberedelse og neuron kultur og vedligeholdelsesomkostninger. Hver af de tre præparater er afgørende for høj kvalitet neuron kulturer og flere vigtige overvejelser skal holdes for øje. Før udpladning neuroner bør glial fødelag ideelt være en homogen population af astrocytter og være mellem 50-70% konfluens. Dette ville sikre tilstrækkelig trofisk støtte fra glial fødelag. Det er vigtigt at sikre, at den astroglial- kultur har minimal forurening af andre celletyper, især mikroglia, som er løst AttacHED og afrundede celler. Microglia frigivelse cytokiner, som er skadelige for neuron sundhed og overlevelse 12. Serummet, enten hesteserum eller bovin vækst serum, kan være variabel fra parti til parti. Omhyggelig screening af flere partier af serum skal udføres før det besluttes at bruge et bestemt parti.
Dækglas præparat er et andet vigtigt skridt. Kvaliteten af glasset og den anvendte protokol i sin rengøring er afgørende for sunde veludviklede neuroner. Hvis metoden bliver nyligt vedtagne i et laboratorium, ville det være værd at teste dækglas fra flere leverandører. Til rengøring af dækglassene, nogle laboratorier sættetid dækglas i 70% salpetersyre i 18-36 timer, mens andre gør det kun 1 time i en sonikator. Et vigtigt kriterium af rene dækglas er, at poly-L-lysin opløsning bør fordeles jævnt på overfladen. En anden vigtig overvejelse er, at paraffin perler anvendt på dækglassene bør være af passende højde ogdiameter og opvarmes til den rette temperatur, som skitseret i protokollen.
Til opnåelse neuroner, kan hippocampus dissekeres fra embryonale dag 17-19 rotter. Selvom dissektion på dette trin fører til meget få gliaceller kan glial proliferation blive standset ved tilsætning af antimitotikum Ara-C efter 2-3 dages dyrkning. Findeling af trypsiniseret hippocampus væv ved brand-poleret pipettespidser er afgørende for at dissociere vævet ind i de enkelte celler uden at beskadige cellerne selv. Den neuronale vækst og vedligeholdelsesmedium anvendt i denne protokol er Neurobasal + L-glutamin + B27 supplement. L-Glutamin kan være substitueret med GlutaMAX, der er mere stabil i dyrkningsmediet. Kvaliteten af B27 supplement kan variere fra parti til parti, og så det bør testes, før du bruger et bestemt parti længere sigt kultur. En dårlig masse B27 kan forårsage neuroner til at klumpe. Alternative produkter såsom GS21 og SM1 har vist sig at være gode erstatninger for B27.Neuroner dyrket i mere end en uge, skal fodres med frisk medium hver uge, hvor en tredjedel af mediet udskiftes hver uge.
Denne metode til dyrkning af nerveceller kan vise sig uvurderlig for eksperimenter, der er afhængige af rene neuronale populationer med ringe eller ingen glial forurening. Low-density neuroner dyrket ved hjælp af denne metode typisk overleve i flere uger med veludviklede dorne, synaptiske forbindelser og netværk egenskaber.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af CIHR MOP-142.209 til TJS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection Instruments | |||
| Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5910 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5650 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5605 | |
| Dumont Forceps (#5) | Roboz | RS-5045 | |
| Dumont Forceps (#PP) | Roboz | RS-4950 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Preparation | |||
| Trypsin (2.5%) | Gibco | 15-090-046 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25-200-072 | |
| Swinnex Filter Holder, 25 mm | EMD Millipore | SX0002500 | Used as cell strainer. Assemble first with filter and autoclave |
| Isoflorane | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | CP0406V2 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| Grade 105 Lens Cleaning Tissue | GE Healthcare | 2105-841 | Used as cell strainer. Assemble first in filter holder and autoclave |
| Glass Pasteur pipettes with cotton filter | VWR | 14672-412 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15-630-080 | |
| Hank's Balanced Salt Solution without Calcium, Magnesium, Phenol Red (HBSS, 10x) | Gibco | 14-185-052 | |
| Glass Pasteur pipettes | VWR | 14672-380 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (Dnase) | Sigma-Aldrich | DN25-100mg | |
| Butane bunsen burner | Wall-Lenk Mfg. Co. | Model 65 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Culture | |||
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15-140-122 | |
| Petri Dish (100 mm) | Fisher | FB0875712 | |
| Petri Dish (60 mm) | Fisher | FB0875713A | |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | Can be used in place of BGS, but each lot must be tested due to inter-lot variation. Heat-inactivation of serum is recommended. |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-1 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) | Gibco | 11-095-080 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21-103-049 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25-030-081 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | Can be used in place of L-Glutamine in the NBG medium |
| Culture Dish (60 mm) | Corning, Inc | 353002 | |
| Culture Flasks (75 cm^2) | Greiner Bio-One | 658170 | |
| Cytarabine (Ara-C) | Sigma-Aldrich | C3350000 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Bovine Growth Serum (BGS) | HyClone | SH3054103 | Heat-inactivation is recommended before use. |
| B27 Supplement (50x) | Gibco | 17-504-044 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418-100ml | |
| Cryogenic Vials | VWR | 89094-806 | |
| DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (APV) | Sigma-Aldrich | A5282 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coverslip Preparation | |||
| Sodium tetraborate decahydrate (borax) | Sigma-Aldrich | B9876-1KG | |
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| Histoplast Paraffin Wax | Fisher | 22-900-700 | |
| Gravity Convection Oven | VWR | 89511-404 | Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol |
| Ultrasonic Bath (Sonicator) | Fisher Scientific | 15337400 | |
| Nitric Acid | Anachemia | 62786-460 | |
| Ceramic Staining Racks | Thomas Scientific | 8542E40 | Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol |
| Coverslips | Glaswarenfabrik Karl Hecht GmbH | 1001/18 | Manufacturer is very important, as neurons do not adhere well to lower quality glass |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B0252 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Miscellaneous | |||
| Sterile Syringe Filters | VWR | 28145-477 | Used with BD syringe for filter-sterilization |
| Syringe | BD | 302832 | Used with VWR sterile syringe filters for fliter-sterilization |
| Water Bath | Fisher Scientific | 15-460-16Q | |
| Inverted Microscope | Olympus | CKX41 | |
| 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | ThermoScientific | 339650 | |
| 50 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | ThermoScientific | 339652 |
References
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Res. 126, 397-425 (1977).
- Kaech, S., Banker, G.
- Adamantidis, A., et al. Optogenetics: 10 years after ChR2 in neurons--views from the community. Nat Neurosci. 18, 1202-1212 (2015).
- Ho, V. M., Lee, J. A., Martin, K. C. The cell biology of synaptic plasticity. Science. 334, 623-628 (2011).
- Huganir, R. L., Nicoll, R. A. AMPARs and synaptic plasticity: the last 25 years. Neuron. 80, 704-717 (2013).
- Luscher, C., et al. Role of AMPA receptor cycling in synaptic transmission and plasticity. Neuron. 24, 649-658 (1999).
- Varoqueaux, F., et al. Neuroligins determine synapse maturation and function. Neuron. 51, 741-754 (2006).
- Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. J Neurosci. 6, 3044-3060 (1986).
- Lester, R. A., Quarum, M. L., Parker, J. D., Weber, E., Jahr, C. E. Interaction of 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione with the N-methyl-D-aspartate receptor-associated glycine binding site. Mol Pharmacol. 35, 565-570 (1989).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35, 567-576 (1993).
- Banker, G., Goslin, K. Rat hippocampal neurons in low-density culture. Culturing nerve cells. 2, 339-370 (1998).
- Hanisch, U. K. Microglia as a source and target of cytokines. Glia. 40, 140-155 (2002).
