Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

النووي التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي لتحديد Phosphorylations متعددة من جوهريا المختلين البروتينات

Published: December 27, 2016 doi: 10.3791/55001
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1UMR8576, CNRS, Lille University, 2UMR-S1172, INSERM CNRS, Lille University
* These authors contributed equally

Introduction

واحدة من التحديات الرئيسية التي تواجه الرعاية الصحية في القرن الحادي و21 هي أمراض الاعصاب مثل الإصابة بمرض الزهايمر (AD). تاو هو بروتين المرتبط أنيبيب الذي يحفز أنيبيب (MT) تشكيل. وتشارك تاو على قدم المساواة في العديد من الاضطرابات العصبية، يسمى tauopathies، والتي من أشهرها هو م. في هذه الاضطرابات، وجدت تاو المجاميع الذاتي في خيوط حلزونية تقرن (PHFs) وتعديلها على العديد من المخلفات التي تعديلات posttranslational (PTMs) مثل الفسفرة 1. تورط الفسفرة من البروتين تاو في كل تنظيم وظيفة فسيولوجية لاستقرار طن متري، وفقدان المرضية من وظيفة الخلايا العصبية التي تميز م.

وعلاوة على ذلك، بروتين تاو، عند دمجها في PHFs في الخلايا العصبية المريضة، وhyperphosphorylated دائما 2. على عكس تاو الطبيعي أن يحتوي على 2-3 مجموعة الفوسفات، وتاو hyperphosphorylated في PHFs يحتوي على 5-9 الفوسفاطالمجموعات الإلكترونية 3. Hyperphosphorylation من تاو يتوافق على حد سواء لزيادة العناصر المتفاعلة في بعض المواقع والفسفرة من المواقع الإضافية التي تسمى مواقع المرضية من الفسفرة. ومع ذلك، يوجد تداخل بين الميلادي وأنماط البالغين الطبيعية من الفسفرة، على الرغم من الاختلافات الكمية في مستوى 4. كيف محددة الأحداث الفسفرة وظيفة النفوذ واختلال وظيفي تاو لا تزال مجهولة إلى حد كبير. ونحن نهدف إلى فك تنظيم تاو كتبها PTMs على المستوى الجزيئي.

لتعميق فهم الجوانب الجزيئية تاو، لدينا لمعالجة التحديات التقنية. أولا، تاو هو بروتين المختلين جوهريا (IDP) عندما معزولة في الحل. هذه البروتينات تفتقر محددة جيدا هيكل ثلاثي الأبعاد في ظل الظروف الفسيولوجية وتتطلب معينة الطرق الفيزيائية الحيوية لدراسة وظيفة (ق) والخصائص الهيكلية. تاو هو نموذج لفئة متزايدة من النازحين، وكثيرا ما وجدت المرتبطةالأمراض مثل الأمراض العصبية، وبالتالي زيادة الفائدة على فهم المعلمات الجزيئية الكامنة وراء وظائفهم. ثانيا، توصيف تاو الفسفرة هو التحدي التحليلي، مع 80 موقعا الفسفرة المحتملة على طول سلسلة من أطول 441 الأحماض الأمينية تاو الإسوي. وقد تم تطوير عدد من الأجسام المضادة ضد الحواتم فسفرته من تاو وتستخدم للكشف عن تاو المرضية في الخلايا العصبية أو أنسجة المخ. يمكن أن الأحداث الفسفرة يومي لا يقل عن 20 المواقع المستهدفة من قبل تحركات الموجه البرولين، معظمهم على مقربة داخل المنطقة البرولين الغنية. النوعي (المواقع التي؟) وتوصيف كمي (ما رياضيات الكيمياء؟) صعبة حتى من قبل تقنيات MS أحدث 5.

مطيافية الرنين النووي المغناطيسي يمكن استخدامها لتحقيق البروتينات المختلين التي هي غاية الأنظمة الديناميكية تتألف من مجموعات من المتشاكلات. كان عالية الدقة الرنين المغناطيسي الطيفي تطبيق صحيفةإد للتحقيق في كل من هيكل ووظيفة البروتين تاو. وبالإضافة إلى ذلك، أدى إلى تعقيد الملف الشخصي الفسفرة تاو لتطوير الأدوات الجزيئية وطرق تحليلية جديدة باستخدام الرنين المغناطيسي لتحديد المواقع الفسفرة 6-8. الرنين المغناطيسي النووي باعتباره المنهج التحليلي تسمح لتحديد المواقع الفسفرة تاو بطريقة العالمية، والتصور من جميع التعديلات في موقع واحد في تجربة واحدة، وتقدير مدى التأسيس الفوسفات. هذه نقطة أساسية منذ الرغم من أن الدراسات الفسفرة على تاو وتكثر في الأدب، ومعظمهم تم تنفيذها مع الأجسام المضادة، وترك درجة كبيرة من عدم اليقين بشأن الوضع الكامل من الفسفرة وبالتالي التأثير الحقيقي للأحداث الفسفرة الفردية. تحركات المؤتلف بما في ذلك PKA، الجليكوجين-سينسيز كيناز 3β (Gsk3β)، السيكلين التي تعتمد كيناز 2 / السيكلين ألف (CDK2 / CycA)، كيناز السيكلين التي تعتمد 5 (CDK5) / P25 عمل البروتين ivator، تنظم خارج الخلية إشارة كيناز 2 (ERK2) وأنيبيب-التنظيم تقارب كيناز (MARK)، والتي تظهر نشاط الفسفرة نحو تاو، يمكن أن تكون مستعدة في شكل نشط. وبالإضافة إلى ذلك، يتم استخدام المسوخ تاو التي تسمح لتوليد الأشكال الإسوية بروتين تاو محددة مع أنماط الفسفرة جيدا اتسم فك شفرة الفسفرة تاو. ثم يتم استخدام الرنين المغناطيسي الطيفي لتحديد خصائص العينات تاو تعديل إنزيمي 6-8. على الرغم من أن في المختبر الفسفرة تاو هو أكثر صعوبة من شبه الفسفرة مثل قبل الطفرة المحدد سر / منتدى المجالس الرومانسية إلى حمض الجلوتاميك (غلو) المخلفات، وهذا النهج مزاياه. في الواقع، لا المعلمات تأثير ولا التفاعل الهيكلية للالفسفرة يمكن دائما تحاكي بواسطة الأحماض الجلوتاميك. ومن الأمثلة على ذلك عزر بدوره لاحظ حول phosphoserine 202 (pSer202) / phosphothreonine 205 (pThr205)، والتي لا تتكرر مع الطفرات غلو 9.

SS = "jove_content"> هنا، وسيتم وصف إعداد تاو المسمى isotopically للتحقيقات الرنين المغناطيسي النووي أولا. يتم تعديل بروتين تاو فسفرته بواسطة ERK2 على مواقع عديدة وصفها بأنها مواقع المرضية من الفسفرة، وبالتالي يمثل نموذجا للاهتمام من تاو hyperphosphorylated. ويرد بروتوكول مفصلة من تاو في الفسفرة المختبر بواسطة كيناز ERK2 المؤتلف. يتم تنشيط ERK2 من الفسفرة من قبل mitogen تنشيط بروتين كيناز / إرك كيناز (مجاهدي خلق) 10-12. بالإضافة إلى إعداد تعديل، بروتين تاو المسمى isotopically، يوصف استراتيجية NMR تستخدم لتحديد PTMs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إنتاج 15 N، 13 C-تاو (الشكل 1)

  1. تحويل pET15b-تاو T7 المؤتلف التعبير البلازميد 13،14 في BL21 (DE3) المختصة كولاي الخلايا البكتيرية 15.
    ملاحظة: الترميز [كدنا لأطول (441 بقايا الأحماض الأمينية) تاو الإسوي هو استنساخ بين المواقع تقييد جنة التحقيق الوطنية السودانية وXhoI في البلازميد pET15b.
    1. المزيج بلطف 50 ميكرولتر من BL21 المختصة (DE3) خلايا، وتشكيل 1-5 × 10 7 المستعمرات في ميكروغرام من البلازميد، مع 100 نانوغرام من الحمض النووي البلازميد في أنبوب بلاستيكي 1.5 مل.
      ملاحظة: تسلسل معلومات النظام الجيني-الاستخدام الأمثل السلالات البكتيرية للتعبير كدنا] حقيقية النواة ليست ضرورية لإنتاج تاو البشري.
    2. ضع الخليط الخلية على الجليد لمدة 30 دقيقة ثم الصدمة الحرارية لمدة 10 ثانية في 42 درجة مئوية. وضع أنبوب مرة أخرى على الجليد لمدة 5 دقائق وإضافة 1 مل من درجة حرارة الغرفة LB (لوريا، Bertani) متوسطة. احتضان تعليق البكتيرية عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة تحت لطيفالإثارة.
  2. انتشر استخدام حلقة التلقيح 100 ميكرولتر من تعليق خلية بالتساوي على لوحة آغار المتوسطة LB تحتوي على 100 ميكروغرام / مل من المضادات الحيوية الأمبيسلين.
  3. احتضان لوحة اختيار لمدة 15 ساعة على 37 درجة مئوية.
  4. الحفاظ على لوحة الاختيار في 4 درجات مئوية حتى الانتقال الى الخطوة الثقافة، لمدة أقصاها 2 أسابيع تقريبا.
    ملاحظة: المخزون الجلسرين للثقافة البكتيرية (50٪ الجلسرين) وتخزينها في -80 درجة مئوية، يمكن أن تكون على استعداد لبدء الثقافة في مرحلة لاحقة.
  5. إضافة 1 مل 1 م MgSO 4، 1 مل 100 ملي CaCl 2، 10 مل 100X MEM فيتامين مكمل، 1 مل 100 ملغ / الأمبيسلين مل إلى 1 لتر من الأملاح M9 تعقيمها (6 ز نا 2 هبو 4، 3 ز KH 2 PO 4 ، 0.5 غرام كلوريد الصوديوم).
    ملاحظة: سوف راسب أبيض تشكل على إضافة محلول CaCl 2 إلى أملاح M9 أن تبدد بسرعة.
  6. إذابة 300 ملغ من 15 N، متوسطة 13 C-كاملة، 1 غرام من 15NH 4 Cl و 2 غرام من 13 C 6 -glucose في 10 مل من M9 المتوسطة. تصفية تعقيم الحل النظائر باستخدام فلتر 0.2 ميكرون، مباشرة في وسط M9.
  7. تعليق باستخدام التلقيح مستعمرة حلقة واحدة من pET15b-تاو تحول البكتيريا من لوحة التحديد في 20 مل من LB المتوسطة تستكمل مع 100 ميكروغرام / مل من الأمبيسلين.
  8. احتضان المتوسطة تلقيح عند 37 درجة مئوية لمدة 6 ساعات.
  9. قياس الكثافة البصرية في 600 نانومتر (OD 600) في 1 مل من التخفيف عشرة أضعاف من ثقافة البكتيرية في مطياف كفيت بلاستيكية.
    ملاحظة: العكارة للثقافة البكتيرية الموافق OD 600 من 3،0-4،0 يشير إلى أن يتم التوصل إلى مرحلة النمو التشبع.
  10. إضافة 20 مل من ثقافة LB المشبعة إلى 1 لتر من M9 متوسط ​​النمو تستكمل مع الأمبيسلين (100 ميكروغرام / مل تركيز النهائي)، في 2 L مخروطي البلاستيك ثقافة حيرة قارورة.
  11. ضع قارورة الثقافة في حاضنة برمجة مجموعة إلى 10 درجةC و 50 دورة في الدقيقة. برنامج الحاضنة للتبديل إلى 200 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية في وقت مبكر من صباح اليوم التالي.
  12. قياس OD 600 في 1 مل من ثقافة البكتيرية في كفيت مطياف البلاستيك. إضافة 400 ميكرولتر من 1 M IPTG (الآيزوبروبيل β-D-1-thiogalactopyranoside) حل سهم (الاحتفاظ بها في -20 درجة مئوية) عندما OD 600 تصل قيمتها بحوالي 1.0 للحث على التعبير عن بروتين تاو المؤتلف.
  13. تستمر الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات إضافية. جمع الخلايا البكتيرية بواسطة الطرد المركزي في 5000 x ج لمدة 20 دقيقة.
  14. تجميد بيليه البكتيريا في -20 درجة مئوية. الحفاظ المجمدة حتى خطوة التنقية، لفترة طويلة إذا لزم الأمر.

2. تنقية 15 N، 13 C-تاو (الشكل 2)

  1. الأوتوكلاف الموجبة لتبادل (CEX) مخازن تنقية في 121 درجة مئوية تحت 15 رطل لمدة 20 دقيقة. مخزن مخازن في 4 درجات مئوية.
  2. ذوبان الجليد بيليه الخلية البكتيرية و resuspend بدقة في 45 ملاستخراج CEX مخزن مؤقت (50 ملي نابي عازلة درجة الحموضة 6.5، 1 ملم EDTA) تستكمل حديثا مع مثبط البروتياز 1X كوكتيل (1 قرص) وDNAseI (2000 وحدة).
  3. تعطيل الخلايا البكتيرية باستخدام الخالط الضغط العالي في 20000 رطل. ضرورية 3-4 يمر. أجهزة الطرد المركزي في 20000 x ج لمدة 40 دقيقة لإزالة المواد غير القابلة للذوبان.
  4. تسخين استخراج الخلايا البكتيرية لمدة 15 دقيقة في 75 درجة مئوية باستخدام حمام مائي.
    ملاحظة: لوحظ راسب أبيض بعد بضع دقائق.
  5. أجهزة الطرد المركزي في 15000 x ج لمدة 20 دقيقة والحفاظ على طاف التي تحتوي على بروتين تاو للحرارة مستقرة.
  6. مخزن في -20 درجة مئوية حتى الخطوة تنقية التالية، إذا لزم الأمر.
  7. إجراء اللوني الموجبة لتبادل على الراتنج CEX قوي معبأة كعمود 5 مل السرير باستخدام بروتين سريع اللوني السائل (FPLC) نظام (الشكل 3).
    1. تعيين معدل التدفق إلى 2.5 مل / دقيقة.
    2. تتوازن العمود في CEX مخزن مؤقت
    3. تحميل heated- 60-70 ملاستخراج تحتوي تاو باستخدام مضخة عينة، أو ضخ بدلا من A، وفقا للنظام. جمع التدفق من خلال لتحليل للتحقق من أن بروتين تاو وملزمة بكفاءة إلى الراتنج (انظر 2.8).
    4. غسل الراتنج مع CEX مخزن مؤقت حتى الامتصاصية في 280 نانومتر هو العودة إلى القيمة الأساسية.
    5. أزل تاو من العمود باستخدام ثلاث خطوات كلوريد الصوديوم التدرج التي حصلت عليها زيادة تدريجية العازلة CEX ب (CEX مخزن مؤقت مع 1 M كلوريد الصوديوم). برنامج FPLC على النحو التالي: الخطوة الأولى من التدرج إلى 25٪ عازلة CEX B في 10 مجلدات العمود (CV) للوصول إلى 250 مم كلوريد الصوديوم، الخطوة الثانية إلى 50٪ عازلة CEX B في 5 السيرة الذاتية لتصل إلى 500 مم كلوريد الصوديوم، والخطوة الثالثة إلى 100٪ عازلة CEX B في 2 السيرة الذاتية ليصل إلى 1 M كلوريد الصوديوم. جمع 1.5 مل الكسور خلال الخطوات شطف.
  8. تحليل 10 ميكرولتر من الكسور التي تم جمعها خلال الخطوة شطف بواسطة SDS-PAGE (12٪ هلام SDS الأكريلاميد) وCoomassie تلطيخ (الشكل 3 أ) 16. تحقق الخطوة تحميل على العمود وكذلك عن طريق analyزينغ 10 ميكرولتر من التدفق من خلال.
  9. اختيار الكسور التي تحتوي تاو وتجميع هذه الكسور للخطوة التالية.
  10. إجراء التبادل عازلة حول الكسور التي تحتوي على تاو المجمعة (الشكل 3 B).
    1. تتوازن عمود تحلية من 53 مل G25 الراتنج السرير معبأة (26 × 10 سم) في 50 ملي بيكربونات الأمونيوم (عازلة متقلبة) باستخدام نظام FPLC.
    2. مجموعة معدل التدفق إلى 5 مل / دقيقة. حقن عينة تاو على العمود عن طريق حقن حلقة 5 مل. جمع الكسور الموافق ذروة امتصاص عند 280 نانومتر.
    3. تكرار الحقن 3-4 مرات، وهذا يتوقف على حجم حوض السباحة CEX الأولي.
  11. حساب كمية البروتين تاو النقي باستخدام منطقة ذروة اللوني عند 280 نانومتر (1 ملغ من تاو يتوافق مع 140 ماو * مل).
    ملاحظة: معامل الانقراض من البروتين تاو في 280 نانومتر هي 7550 م -1 سم -1. تاو لا يحتوي على أية بقايا التربتوفان.
  12. تجمع كل الأجزاء تاو.
  13. أليكور العينة في أنابيب تحتوي على ما يعادل 1-5 ملغ من تاو. اختيار هذه الأنابيب بحيث يتم صغيرة بالمقارنة مع حجم حل لحجم الأنبوب (على سبيل المثال 5 مل من محلول في أنبوب 50 مل).
  14. لكمة ثقوب في مباراة دولية أنبوب باستخدام إبرة. تجميد عينات تاو في -80 درجة مئوية.
  15. عينات يجفد تاو. يمكن أن تظل بروتين تاو المجففة بالتبريد عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لفترات طويلة من الزمن.

3. في المختبر الفسفرة من 15 N-تاو

  1. حل 5 ملغ من تاو مجفف بالتجميد في 500 العازلة ميكرولتر الفسفرة (50 ملي HEPES · كوه، ودرجة الحموضة 8.0، 12.5 ملي MgCl 2، 1 ملم EDTA، 50 مم كلوريد الصوديوم).
  2. إضافة 2.5 ملي اعبي التنس المحترفين (25 ميكرولتر من 100 ملي حل الأسهم أبقى في -20 درجة مئوية)، 1 ملم DTT (1 ميكرولتر من 1 حل M الأسهم أبقى في -20 درجة مئوية)، 1 ملي EGTA (2 ميكرولتر من الأسهم 0.5 M الحل)، كوكتيل 1X مثبط البروتياز (25 ميكرولتر من الأسهم 40X التي تم الحصول عليها عن طريق إذابة 1 قرص في المخزن 1 مل الفسفرة) و 181؛ M تنشيط صاحب-ERK2 (250 ميكرولتر العازلة في المحافظة 10 ملي HEPES، ودرجة الحموضة 7.3، 1 ملم DTT و 5 ملي MgCl 2، 100 مم كلوريد الصوديوم، و 10٪ الجلسرين وتخزينها في -80 درجة مئوية) في حجم العينة الكلي لل 1 مل.
    ملاحظة: تنشيط صاحب-ERK2 يمكن أن تكون مستعدة في المنزل 5،8 من الفسفرة مع كيناز مجاهدي خلق.
  3. احتضان 3 ساعة على 37 درجة مئوية.
  4. تسخين العينة على 75 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة إلى تعطيل إرك كيناز.
  5. أجهزة الطرد المركزي في 20000 x ج لمدة 15 دقيقة. جمع والحفاظ على طاف.
  6. تحلية العينة البروتين إلى 50 بيكربونات الأمونيوم مم باستخدام عمود من 3.45 مل G25 الراتنج السرير معبأة (1.3 X 2.6 سم)، الذي هو مناسبة لعينة 1 مل.
  7. تشغيل 12٪ SDS-PAGE 16 مع 2.5 ميكرولتر من عينة البروتين إلى التحقق من كل سلامتها والفسفرة كفاءة (الشكل 4).
  8. يجفد العينة تاو فسفرته. تخزين مسحوق عند درجة حرارة -20 درجة مئوية.

4. اكتساب NMR الأطياف (فايجوري 5)

  1. إذابة 4 ملغ من مجفف بالتجميد 15 N، 13 C-إرك فسفرته-تاو في 400 العازلة ميكرولتر NMR (50 ملي نابي أو 50 ملي بالديوتيريوم Tris- D11 .Cl، ودرجة الحموضة 6.5، 30 ملي كلوريد الصوديوم، 2.5 ملي EDTA و1 ملم DTT).
  2. إضافة 5٪ D 2 O لتأمين مجال مطياف الرنين المغناطيسي النووي و1 ملم اجتماع الدول الأطراف الثالث (3- (trimethylsilyl) البروبيونيك-2،2،3،3-د 4 حامض الصوديوم الملح)) كمرجع إشارة NMR الداخلية. إضافة 10 ميكرولتر من محلول 40X تقييم كامل الكوكتيل مثبط البروتياز.
  3. نقل العينة في أنبوب NMR 5 مم باستخدام حقنة الإلكترونية مع إبرة طويلة أو ماصة باستير. إغلاق أنبوب الرنين المغناطيسي باستخدام المكبس. إزالة أي فقاعة الهواء المحبوس بين المكبس وسائل حركات الغطاس.
  4. وضع أنبوب الرنين المغناطيسي في الدوار. ضبط موقفها العمودي في الدوار مع المقياس المناسب للرئيس NMR التحقيق المستخدمة، مثل أن معظم محلول العينة ستكون داخل لفائف NMR.
  5. بدء تدفق الهواء: اضغط رفع طن نافذة نظام التحكم المغناطيسي. وضع بعناية الدوار مع أنبوب في تدفق الهواء في الجزء العلوي من تجويف المغناطيس. وقف تدفق الهواء (انقر أسانسير) والسماح للأنبوب ينزل إلى مكان داخل الرأس التحقيق في المغناطيس.
  6. درجة الحرارة تعيين إلى 25 درجة مئوية (298 K).
  7. باملوالفة شبه التلقائي ومطابقة للرئيس التحقيق لنقل الطاقة الأمثل. اكتب atmm على سطر الأوامر.
  8. قفل تردد الطيف باستخدام إشارة D 2 O من العينة المسجلة على قناة الديوتيريوم. انقر القفل في إطار نظام التحكم المغناطيسي.
  9. بدء إجراء الملئ لتحسين تجانس الحقل المغناطيسي للأرض في الموقف من العينة. اكتب topshim واجهة المستخدم الرسومية على سطر الأوامر لفتح نافذة الرقائق. انقر فوق ابدأ في نافذة الرقائق. تحقق من B0 قيمة الاختلاف القياسية المتبقية للتحقق من أن الحشوات هي الأمثل (أقل من 2 هرتز جيد).
  10. معايرة المعلمة P1 (طول بروتوننبض الترددات الراديوية في μsec)، وهو أمر ضروري للحصول على 90 درجة دوران يدور البروتون. تهدف لنبض 360 درجة باستخدام الطيف 1D من البروتونات الماء (الشكل 6).
  11. ضبط تردد يقابله تعيين المعلمة O1 (في هرتز) إلى تردد المياه بروتون في الطيف 1D (الشكل 6).
  12. بدء الاستحواذ على الطيف بروتون 1D (تسلسل النبض مع تسلسل ووترغيت لقمع إشارة المياه، على سبيل المثال zggpw5) للتحقق من إشارات من عينة (الشكل 7). التكيف مع عدد من المسح إلى تركيز البروتين النسبي. اكتب ZG على سطر الأوامر لبدء عملية الاستحواذ.
  13. إعداد المعلمات إضافية لاقتناء 2D [1 H، 15 N] HSQC الطيف (نبض تسلسل hsqcetfpf3gpsi، أرقام 8-9).
    1. ل15 N، وصفت 13 C عينة، فصل 13 مئوية خلال تطور غير مباشر 15 N.
      2. 1 H (F2) و 15 N أبعاد (F1).
      ملاحظة: تكييف عدد من نقاط البيانات الاستحواذ إلى الميدان مطياف للحفاظ على عدد مماثل من هرتز لكل نقطة وللحد من فصل مرات: استخدام 3072 نقطة في 900 ميغاهرتز و 2048 نقطة في 600 ميغاهيرتز، في البعد 1 H.
    2. تحسين معلمات إضافية في تسلسل نبض الموافق التأخير، أطوال نبض، ويقابل الترددات، ومستويات الطاقة. نوع ASED على سطر الأوامر لعرض كافة المعلمات ذات الصلة للتجربة.
  14. تعيين المعلمات لاقتناء 3D [1 H، N 15، 13 C] الطيف HNCACB (تسلسل نبض hncacbgpwg3d، الشكل 10A) في 600 ميغاهيرتز.
  15. تعيين المعلمات ل3D [1 H، N 15، 15 N] التجربة HNCANNH (نبض تسلسل hncannhgpwg3d) في 600 ميغاهيرتز. تعيين عدد من النقاط إلى 2048 في H 1، و64و 128 نقطة في يومين 15 N الأبعاد. تحديد الاعراض الطيفية إلى 14، 25، 25 أجزاء في المليون (جزء في المليون) تركزت على 4.7، 119، 119 جزء في المليون في 1 H، N 15 و 15 N أبعاد. مدة الحيازة مع 16 بالاشعة هي 1 يوم و 22 ساعة.

5. تحديد مواقع الفسفرة

  1. عملية الأطياف باستخدام اقتناء وتجهيز NMR البرمجيات.
    1. إجراء تحول فورييه من البيانات (الشكل 7). نوع قدم لطيف 1D، xfb لطيف 2D أو ft3d لطيف 3D، على سطر الأوامر.
    2. مرحلة ومرجعية كل الأطياف (الشكل 7C) باستخدام النوافذ التفاعلية.
  2. تحديد الأصداء من الاهتمام في 2D HSQC يحتمل الموافق فسفرته بقايا سر ومنتدى المجالس الرومانسية (الشكل 9، مربع أحمر).
  3. طائرات استخراج (أي 2D 1 ح 13 C الأطياف) منوC طيف 3D 1 ح 15 N- 13 باستخدام 15 N التحولات الكيميائية من الأصداء من الاهتمام في 2D. استخدام المؤشر من البعد 2 (W2) لاختيار تردد 15 N المقابلة لطائرة (W1-W3) أن تصور (الشكل 10B).
  4. اختيار ترددات الرنين من "كاليفورنيا" و "سي بي" 13 نواة C من 'ط' والمخلفات "ط-1" (مجموعة أضعف من إشارات مقارنة مع تلك المخلفات ط) لكل [1 H، 15 N] صدى من الفائدة في الطيف HNCACB 3D عن طريق النقر على الرنين، في القائمة وضع مؤشر تجد / إضافة الذروة، لإضافة قيمة التحول الكيميائية في ملف قمة القائمة.
    1. تحديد نوع ط بقايا، pSer أو pThr، من خلال مقارنة التبدلات الكيماوية في قائمة الذروة إلى القيم المعروفة من كاليفورنيا والتحولات CB الكيميائي للpSer وpThr 17.
    2. تحديد وجود بقايا برو في ط + 1 موقف من قبل مميزة إضافية +2 جزء في المليون تحول سو قيمة التحول CA الكيماوية 18.
    3. مقارنة القيم التحول الكيميائي للCA و CB الأصداء المقابلة لبقايا ط 1 إلى جدول التحولات الكيميائية وتوقع لتاو بقايا الأحماض الأمينية 19 إلى التعرف على طبيعة المخلفات في موقف ط 1.
  5. اختيار ترددات الرنين من 15 N نوى من 'ط' و 'ط 1 "بقايا لكل بالرنين [1 H، 15 N] من الفائدة في الطيف HNCANNH.
  6. مقارنة 15 N القيم التحول الكيميائي على احالة التحول الكيميائي للبروتين تاو 20-23.
  7. مقارنة dipeptides تحديدها مع تسلسل تاو لتحديد المهمة المحددة التسلسل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويبين الشكل 3A ذروة امتصاص الرئيسية في 280 نانومتر لوحظت خلال التدرج شطف. هذه الذروة يتوافق مع بروتين تاو تنقيته كما هو ظاهر على هلام الأكريلاميد فوق اللوني. ويبين الشكل 3B ذروة امتصاص فصل جيدا في 280 نانومتر، وذروة الموصلية، وضمان أن إزالة الأملاح من البروتين فعالة. ويبين الشكل 4 البروتين هلام التحول لوحظ من خلال تحليل SDS-PAGE 16 سمة من الفسفرة البروتين متعددة (قارن الممرات 2 و 3). ويبين الشكل 6 سلسلة من بروتون (1 H) 1D أطياف مع زيادة أطوال نبض (في μsec). لإعداد يستخدم طول النبض التي ستدور 1 H تدور مغنطة من 90 درجة مئوية، نبض الموافق تناوب 360 درجة في الممارسة العملية، كما أنه من الأسهل لمعايرة عن طريق التقليل من إشارة. إشارة من البروتونات مياه فارغة عندما يتم تعريف طول 360 ° النبض بشكل كاف. القيمة المقابلة ل36076؛ تناوب ثم ينقسم 4. P1 في هذه التجربة هو 10.5 μsec. يستخدم تردد الإشارة المتبقية لتعريف المعلمة o1p (تردد تعويض ل1 H): المنطقة الموسعة. الرقم 7 A. يظهر تسوس مجانا الاستقراء (ااا)، تصور لضمان أن يتم الكشف عن إشارة الرنين المغناطيسي. 7B الشكل. يظهر H الطيف 1D 1 مع مرحلة غير صحيحة، كما يراها الأصداء التي تظهر قمم كما غير المتماثلة. ويبين الشكل 7C لH الطيف 1D 1 مع إشارة جيدة إلى نسبة الضوضاء، مشيرا إلى أن المعلمات الاستحواذ الأساسية وضعت بشكل صحيح ويمكن الكشف عن إشارة من العينة البروتين. ويبين الشكل 8 2D 1 H، N 15 HSQC أطياف المؤتلف 15 N-تاو في 900 ميغاهيرتز. الرقم 8A مع حساسية جيدة وقرار والرقم 8B. مع الكشف عن التحلل البروتيني في العينة، كما رأينا من قبل ظهور المؤسسة العامة إضافي اس في الطيف (المربع الأزرق). ويبين الشكل 9 2D 1 H، N 15 HSQC أطياف المؤتلف 15 N-تاو الشكل 9A في 600 ميغاهيرتز، مع حساسية جيدة ولكن قرار أقل بالمقارنة مع الشكل 8A. الشكل 9B في 600 ميغاهيرتز، ويظهر مظهر من قمم إضافية في الطيف المقابلة لبقايا فسفرته (المربع الأحمر). الرقم 9C في 900 ميغاهيرتز، ويظهر القمم في الطيف المقابلة لبقايا فسفرته (المربع الأحمر). القرار هو أفضل مما كان عليه في الشكل 9B. الرقم 10 ويظهر توقعات من الطيف 3D NMR المستخدمة لتقييم تجربة ناجحة. ويبين الشكل 10B 1 ح 13 ج الطائرة المستخرجة من 1 ح 15 N- 13 الطيف C 3D مع حسن كثافة إشارة تسمح للكشف عن 13 إشارات C من كلا ط و i-1 المخلفات.

together.within الصفحات = "1"> شكل 1
الشكل 1: مخطط الخطوات الرئيسية لإنتاج البروتين المؤتلف ووضع العلامات النظائر. وترد الخطوات من البكتيريا التحول إلى إنتاج البروتين المؤتلف النحو المبين في الفقرة 1 من البروتوكول. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: مخطط للخطوات الرئيسية لتنقية البروتين تاو المؤتلف. خطوات من الخلايا البكتيرية تحلل لتنقية البروتين المؤتلف وترد على النحو المبين في الفقرة 2 من البروتوكول. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر منهذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل (3): خطوات اللوني السائل من البروتوكول. (أ) تبادل الأيونات الموجبة اللوني تجزؤ لاستخراج بكتيريا ساخنة. الامتصاصية في 280 نانومتر و 260 نانومتر، والموصلية تتوافق على التوالي لخطوط سوداء صلبة ومتقطع وخط أحمر منقط. ويرد 12٪ تحليل SDS-PAGE من الكسور التي تم جمعها فوق اللوني. (ب) إزالة الملوحة من البروتين تاو الى منطقة عازلة مناسبة لتجفيد. كمية البروتين تاو النقي قدر من منطقة ذروة (2260 ماو * مل) هو 16 ملغ من تاو. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4) الشكل 4: 12٪ تحليل SDS-PAGE من تاو. حارة 1، الوزن الجزيئي علامة. حارة 2، 10 ميكروغرام من تاو. حارة 3، 10 ميكروغرام من تاو فسفرته إرك. تاو، والنازحين الآخرين، ويدير بطريقة شاذة على SDS-PAGE، في الوزن الجزيئي واضح من حوالي 60 كيلو دالتون بدلا من المتوقع 46 كيلو دالتون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5: مخطط الخطوات الرئيسية لإعداد العينات NMR، NMR الحصول على البيانات الطيفي ومعالجة البيانات. وترد الخطوات من NMR إعداد نموذج لجمع البيانات ومعالجتها على النحو المبين في الفقرة 4 من البروتوكول. الرجاء انقر هنا لعرض أكبر أصداراتن من هذا الرقم.

الشكل (6)
الشكل (6): تعيين ما يصل المعلمة P1 للحصول على البيانات الرنين المغناطيسي. وتختلف هذه المعلمة بين العينات وتعتمد بشكل رئيسي على تركيز الملح. ويرد منحنى الإيماءة 1 H القياسي ل80٪ H 2 O في D 2 O. واحد المسح الأطياف مع تأخير إعادة تدوير 30 ثانية جمعت ورسم أفقيا. وقد اختلف النبض (P1) من 1 إلى 55 μsec μsec في الخطوات من 1 μsec. من الناحية النظرية، ينبغي أن يكون إشارة القصوى نبضه 90 درجة وتساوي الصفر نبضه 180 درجة. ومع ذلك، من الناحية العملية، التخميد الإشعاع يسبب عدم تناسق ومرحلة تشويه المشاكل التي تجعل من الصعب تحديد 90 درجة أو 180 درجة البقول مباشرة. نقطة لاغية الثانية يناظر مدة 360 ° النبض. معارض المنطقة الموسع إشارة المتبقية ل360 ° نبض يستخدم لتعريف المعلمة تردد o1p. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 7
الرقم 7: معالجة البيانات NMR. (أ) الحث مجاني إشارة الاضمحلال في المجال الزمني. 1D أطياف بروتون (ب) الناتجة عن فورييه تحول الاستثمارات الخارجية المباشرة من لوحة وفي مجال التردد ولكن مع المرحلة غير صحيحة (PHC0 -206 درجة). (C) على مراحل (PHC0 -113 درجة) والمشار إليها (إشارة اجتماع الدول الأطراف الثالث في 0 جزء في المليون). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

"/>
الرقم 8: 2D 1 H، N 15 HSQC أطياف المؤتلف 15 N-تاو في 900 ميغاهيرتز. سجلت 3072 و 416 نقطة الحصول على البيانات باستخدام بعرض الطيفية بين 14 و 25 جزء في المليون في H 1 (F2) و 15 N أبعاد (F1)، على التوالي. تم تسجيل 16 بالاشعة في زيادة F1، مما يؤدي إلى مدة التجربة من 4 ساعات و 30 دقيقة. (أ) جيدة عينة نوعية تاو (ب) تاو عينة تبين تدهور كما يتضح من ظهور الأصداء إضافية في منطقة معينة من الطيف (ميداني على مستوى عال 1 H، الحقل منخفضة 15 N)، ومحاصر هنا باللون الأزرق. تم إعداد هذه العينة الماضية دون مثبطات الأنزيم البروتيني. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 9
الرقم 9: 2D 1 H، N 15 HSQC أطياف المؤتلف 15 N-تاو. (A) unphosphorylated تاو، 600 ميغاهرتز الطيف (B) فسفرته تاو، 600 ميغاهيرتز الطيف و (C) فسفرته تاو، 900 ميغاهرتز الطيف. الأصداء إضافية في منطقة معينة من الطيف، محاصر هنا باللون الأحمر، لوحظ في أطياف تاو فسفرته. هذه الأصداء، والتي تتوافق مع بروتون أميد (1 H- 15 N) الارتباطات من pSer وpThr المخلفات، وتصور بسهولة في المنطقة المحيطة 8،5-9،5 جزء في المليون لمدة 1 ساعة و117-125 جزء في المليون لمدة 15 N، خارج الجزء الأكبر من 1 H، N 15 الارتباطات من الطيف تاو unphosphorylated. (A و B) تتوافق مع أطياف المكتسبة في 600 ميغاهيرتز، وسجلت 2048 و 256 نقاط البيانات في الاعراض الطيفية بين 14 و 25 جزء في المليون في H 1 (F2) و 15 N أبعاد (F1)، على التوالي.تم استخدام 32 بالاشعة، وكان إجمالي مدة حيازة 2 ساعة 44 دقيقة و (C) في 900 ميغاهيرتز، وسجلت 3072 و 416 نقاط البيانات في الاعراض الطيفية بين 14 و 25 صفحة في الدقيقة 1 H (F2) و 15 N ( F1) أبعاد، على التوالي. تم استخدام 48 بالاشعة، وكان إجمالي مدة اكتساب 6 ساعة 37 دقيقة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 10
الرقم 10: 3D 1 H، N 15، 13 C NMR الطيف، والإسقاطات واستخراج طائرات 2D. وسجلت 2048، 72، و 256 نقاط البيانات في H 1 (F3)، و 15 N (F2)، و 13 C (F1) أبعاد، على التوالي. الاعراض الطيفية هي 14، 25، و 61 جزء في المليون، تركزت على 4.7، 119، و 41 جزءا في المليون في 1 H،15 شمالا و 13 أبعاد C، على التوالي. مدة الاستحواذ باستخدام 16 بالاشعة هي 4 أيام و 6 ساعة. تمثيل (A) مكعب المقابلة لفورييه تحويل 3D بيانات لطيف HNCACB من تاو فسفرته إرك-الحصول على 600 ميغاهرتز. و2D 1 H، N 15 و1 H، ويتم الحصول على 13 C طائرات من الإسقاط من البيانات 3D على طول 13 C و 15 N البعد، على التوالي. أجريت معالجة البيانات وتمثيلها باستخدام اكتساب NMR وبرامج معالجة. (ب) 2D 1 H، 13 C الطائرة المستخرجة من 3D 1 H، N 15، 13 C NMR بيانات في تحول 15 N الكيميائية من 121.8 جزء في المليون. والتكبير (على اليمين) تركزت على التحول الكيميائي 1 H من 9.38 جزء في المليون يظهر 13 CA و 13 CB الأصداء من كل من بقايا ط (pThr153) و i-1 (Ala152). أخذ اسما مستعارا صدى 13 CB يرجع ذلك إلى عرض من ليالينافذة pectral. أجريت التمثيل البياني وذروة قطف باستخدام برامج التحليل NMR. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وقد استخدمنا مطيافية الرنين النووي المغناطيسي لتحديد خصائص العينات تاو تعديل إنزيمي. يمكن كذلك التعبير المؤتلف وتنقية وصفها هنا للحصول على كامل طول البروتين تاو البشري أن تستخدم لإنتاج متحولة تاو تاو أو المجالات. نظائريا هناك حاجة إلى البروتين المخصب لمطيافية الرنين النووي المغناطيسي، مما يستدعي التعبير المؤتلف. تحديد المواقع الفسفرة يتطلب التنازل الرنين و 15 N، 13 C المسمى مضاعفة البروتين. ونظرا لتكلفة النظائر، مطلوب العائد الجيد في خطوة التعبير المؤتلف. الجلوكوز هو العامل المحدد لنمو البكتيريا في المتوسط M9 بالتالي فإن كمية 13 C 6 -glucose يمكن زيادة إلى 4 غ لكل لتر من متوسط النمو لتحسين الإنتاجية. إضافة كاملة الفيتامينات المتوسطة وMEM ليست الزامية ولكن تساعد على تحفيز النمو وتحسين العائد. ونظرا لارتفاع تكلفة المتوسط ​​المسمى كاملة، ويستخدم هذا المنتج فقط كما التكميليه متوسطة النموت. نمو البكتيريا بطيئة في M9 المتوسطة. عموما، الثقافات البكتيرية باستخدام وسائل الإعلام M9 تستكمل مع 3٪ كاملة وقت الوصول المتوسط ​​الحث بعد حوالي 4 ساعات من الحضانة. بعد الحصول على OD 600 من 1،6-1،8 عادة في نهاية الثقافة. العائد المتوقع من البروتين تاو المؤتلف حوالي 15 ملغم لكل لتر من ثقافة البكتيرية. استخدام حاضنة للبرمجة يسمح لجدولة مريح إنتاج البروتين، وجمع بيليه البكتيرية ومراقبة تحليل إنتاج البروتين خلال ساعات يوم العمل.

تركيز عينة مهم للحصول على الطيف ذات نوعية جيدة. ومن شأن عينة نموذجية تاو كافية لطائفة 2D يحتوي على 1 ملغ في 200 ميكرولتر (أي 100 ميكرومتر) بروتين تاو. لطيف 3D، ومطلوبة لا يقل عن 200 ميكرومتر في 300 ميكرولتر، شريطة أن يتم استخدام رأس مسبار المبردة. الوصول إلى مطياف عالية المجال، مثل الصك 900 ميغاهرتز المستخدمة في هذه الدراسة سوف توفر أفضل إشارة إلى الضجيجوالحد من القيود المفروضة على تركيز العينة (الشكل 8). وبالنظر إلى أن تاو هو بروتين المختلين كبير، وتتميز أطياف الرنين النووي المغناطيسي من خلال تداخل الإشارات كبيرا، وسوف NMR مطياف عالية الميدان أيضا أن تكون الخيار الأفضل من حيث القرار (الشكل 8). ومع ذلك، فإن الأصداء الموافق مواقع الفسفرة هي في منطقة متميزة من الطيف وسهلة للكشف حتى مع مطياف 600 ميغاهيرتز (قارن أرقام 9 B و9C). وبالإضافة إلى ذلك، نظرا لطبيعتها المضطربة، وبروتين تاو حساس إلى التحلل البروتيني (أرقام 8B).

ينصح تعقيم مخازن للحد من تدهور تاو. إضافة مثبطات الأنزيم البروتيني لعينة NMR يساعد على حماية تاو من التدهور خلال فترات الحصول على البيانات التي يمكن أن تستمر من ساعات إلى أيام، اعتمادا على تسلسل النبض. مطلوب انخفاض الرقم الهيدروجيني (أي درجة حموضة أقل من 7.0) لAVOID صرف سريع جدا بين البروتونات البروتين والبروتونات المياه، الأمر الذي يؤدي إلى إشارة توسيع. درجة الحموضة عينة يجب أيضا أن تسيطر عليها بشكل جيد لضمان استنساخ الأطياف. في الواقع، منذ قيمة pKa من pSer وpThr قريبة من درجة الحموضة المثلى لمطيافية الرنين النووي المغناطيسي، والتحولات الكيميائية للمخلفات فسفرته حساسة جدا للتغيرات درجة الحموضة. ضبط درجة الحموضة من العينة NMR يمكن أن يتم مباشرة باستخدام متر الرقم الهيدروجيني مع القطب درجة الحموضة الصغيرة، وتكييفها لكميات صغيرة. تاو هو بروتين قابل للذوبان ولا تجميع في الظروف القياسية. إضافة polyanions، مثل كبريتات الهيبارين، والحضانة عند 37 درجة مئوية يمكن بدء التجميع في عينات تاو. في هذه الحالة، نظرا لطبيعة صلبة من المجاميع، أكثر من الأصداء في الطيف الرنين المغناطيسي المقابلة توسيع وراء الكشف. حتى العينات تاو فسفرته لا الإجمالية في الشروط الموضحة هنا للحصول على البيانات الرنين المغناطيسي.

مقارنة تحليل الأجسام المضادة، يوفر NMR لسعرض verall من PTMs. ويمكن أيضا قياس الطيف الكتلي أن تستخدم لتحديد نمط الفسفرة من عينة البروتين. وضع العلامات النظائر ليس من الضروري لهذه التقنية، وكميات عينة المطلوبة هي أصغر من ذلك بكثير. ومع ذلك، توصيف بروتين مع phosphorylations متعددة، مثل تاو، لا يزال تحديا. سوف phosphorylations المجاورة تنتج الببتيدات إسوي الضغط في استراتيجيات أسفل إلى أعلى لتحديد الهوية. هوية كاملة ثم يحتاج MS / MS تسلسل الببتيدات التي حصل عليها عينة التحلل البروتيني. ميزة من NMR تتكون في الطبيعة الكمية الفعلية من هذه التقنية. كثافة إشارة الرنين المغناطيسي يمكن أن تكون مرتبطة لكمية من مجموعة كيميائية موجودة في موقع معين. وبالتالي يمكننا تحديد نسبة التعديل الكيميائي في كل موقع. ومع ذلك فقد أظهرت معظم التقدم الذي أحرز مؤخرا في تطبيقات MS أن تحليل MS من تاو الفسفرة متعددة ممكنا 24، حتى بطريقة كمية بعد تطبيع السليم 25.

هنا، قدمنا تاو الفسفرة التي كتبها ERK2 تفعيلها، ولكن منهجية يمكن استخدامها لالفسفرة مع تحركات أخرى أيضا 6،7،26 - 28. التجارب الحركية يمكن أن يؤديها، والتي يمكن أن تساعد على تحديد خصوصية كيناز نحو الركيزة بروتين 28-31. دراسات الفسفرة لا تقتصر على تحركات المؤتلف، والنشاط كيناز من الخلايا او الانسجة مقتطفات يمكن تحليل 6،32،28. تطور مثير للاهتمام هو استخدام الرنين المغناطيسي النووي في الخلية للدراسة في التعديلات الموقع 33،34. على العكس من ذلك، كما تتكيف جيدا NMR لمعالجة الفوسفاتيز خصوصية، كما تبين من خلال دراسة نزع الفسفات من تاو فسفرته قبل الفوسفاتيز PP2A 35. التحليل الطيفي NMR يمكن تطبيقها على توصيف مثبطات كيناز بمقارنة الشخصي الفسفرة من الركيزة البروتين في طائفة 2D بحضور الطرافة المانع المركبح الطيف الصادر من تجربة مراقبة 6.

مصلحة باستخدام الرنين المغناطيسي الطيفي، بالمقارنة مع تقنيات مايكروسوفت أكثر حساسية، يقيم في مجموعة واسعة من التطبيقات استغلال بروتوكول الموصوفة هنا، بدلا من التركيز على القدرة التحليلية وحدها. وقد ثبت ذلك من الأمور الهامة لتحديد المواقع الفسفرة لتكون قادرة على ربط phosphorylations محددة مع بعض التعديلات الهيكلية والوظيفية التي تمت دراستها بشكل رئيسي باستخدام الرنين المغناطيسي. مطيافية الرنين المغناطيسي النووي من عينات تاو فسفرته يسمح لاستكشاف التأثير الهيكلي للالفسفرة على هياكل ثانوية محلية عابرة على حد سواء، وعلى إعادة ترتيب عالمي من الفرقة الديناميكية للتعديل تاو 36،37. وتشمل الجوانب الفنية وتنظيم كل من تفاعل تاو مع الشركاء البروتين 7،38،39 والتجميع التي كتبها تاو الفسفرة 8. العينة تاو فسفرته تتميز NMR يمكن زيادة استخدامها لفك التفاعلات تعتمد على الفوسفات، لالمثال مع 14-3-3 البروتينات 40، وهندستها تفاعل البروتين البروتين مثبطات 41،42. NMR يسمح تعريف موقع التفاعل (ق) على مستوى بقية، واعتماد هذا التفاعل على الفسفرة. بالإضافة إلى ذلك، مطيافية الرنين النووي المغناطيسي من فسفرته تاو هو المنهجية الأساسية التي تميز رابطة الدول المستقلة البرولين: إيزوميراز العابرة PIN1، انزيم التي تعتمد على الفوسفات المهم تشارك في تنظيم تاو 43-45. وبالإضافة إلى ذلك، تحليل الفسفرة التي كتبها NMR يمكن تطبيقها ليس فقط للنازحين ولكن أيضا للبروتينات كروية 46. وأخيرا، وأنواع أخرى من تاو PTMs مثل acetylations 22،40،41 يمكن دراستها عن طريق الرنين المغناطيسي. أثبتت البروتوكولات المذكورة هنا بالغ الأهمية لفهم أفضل للتنظيم وظيفي وهيكلي من تاو في الظروف الفسيولوجية والمرضية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pET15B recombinant T7 expression plasmid Novagen 69257 Keep at -20 °C
BL21(DE3) transformation competent E. coli bacteria New England Biolabs C2527I Keep at -80 °C
Autoclaved LB Broth, Lennox  DIFCO 240210 Bacterial Growth Medium
MEM vitamin complements 100x Sigma 58970C Bacterial Growth Medium Supplement
15N, 13C-ISOGRO complete medium powder Sigma 608297 Bacterial Growth Medium Supplement
15NH4Cl Sigma 299251 Isotope
13C6-Glucose Sigma 389374 Isotope
Protease inhibitor tablets  Roche 5056489001 Keep at 4 °C
1 tablet in 1 ml is 40x solution that can be kept at -20 °C
DNaseI EUROMEDEX 1307 Keep at -20 °C
Homogenizer (EmulsiFlex-C3) AVESTIN Lysis is realized at 4 °C
Pierce™ Unstained Protein MW Marker Pierce 266109
Active human MEK1 kinase, GST Tagged Sigma M8822 Keep at -80 °C
AKTÄ Pure chromatography system GE Healthcare FPLC
HiTrap SP Sepharose FF (5 ml column) GE Healthcare 17-5156-01 Cation exchange chromatography columns
HiPrep 26/10 Desalting GE Healthcare 17-5087-01 Protein Desalting column
PD MidiTrap G-25 GE Healthcare 28-9180-08 Protein Desalting column
Tris D11, 97% D Cortecnet CD4035P5 Deuterated NMR buffer
5 mm Symmetrical Microtube SHIGEMI D2O (set of 5 inner & outerpipe)  Euriso-top BMS-005B NMR Shigemi Tubes
eVol kit-electronic syringe starter kit Cortecnet 2910000 Pipetting
Bruker 900 MHz AvanceIII with a triple resonance cryogenic probehead Bruker NMR spectrometer for data acquisition
Bruker 600 MHz Avance with a triple resonance cryogenic probehead Bruker NMR spectrometer for data acquisition
TopSpin 3.1 Bruker Acquisition and Processing software for NMR experiments
Sparky 3.114 UCSF (T. D. Goddard and D. G. Kneller) NMR data Analysis software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Grundke-Iqbal, I., Iqbal, K., Tung, Y. C., Quinlan, M., Wisniewski, H. M., Binder, L. I. Abnormal phosphorylation of the microtubule-associated protein tau (tau) in Alzheimer cytoskeletal pathology. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 83 (13), 4913-4917 (1986).
  2. Hasegawa, M., Morishima-Kawashima, M., Takio, K., Suzuki, M., Titani, K., Ihara, Y. Protein sequence and mass spectrometric analyses of tau in the Alzheimer's disease brain. J. Biol. Chem. 267 (24), 17047-17054 (1992).
  3. Kopke, E., Tung, Y. C., Shaikh, S., Alonso, A. C., Iqbal, K., Grundke-Iqbal, I. Microtubule-associated protein tau. Abnormal phosphorylation of a non-paired helical filament pool in Alzheimer disease. J. Biol. Chem. 268 (32), 24374-24384 (1993).
  4. Wischik, C. M., Edwards, P. C., et al. Quantitative analysis of tau protein in paired helical filament preparations: implications for the role of tau protein phosphorylation in PHF assembly in Alzheimer's disease. Neurobiol. Aging. 16 (3), 409-417 (1995).
  5. Prabakaran, S., Everley, R. A., et al. Comparative analysis of Erk phosphorylation suggests a mixed strategy for measuring phospho-form distributions. Mol. Syst. Biol. 7, 482 (2011).
  6. Landrieu, I., Lacosse, L., et al. NMR analysis of a Tau phosphorylation pattern. J. Am. Chem. Soc. 128 (11), 3575-3583 (2006).
  7. Amniai, L., Barbier, P., et al. Alzheimer disease specific phosphoepitopes of Tau interfere with assembly of tubulin but not binding to microtubules. FASEB J. 23 (4), 1146-1152 (2009).
  8. Qi, H., Prabakaran, S., et al. Characterization of Neuronal Tau Protein as a Target of Extracellular Signal-regulated Kinase. J. Biol. Chem. 291 (14), 7742-7753 (2016).
  9. Bibow, S., Ozenne, V., Biernat, J., Blackledge, M., Mandelkow, E., Zweckstetter, M. Structural impact of proline-directed pseudophosphorylation at AT8, AT100, and PHF1 epitopes on 441-residue tau. J. Am. Chem. 133 (40), 15842-15845 (2011).
  10. Boulton, T. G., Yancopoulos, G. D., et al. An insulin-stimulated protein kinase similar to yeast kinases involved in cell cycle control. Science. 249 (4964), 64-67 (1990).
  11. Anderson, N. G., Maller, J. L., Tonks, N. K., Sturgill, T. W. Requirement for integration of signals from two distinct phosphorylation pathways for activation of MAP kinase. Nature. 343 (6259), 651-653 (1990).
  12. Seger, R., Ahn, N. G., et al. Microtubule-associated protein 2 kinases, ERK1 and ERK2, undergo autophosphorylation on both tyrosine and threonine residues: implications for their mechanism of activation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88 (14), 6142-6146 (1991).
  13. Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J. Mol. Biol. 189 (1), 113-130 (1986).
  14. Rosenberg, A. H., Lade, B. N., Chui, D. S., Lin, S. W., Dunn, J. J., Studier, F. W. Vectors for selective expression of cloned DNAs by T7 RNA polymerase. Gene. 56 (1), 125-135 (1987).
  15. Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166 (4), 557-580 (1983).
  16. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  17. Bienkiewicz, E. A., Lumb, K. J. Random-coil chemical shifts of phosphorylated amino acids. J. Biomol. NMR. 15 (3), 203-206 (1999).
  18. Wishart, D. S., Bigam, C. G., Holm, A., Hodges, R. S., Sykes, B. D. 1H, 13C and 15N random coil NMR chemical shifts of the common amino acids. I. Investigations of nearest-neighbor effects. J Biomol NMR. 5 (1), 67-81 (1995).
  19. Tamiola, K., Acar, B., Mulder, F. A. A. Sequence-specific random coil chemical shifts of intrinsically disordered proteins. J. Am. Chem. Soc. 132 (51), 18000-18003 (2010).
  20. Lippens, G., Wieruszeski, J. M., et al. Proline-directed random-coil chemical shift values as a tool for the NMR assignment of the tau phosphorylation sites. Chembiochem. 5 (1), 73-78 (2004).
  21. Smet, C., Leroy, A., Sillen, A., Wieruszeski, J. M., Landrieu, I., Lippens, G. Accepting its random coil nature allows a partial NMR assignment of the neuronal Tau protein. Chembiochem. 5 (12), 1639-1646 (2004).
  22. Mukrasch, M. D., Bibow, S., et al. Structural polymorphism of 441-residue tau at single residue resolution. PLoS Biol. 7 (2), e34 (2009).
  23. Harbison, N. W., Bhattacharya, S., Eliezer, D. Assigning backbone NMR resonances for full length tau isoforms: efficient compromise between manual assignments and reduced dimensionality. PloS One. 7 (4), e34679 (2012).
  24. Morris, M., Knudsen, G. M., et al. Tau post-translational modifications in wild-type and human amyloid precursor protein transgenic mice. Nat. Neurosci. 18 (8), 1183-1189 (2015).
  25. Mair, W., Muntel, J., et al. FLEXITau: Quantifying Post-translational Modifications of Tau Protein in Vitro and in Human Disease. Analytical Chemistry. 88 (7), 3704-3714 (2016).
  26. Leroy, A., Landrieu, I., et al. Spectroscopic studies of GSK3{beta} phosphorylation of the neuronal tau protein and its interaction with the N-terminal domain of apolipoprotein E. J. Biol. Chem. 285 (43), 33435-33444 (2010).
  27. Theillet, F. -X., Smet-Nocca, C., et al. Cell signaling, post-translational protein modifications and NMR spectroscopy. J. Biomol. NMR. 54 (3), 217-236 (2012).
  28. Qi, H., Cantrelle, F. -X., et al. Nuclear magnetic resonance spectroscopy characterization of interaction of Tau with DNA and its regulation by phosphorylation. Biochemistry. 54 (7), 1525-1533 (2015).
  29. Cordier, F., Chaffotte, A., Wolff, N. Quantitative and dynamic analysis of PTEN phosphorylation by NMR. Methods. 77-78, 82-91 (2015).
  30. Thongwichian, R., Kosten, J., et al. A Multiplexed NMR-Reporter Approach to Measure Cellular Kinase and Phosphatase Activities in Real-Time. J. Am. Chem. Soc. 137 (20), 6468-6471 (2015).
  31. Smith, M. J., Marshall, C. B., Theillet, F. -X., Binolfi, A., Selenko, P., Ikura, M. Real-time NMR monitoring of biological activities in complex physiological environments. Curr. Opin. Struct. Biol. 32, 39-47 (2015).
  32. Theillet, F. X., Rose, H. M., et al. Site-specific NMR mapping and time-resolved monitoring of serine and threonine phosphorylation in reconstituted kinase reactions and mammalian cell extracts. Nat. Protoc. 8 (7), 1416-1432 (2013).
  33. Bodart, J. -F., Wieruszeski, J. -M., et al. NMR observation of Tau in Xenopus oocytes. J. Magn. Reson. 192 (2), 252-257 (2008).
  34. Lippens, G., Landrieu, I., Hanoulle, X. Studying posttranslational modifications by in-cell NMR. Chem. Biol. 15, 311-312 (2008).
  35. Landrieu, I., Smet-Nocca, C., et al. Molecular implication of PP2A and Pin1 in the Alzheimer's disease specific hyperphosphorylation of Tau. PLoS One. 6, e21521 (2011).
  36. Sibille, N., Huvent, I., et al. Structural characterization by nuclear magnetic resonance of the impact of phosphorylation in the proline-rich region of the disordered Tau protein. Proteins. 80 (2), 454-462 (2012).
  37. Schwalbe, M., Kadavath, H., et al. Structural Impact of Tau Phosphorylation at Threonine 231. Structure. 23 (8), 1448-1458 (2015).
  38. Amniai, L., Lippens, G., Landrieu, I. Characterization of the AT180 epitope of phosphorylated Tau protein by a combined nuclear magnetic resonance and fluorescence spectroscopy approach. Biochem. Biophys. Res. Commun. 412 (4), 743-746 (2011).
  39. Sottejeau, Y., Bretteville, A., et al. Tau phosphorylation regulates the interaction between BIN1's SH3 domain and Tau's proline-rich domain. Acta Neuropathol. Commun. 3 (1), (2015).
  40. Joo, Y., Schumacher, B., et al. Involvement of 14-3-3 in tubulin instability and impaired axon development is mediated by Tau. FASEB J. 29 (10), 4133-4144 (2015).
  41. Smet, C., Duckert, J. F., et al. Control of protein-protein interactions: structure-based discovery of low molecular weight inhibitors of the interactions between Pin1 WW domain and phosphopeptides. J. Med. Chem. 48 (15), 4815-4823 (2005).
  42. Milroy, L. -G., Bartel, M., et al. Stabilizer-Guided Inhibition of Protein-Protein Interactions. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 54 (52), 15720-15724 (2015).
  43. Smet, C., Sambo, A. V., et al. The peptidyl prolyl cis/trans-isomerase Pin1 recognizes the phospho-Thr212-Pro213 site on Tau. Biochemistry. 43 (7), 2032-2040 (2004).
  44. Landrieu, I., Smet, C., et al. Exploring the molecular function of PIN1 by nuclear magnetic resonance. Curr Protein Pept Sci. 7 (3), 179-194 (2006).
  45. Lippens, G., Landrieu, I., Smet, C. Molecular mechanisms of the phospho-dependent prolyl cis/trans isomerase Pin1. FEBS J. 274 (20), 5211-5222 (2007).
  46. Smet-Nocca, C., Launay, H., Wieruszeski, J. M., Lippens, G., Landrieu, I. Unraveling a phosphorylation event in a folded protein by NMR spectroscopy: phosphorylation of the Pin1 WW domain by PKA. J. Biomol. NMR. 55, 323-337 (2013).
  47. Smet-Nocca, C., Wieruszeski, J. M., Melnyk, O., Benecke, A. NMR-based detection of acetylation sites in peptides. J. Pept. Sci. 16 (8), 414-423 (2010).
  48. Kamah, A., Huvent, I., et al. Nuclear magnetic resonance analysis of the acetylation pattern of the neuronal Tau protein. Biochemistry. 53 (18), 3020-3032 (2014).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 118، النووي التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي، ووضع العلامات النظائر، البروتين المختلين جوهريا، البروتين المؤتلف، وتنقية البروتين، البروتين الفسفرة، الحصول على البيانات الرنين المغناطيسي، وتعيين الرنين.
النووي التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي لتحديد Phosphorylations متعددة من جوهريا المختلين البروتينات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Danis, C., Despres, C., Bessa, L.… More

Danis, C., Despres, C., Bessa, L. M., Malki, I., Merzougui, H., Huvent, I., Qi, H., Lippens, G., Cantrelle, F. X., Schneider, R., Hanoulle, X., Smet-Nocca, C., Landrieu, I. Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins. J. Vis. Exp. (118), e55001, doi:10.3791/55001 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter