Mice with acquired hypoparathyroidism would be useful for studying novel drug therapies for hypoparathyroidism. Two procedures to create such mice are demonstrated. The GFP-PTX mouse is generated by surgical parathyroidectomy guided by green fluorescing parathyroid glands. A second, non-surgical approach is based on parathyroid-specific expression of the diphtheria toxin receptor.
Hypoparathyroidism (HP) is a disorder characterized by low levels of PTH which lead to hypocalcemia, hyperphosphatemia, and low bone turnover. The most common cause of the disease is accidental removal of the parathyroid glands during thyroid surgery. Novel therapies for HP are needed, but testing them requires reliable animal models of acquired HP.
Here, we demonstrate the generation of two mouse models of acquired HP. In the GFP-PTX model, mice with green fluorescent protein (GFP) expressed specifically in the parathyroids (PTHcre-mTmG) were created by crossing PTHcre+ mice with Rosa-mTmGfl/fl mice. Green fluorescing parathyroid glands are easily identified under a fluorescence dissecting microscope and parathyroidectomy is performed in less than 20 min. After fluorescence-guided surgery, mice are profoundly hypocalcemic. Contrary to the traditional thyro-parathyroidectomy, this precise surgical approach leaves thyroid glands and thyroid function intact. The second model, which does not require surgery, is based on a diphtheria-toxin approach. PTHcre-iDTR mice, which express the diphtheria toxin (DT) receptor specifically in the parathyroids, were generated by crossing the inducible DTR mouse with the PTHcre mouse. Parathyroid cells are thus rendered sensitive to diphtheria toxin (DT) and can be selectively destroyed by systemically injecting mice with DT. The resulting hypocalcemic phenotype is stable.
Siden den første systematiske beskrivelse af biskjoldbruskkirtlerne i mennesker og i flere andre arter af Sandström i 1880 en, forstå betydningen af denne lille endokrine organ for human fysiologi og sygdom har løbende forbedret. Biskjoldbruskkirtlerne udskille parathyroidhormon (PTH), den primære regulator af calciummetabolisme. PTH er også et vigtigt hormon for phosphat homeostase og knogleomsætning 1, 2. Utilsigtet fjernelse eller beskadigelse af parathyroids under hals kirurgi er den mest almindelige årsag til hypoparathyroidisme, en sygdom karakteriseret ved lav blod calcium, lav PTH, og forhøjede fosfor 1.
For bedre undersøgelse erhvervet hypoparathyroidisme og test nye behandlingsformer, pålidelige og let kræves tilgængelige musemodeller. Mus er meget udbredt i forskning, fordi en lang række genetiske værktøjer er envailable i denne art tillader avancerede mekanistiske undersøgelser in vivo. Selv kan anvendes kirurgisk parathyroidektomi (PTX) i rotter 2, 3, 4, 5 og større pattedyr 6, 7, 8, er det teknisk meget udfordrende i mus på grund af den lille størrelse af kirtlerne og deres variable anatomisk fordeling 9. Derfor er thyro-parathyroidektomi (TPTX) udføres typisk i mus, hvor skjoldbruskkirtlen og biskjoldbruskkirtlerne fjernes sammen 10. Men lav skjoldbruskkirtel hormon niveauer er en potentiel confounder i forsøg, komplicerer denne model. Desuden er C-celler i skjoldbruskkirtlen, der producerer calcitonin, et hormon vigtig i calciumhomøostase hos gnavere, også tabt efter fjernelse af thyroids 11.
Adskillige genetiske musemodeller for hypoparathyroidisme findes, som omfatter PTH-null mus 12, GCM2-null mus 13, og Nuf mus med en aktiverende mutation i calcium-sensing receptor (CASR) 14, 15. Men disse genetiske defekter allerede er til stede under fosterudviklingen, og funktionen af parathyroids derfor allerede svækket under embryogenese. Dette kan påvirke udviklingen af organer såsom skelettet. Dette står i kontrast med patienter med postsurgical hypoparathyroidisme der erhverver sygdommen senere i livet. Endvidere er nogle af disse musemodeller udviser tidlig letalitet og reduceret fertilitet, hvilket yderligere komplicerer deres anvendelse 12, 13, 14.
Vi udviklede to nye mus models for erhvervet hypoparathyroidisme. Brug af genetisk modificerede mus som udtrykker GFP specifikt i parathyroids tillader biskjoldbruskkirtlerne let at identificere for kirurgisk fjernelse uden at fjerne skjoldbruskkirtlen. Denne mus blev dannet ved at krydse PTH-Cre mus, som udtrykker Cre-rekombinase under kontrol af den 5,5 kb PTH promotor 16 med ROSA mTmG musen. De resulterende PTHcre; mTmG mus udtrykker grønt fluorescerende protein specifikt i parathyroidea-celler. Den anden musemodel bruger samme PTH-Cre, denne gang for at fjerne en STOP-kassette fra den inducerbare DTR mus, hvilket resulterer i ekspression af difteritoxin receptoren specifikt i parathyroids. Systemisk administration af DT ødelægger parathyroidea celler, hvilket gør dyrene hypoparathyroid uden kirurgi.
De to musemodeller præsenteres i dette studie viser en stabil hypocalcemiske fænotype over tre måneders observation period. Procedurerne er let at udføre, fænotypen er reproducerbar, og de hypoparathyroid mus udviser en høj overlevelsesprocent 17.
Vi demonstrerer teknikken med GFP-styrede parathyroidektomi hjælp transgene mus med GFP udtryk selektivt i biskjoldbruskkirtlerne. I PTHcre, mTmG mus, dobbelt fluorescens (den grønne GFP i Cre-udtrykte celler og rød tomat i ikke-Cre udtrykte celler) gjort os i stand til klart at identificere og præcist fjerne alle biskjoldbruskkirtlerne uden at fjerne skjoldbruskkirtel. Mens vi foretrækker brugen af dobbelt-fluorescens mTmG mus for evnen til at identificere fluorescerende rød ikke-parathyroidea væv, bør vores fremgangsmåde også arbejde godt bruge en enkelt fluorescerende dyr som tomat rød (B6.Cg-Ct (ROSA) 26Sortm14 ( CAG-tdTomato) Hze / J) mus. Proceduren er forholdsvis let at udføre, kræver omkring 20 min per mus, og resulterer i en alvorlig og vedvarende hypoparathyroid fænotype.
Desuden er en anden fordel af GFP-positive biskjoldbruskkirtlerne er den lethed for påvisning af afvigende biskjoldbruskkirtlerne. Vores undersøgelser viser,mislocalization af parathyroids i ca. en fjerdedel af B6 mus (figur 1), som let detekteret i vores musemodel af grøn fluorescens. I modsætning til thyro-parathyroidektomi, vores teknik undgår fjernelse af skjoldbruskkirtlen med efterfølgende behov for skjoldbruskkirtelhormon og det ukendte virkning af fjernelse af calcitonin-producerende skjoldbruskkirtel C-celler. Fluorescensmærkede biskjoldbruskkirtlerne kunne også anvendes til andre undersøgelser, der kræver isolering af biskjoldbruskkirtlerne. Begrænsningen af denne model omfatter kravet til operation. Grundlæggende mikrokirurgi færdigheder og en dissektion mikroskop med en fluorescerende lyskilde er påkrævet.
En anden teknik til generering hypoparathyroid mus, der eliminerer behovet for kirurgi er dokumenteret. Difteritoksinproducerende behandlet PTHcre-iDTR mus udviser en mildere hypoparathyroidisme fænotype, men blot kræver indsprøjtning DT intraperitonealt i musen. Den kritiske del for generere denne model blev optimering af dosis og dosering. Høje doser af DT medførte toksicitet, men lave doser faldt effektiviteten af fremgangsmåden. Vi bestemt, at dosis regiment af 2 injektioner med 5 ug / kg, administreret 3 dage fra hinanden, resulterede i pålidelig og stabil hypocalcæmi uden / minimal dødelighed.
I sidste ende håber vi, at disse to tilgange giver nyttige musemodeller for erhvervet hypoparathyreoidisme. Ved hjælp af en hidtil ukendt langtidsvirkende PTH, rapporterede vi den første anvendelse af begge disse modeller til bestemmelse af effektiviteten af nye lægemidler til hypoparathyroidisme 17.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af NIH tilskud R01-DK100584 og Kina State Key Laboratory af orale sygdomme Open Funding SKLOD2015OF01 (RB). Vi takker Wenping Zhao, Tadatoshi Sato, og Kelly Lauter om hjælp.
ROSAmT/mG mice | The Jackson Laboratory | 7676 | |
PTH-Cre mice | The Jackson Laboratory | 5989 | |
iDTRmice | The Jackson Laboratory | 7900 | |
6-0 polyglactin 910 suture with needle | Ethicon, Inc | J510G | |
Safety Single Edge Razor Blades | American Safety Razor Company | 66-0089 | |
Disposable Scalpel | Feather Safety Razor Co., LTD | 72042-11 | |
Povidone-Iodine Prep Pads | Dynarex Corporation | 1108 | |
Ply gauze | Busse. Inc | BHD707 | |
0.9% Sodium Chloride Solution | HOSPIRA Worldwide, Inc | 07983-09 | |
1mL 29G Insulin Syringe | BECTON DICKINSON | 329622 | |
Surgical Incise Drapes | 3M | 6640EZ | |
Dumstar Biology forceps | Roboz Surgical Instrument Co., Inc | RS-4984 | |
Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical Instrument Co., Inc | RS-5605 | |
Needle Holder | MILTEX.,Inc | V98-42 | |
2,2,2-Tribromethanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
2-Methyl-2-Butanol | Sigma-Aldrich | 152463 | For dissolve the 2,2,2-Tribromethanol |
Diphtheria Toxin Powder | Sigma-Aldrich | D0564 | Dissolve in 0.9% sodium chloride solution at 1mg/mL as the stock solution in -80C |
Multicap Blood Collection Capillary tubes | Siemens Healthcare Diagnostics Ltd | 855578 | For collecting blood in iCa2+ analysis using RapidLab 348 Ca2+/pH analyzer |
RapidLab 348 Ca2+/pH analyzer | Siemens Healthcare | For iCa2+ analysis |