Summary
Ce protocole fournit une méthode pour la collecte de cellules souches embryonnaires de souris (MESC) de moyenne Climatisé (MESC-CM) dérivé de sérum (sérum fœtal bovin, FBS) - et d'alimentation (fibroblastes embryonnaires de souris, MEF) conditions sans gluten pour une cellule approche -free. Il peut être applicable pour le traitement du vieillissement et de maladies associées au vieillissement.
Introduction
L'objectif de ce protocole est de recueillir des souris embryonnaires cellules souches (MESC) moyenne Climatisé (MESC-CM) à partir des conditions de culture sans sérum et sans alimentation et de caractériser ses fonctions biologiques.
En général, les cellules souches embryonnaires (CSE) ont un grand potentiel pour la médecine régénérative et la thérapie cellulaire en raison de leur pluripotence et la capacité d'auto-renouvellement 1-3. Cependant, la transplantation directe de cellules souches a plusieurs limitations, telles que le rejet immunitaire et la formation de tumeurs 4,5. Par conséquent, une approche sans cellule peut fournir une stratégie thérapeutique alternative pour la médecine régénérative et les interventions de vieillissement 6,7.
La sénescence est considérée comme une contrepartie cellulaire au vieillissement des tissus et des organes, caractérisé par un état permanent d'arrêt de la croissance, la physiologie cellulaire altérée, et les comportements. Le vieillissement est le principal facteur de risque pour les maladies courantes, y compris le cancer, les maladies cardiovasculaires, type 2 diabète, et la neurodégénérescence 8. Une des caractéristiques évidentes du vieillissement est la baisse du potentiel de régénération des tissus, qui est causée par le vieillissement de cellules souches et de l' épuisement 9. De nombreuses études ont montré d' importantes molécules pharmacologiques, tels que la rapamycine 9, le resvératrol 10, et de la metformine 11, et les facteurs systémiques sang, à savoir GDF11 12, qui ont la capacité de retarder constamment le vieillissement et de prolonger la durée de vie.
Dans la présente étude, MESC-CM a été récolté sans sérum (sérum fœtal bovin, FBS) et alimentation (fibroblastes de souris embryonnaires, MEF) couches d'exclure la contamination des facteurs sériques et les facteurs sécrétoires de MEF. Ces conditions ont permis une CM et sans sérum d'alimentation qui a permis par conséquent l'identification précise des facteurs sécrétoires MESC spécifiques.
Ce protocole proposé est très efficace, relativement rentable et facileopérer. Cette technique donne un aperçu de la caractérisation des facteurs solubles MESC dérivés qui peuvent arbitrer un effet anti-sénescence, qui peut être utilisé pour le développement d'une approche thérapeutique acellulaire sûre et potentiellement avantageuse vers les interventions pour les maladies liées au vieillissement associées et autres régénérative traitements.
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Protocol
REMARQUE: Un schéma du sérum et le protocole de collecte de CM sans chargeur-est représenté sur la figure 1.
1. Matériaux (Préparation du MEF, Medium, Plaques et Solutions)
- Préparer 500 ml de milieu de culture les MEF. Supplément milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) avec 10% de FBS (qualité ESC), 50 unités / ml de pénicilline et 50 mg / ml de streptomycine.
- Isoler MEFs à partir d' embryons suivant un protocole de routine établie 13 et les maintenir dans le milieu MEF.
- Préparer 500 ml de milieu pour la culture des mESCs. DMEM est complété avec 15% de FBS et 2 mM de L-glutamine, de 100 um d'acides aminés non essentiels (NEAA), 100 pM de β-mercaptoéthanol, 100 unités / ml de facteur inhibiteur de leucémie (LIF), 50 unités / ml de pénicilline et 50 mg / ml de streptomycine.
- Préparer les plaques gélifiés (5 plaques gélatinisés / 1 MESC plaque) par revêtement 10 cm boîtes de culture de cellules avec 5 ml d'une solution de gélatine à 0,1%. Laisser incuber pendant au moins 10 min à température ambiante.
- Préparer 500 ml de milieu sérique réduit pour une condition sans sérum de mESCs. Supplément réduit Sérum médias avec 1,2 g de bicarbonate de sodium (pH 7,0). Filtrer à travers une bouteille-top filtre de 0,2 um.
- Préparer la β-galactosidase par la sénescence associée (SA β-gal) de solution de coloration pour la détection de cellules sénescentes: 1 mg / ml de X-gal (dissous dans du diméthylformamide, DMF), l'acide citrique 40 mM / tampon phosphate de sodium (pH 6,0) , 5 mM de ferricyanure de potassium, 5 mM de ferrocyanure de potassium, 150 mM de NaCl et 2 mM de MgCl2 14.
ATTENTION: (dangereux) DMF est une solution toxique et corrosif. Porter un vêtement de protection individuelle (par exemple, nitrile ou de latex des gants, une blouse et des lunettes) lors de la manipulation solution. Utilisez une hotte. - Préparer 500 ml de milieu à la culture humaine fibroblastes dermiques (HDFS, NHDF-Ad-Der-fibroblaste). Supplément DMEM avec 10% de FBS et 100 unités / ml de pénicilline et 100 mg / ml streptomycine.
REMARQUE: Effectuer toutes les étapes dans une hotte de sécurité biologique de culture cellulaire.
- Traiter les MEFs avec 20 ml de milieu contenant du MEF 10 pg / ml de mitomycine C dans une boîte de culture cellulaire de 15 cm. Incuber pendant 2 heures à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Aspirer le moyen de MEF. Laver les cellules avec du PBS trois fois. Ajouter 3 ml de trypsine-EDTA (TE 1 x) et on incube pendant 3 minutes à 37 ° C et 5% de CO 2. Au bout de 3 minutes, neutraliser le TE avec 6 ml de milieu MEF et centrifugation pendant 3 minutes à 300 x g.
- Remettre en suspension dans 5 ml de milieu MEF. Déterminer le nombre de cellules dans la suspension cellulaire obtenue en utilisant une coloration au bleu trypan et un hémocytomètre. Plaque (FAE nourricières inactivées) à une densité de 2 x 10 6 cellules par 10 cm de boîte de culture cellulaire en milieu MEF. Incuber pendant 24 heures à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Remplacez le support MEF avec le milieu MESC 24 heures après l'étalement du chargeur (sur lale jour suivant).
- Plate les mESCs (G4 hybride F1 de cellules ES) à une densité de 2 x 10 6 cellules sur le chargeur avec un milieu MESC. Incuber pendant 48 heures à 37 ° C et 5% de CO 2.
NOTE: L'effet anti-vieillissement de MESC-CM est probablement plus forte lorsque le numéro de passage inférieur mESCs sont utilisés 15-17. Nous avons acquis une ligne G4 MESC du Dr Andras Nagy à l'Institut Lunenfeld-Tanenbaum recherche, Hôpital Mount Sinai, 25 Orde Street, Toronto, ON, M5T 3H7, Canada. - Gardez les cellules à une densité relativement élevée et le passage à un état sous-confluentes 70-80%. Remplacez le support avec un milieu MESC frais tous les jours.
3. Collection de Serum et libre Feeder-milieu conditionné (figure 1B et 2B)
REMARQUE: Effectuer toutes les étapes dans une hotte de sécurité biologique de culture cellulaire.
- Rincer la plaque MESC avec 5 ml de PBS. Ajouter 1 ml de TE (2,5 fois) et on incube pendant 3 minutes à 37 ° C et 5% de CO 2. Après 3 min, neutraliser le TE avec 2 ml de MESC medium et centrifuge pendant 3 min à 300 x g.
- Remettre en suspension dans 5 ml de milieu MESC et plaque 1 ml dans chaque boîte de culture revêtues de gélatine (5 plaques gélifiés / 1 MESC plaque) dans un milieu MESC. Culture à 37 ° C et 5% de CO 2 jusqu'à 80-85% de confluence soit atteinte.
- Laver mESCs avec suffisamment de PBS pour couvrir les cellules (8 ml par 10 cm plaque) pour 10 min par lavage, pour un total de trois lavages. Incuber en milieu sérique réduit pendant 24 heures à 37 ° C et 5% de CO 2.
NOTE: L'étape de lavage est importante pour éviter la contamination de FBS. Il est important de suivre le temps d'incubation 18,19. - Collecter MESC-CM dans un tube conique de 50 ml et on centrifuge pendant 20 min à 2500 x g. Recueillir la solution de surnageant (CM), après la centrifugation. Filtrer à travers une bouteille-top filtre de 0,2 um.
4. Effets de la souris les cellules souches embryonnaires conditionné moyenne (MESC-CM)
REMARQUE: Les effets de la MESC-CM ont été validés par plusieurs méthodes, telles queSA dosage β-gal, l'analyse du cycle cellulaire, et la qRT-PCR.
- SA β-gal Assay (figure 3A)
- HDFS de semences à une densité de 2 x 10 4 cellules par puits dans des plaques 6 puits dans un milieu HDF. Incuber une nuit à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Après une incubation d'une nuit, la moitié défausse du milieu HDF et ajouter MESC-CM et moyen de contrôle. Incuber pendant 72 heures à 37 ° C et 5% de CO 2. moyen de contrôle est dérivé d'un milieu exempt de sérum (sérum réduit Media) dans un plat revêtu de gélatine en l'absence de mESCs.
- Laver les cellules avec suffisamment de PBS pour couvrir les cellules (2 ml par plaque de 6 puits) pour 30 sec par lavage, pour un total de deux lavages. Ajouter 3,7% de paraformaldehyde (PFA) pour la fixation. Incuber pendant 5 min à température ambiante.
ATTENTION: (dangereux) paraformaldéhyde est une solution toxique et corrosif. Porter un vêtement de protection individuelle (par exemple, nitrile ou de latex des gants, une blouse et des lunettes) lors de la manipulation de la solution.Utilisez une hotte. - Aspirer la solution de fixation. Laver les cellules fixées avec du PBS deux fois, comme décrit à l'étape 4.1.3.
- Ajouter la solution SA β-gal coloration (1-2 ml par puits dans une plaque de 6 puits). Incuber pendant 17,5 heures à 37 ° C.
NOTE: Il ne doit pas être incubé dans un incubateur à CO2. - Aspirer la solution de coloration β-gal SA et laver les cellules avec du PBS deux fois, comme décrit à l'étape 4.1.3.
- Ajouter la solution éosine pour la contre-coloration. Incuber pendant 5 min à température ambiante. Laver les cellules avec du PBS deux fois, comme décrit à l'étape 4.1.3.
- cellules d'image à grossissement 100X en utilisant un microscope et capter la lumière des images en utilisant un appareil photo numérique fixé pour une analyse ultérieure.
NOTE: Le nombre total de cellules peut être compté d'une manière aveugle et le pourcentage de cellules positives bleu SA β-gal peut être calculée.
- Cellule d' analyse du cycle (figure 3B)
- HDFS de semences à une densité de8 x 10 4 cellules par puits dans une boîte de culture cellulaire de 6 cm dans un milieu HDF. Incuber une nuit à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Après une incubation d'une nuit, la moitié défausse du milieu HDF et ajouter MESC-CM et moyen de contrôle. Incuber pendant 24 heures à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Trypsiniser les cellules, comme décrit dans l'étape 3.1, et centrifuger pendant 5 min à 300 x g. Laver les cellules avec une solution PBS froide (PBS avec 0,5 mM CaCl2 et 2% de FBS, 1 ml par tube de 1,5 ml) deux fois et centrifuger pendant 3 min à 2500 x g. Remettre en suspension dans 100 pi de solution PBS froide.
- Fixer les cellules en supprimant 200 pi d'éthanol froid tout tourbillonnement. Conserver à 4 ° C pendant au moins 1 h.
- Laver les cellules avec une solution de PBS froid deux fois, comme décrit à l'étape 4.2.3.
- Remettre en suspension les cellules dans 250 ul de tampon de citrate de sodium (1,12%, pH 8,5) contenant 50 pg / ml de RNase. Incuber pendant 30 min à 37 ° C.
- Ajouter 250 pl de citrate de sodiumun tampon contenant 50 pg / ml d'iodure de propidium. Incuber pendant 20 min à température ambiante.
- Mesurer les cellules 10.000 dans chaque échantillon à l' aide de cytométrie de flux 20.
- qRT-PCR (figure 3C)
- HDFS de semences et d'ajouter MESC-CM, comme décrit dans les étapes 4.1.1 et 4.1.2.
- Isoler l'ARN total à partir des hdfs en utilisant un kit d'extraction d'ARN selon le protocole du fabricant. Quantifier l'ARN total extrait à l' aide d' un spectrophotomètre 21.
- Synthétiser l' ADNc en ajoutant 1 pg de l'ARN total à 20 ul d'un mélange réactionnel contenant des oligo (dT) et des amorces M-transcriptase inverse de MLV, selon le protocole du fabricant 20.
- Mesurer l'amplification de l'ADNc avec une machine de PCR en temps réel, en utilisant Green PCR Master Mix et des amorces spécifiques de gènes (Supplément tableau 1). Normaliser les données avec l'expression de GAPDH. Utilisez le protocole de PCR suivant: initial dedénaturation pendant 10 min à 95 ° C; 45 cycles de 15 sec à 95 ° C, 20 s à 55 ° C, et 35 sec à 72 ° C; et l'étape de la courbe de fusion pendant 15 sec à 95 ° C, 1 min à 60 ° C, 30 s à 95 ° C, et 5 sec à 60 ° C 15.
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Representative Results
A l' origine, mESCs sont maintenus sur un dispositif d' alimentation en milieu MEF MESC avec du FBS et d' autres suppléments (Figures 1A et 2A). CM ont été recueillies auprès de mESCs réduit Sérum médias sans couche d'alimentation, FBS, ou d' autres suppléments (figures 1B et 2B). Cette condition de culture nous permet de recueillir MESC spécifique milieu conditionné sans contamination potentielle par les facteurs de l'alimentation, FBS, ou d'autres suppléments. Le milieu de contrôle ont été recueillis dans les mêmes conditions de culture, sans mESCs.
mESCs montrent des morphologies différentes entre les deux milieux de culture: i) des conditions de culture normales Mesc (figure 2A) et ii) et sérum conditions de culture sans alimentation-(figure 2B). Les colonies Mesc ont augmenté sur une couche MEF et ont démontré une apparence ovale et brillant sous la normale MESC culture conditions (figure 2A). Au contraire, les mESCs dans le sérum et les conditions de culture sans cellules nourricières ont montré une morphologie aplatie et irrégulière (figure 2B).
La caractérisation fonctionnelle de MESC-CM a été obtenue par des méthodes de sénescence associée, tels que SA dosage β-gal (figure 3A), l' analyse du cycle cellulaire (figure 3B), et qPCR (figure 3C). Traitement des HDFS sénescentes avec MESC-CM a diminué le nombre de cellules β-gal-positives positives SA, qui est un indicateur de la sénescence cellulaire (figure 3A). L' analyse du cycle cellulaire a révélé que le traitement MESC-CM a considérablement augmenté le nombre de cellules dans le S et G2 / M en phase, alors qu'il a réduit le nombre de cellules dans la / phase G 1 G 0 (figure 3B). En outre, le traitement MESC-CM a diminué les taux d'expression du gène associé à la sénescence (namely, p53, p21, et p16) et le phénotype sécréteur (SASP) les niveaux d'expression de sénescence associée (IL-6).
Figure 1: Préparation et optimisation des MESC-CM. stratégie expérimentale pour la préparation et l'optimisation de CM sans sérum et sans alimentation. (A) Normale MESC condition de culture et (B) et de sérum MESC-CM condition de culture sans alimentation. C: contrôle du milieu sans FBS et MEF; CM: milieu conditionné sans FBS et MEF. Modifié avec la permission de Bae et al. 15. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Lumineux im terrainâges de mESCs. mESCs sous (A) des conditions normales et (B) et des conditions sans sérum nourricières. Les flèches jaunes indiquent cellules nourricières (MEF) dans des conditions de culture Mesc normales. Les barres d'échelle = 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Caractérisation de l'effet anti-vieillissement de la MESC-CM. L' activité (A) SA β-gal coloration et le pourcentage de cellules SA β-gal positives. (B) Analyse du cycle cellulaire par cytométrie en flux. (C) les niveaux d'expression de niveaux de sénescence associée à l' expression des gènes (p53, p21, p16) et de la sénescence associée au phénotype sécréteur (SASP) les niveaux d'expression (IL-6) par qRT-PCR. Les valeurs sont la moyenne ± écart-type. Les figures sont représentatives de trois expériences indépendantes. Des différences statistiquement significatives entre les groupes ont été identifiés par ANOVA à sens unique et le test post-hoc de Tukey. * P <0,05, ** p <0,01. Y = cellules non-sénescentes; S: cellules sénescentes; C: contrôle du milieu sans FBS et MEF; CM: milieu conditionné sans FBS et MEF. Les barres d'échelle = 10 pm. Modifié avec la permission de Bae et al. 15. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Pour le succès de la collecte de sérum et de MESC-CM sans alimentation, les suggestions suivantes devraient être prises en considération. Le facteur le plus important est l'utilisation précoce mESCs de passage pour la collecte des MESC-CM. Auparavant, il a été montré que le passage précoce MESC-CM a de meilleurs effets anti-âge par rapport à mESCs de passage tardif. Le nombre de passage mESCs a été rapporté à affecter leur potentiel de développement 16 et 17 pluripotence.
Bien que des recherches supplémentaires sont nécessaires pour analyser les facteurs spécifiques de la sécrétome MESC, qui induisent des effets anti-sénescence, nous pouvons conclure que actuellement MESC-CM est suffisante pour diminuer la sénescence au niveau cellulaire.
L'identification des facteurs sécrétoires spécifiques Mesc qui reprennent les cellules sénescentes retour aux jeunes cellules sera critique pour les études futures. Pour les analyses de haute qualité sur les molécules sécrétoires, comme réseau d'anticorps 15 und 'analyse sécrétome, l'étape de lavage au cours du processus de collecte moyen (étape 3) est critique. Si l'étape de lavage est pas correctement effectué, les molécules sécrétoires seront contaminées par du sérum (FBS) composants 18,19.
Le temps d'incubation de sérum et sans alimentation (24 h) est très important dans le processus de collecte moyen (étape 3), comme le temps d'incubation plus longue (plus de 24 heures) peut augmenter la possibilité d'autolyse cellulaire ou l'apoptose par la faim dans le sérum - et feeder- conditions appauvries 18,19. La condition de la culture ESC normale nécessite une couche d'alimentation pour la culture à long terme de cellules indifférenciées, comme le chargeur sécrète un grand nombre de molécules 22. La plaque revêtue de gélatine empêche la possibilité de contamination par les cellules nourricières.
Le MESC-CM, récolté dans des conditions de culture sans sérum et sans alimentation, a une capacité anti-sénescence dans HDFS sénescentes. Les effets anti-sénescence de mESC-CM a été démontrée par de multiples lectures de sénescence associées, telles que SA l'activité β-gal; un potentiel de prolifération accrue (analyse du cycle cellulaire); et la réduction p53, p21, p16 et IL-6 niveaux d'expression génique (Figure 3A - 3C).
Lorsque les cellules primaires humaines sont traitées avec MESC-CM, xéno-contamination serait une question cruciale pour l'application clinique. Par conséquent, une enquête sur les facteurs sécrétoires des CES humains ou CSPi serait une étude d'avenir important pour l'application clinique de CM dérivé d'origines humaines. La convergence d'une approche sans cellule basée sur un cellules souches et une étude anti-sénescence devrait élargir la compréhension actuelle des maladies sénescence associée, ce qui entraîne un meilleur aperçu des améliorations sur les approches thérapeutiques.
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Acknowledgments
Cette recherche a été soutenue par le programme de base de recherche en sciences (2013R1A1A2060930) et le Programme Medical Research Center (2015R1A5A2009124) par la National Research Foundation de Corée (NRF), financé par le ministère de la Science, les TIC et la planification future. Cette recherche est également soutenu par un démarrage Subvention de fonctionnement de The Hospital for Sick Children (HK Sung). Nous tenons à remercier Laura Barwell et Sarah JS Kim pour leur excellente aide à la rédaction de ce manuscrit et le Dr Andras Nagy pour fournir la ligne G4 MESC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | #11960-044 | |
| FBS | Invitrogen | #30044333 | 20%, ES cell quality |
| Penicillin and streptomycin | Invitrogen | #15140 | 50 units/ml penicillin and 50 mg/ml streptomycin |
| L-glutamine | Invitrogen | #25030 | 2 mM |
| Nonessential amino acids (NEAA) | Invitrogen | #11140 | 100 µM |
| β-mercaptoethanol | Sigma | #M3148 | 100 µM |
| Leukemia inhibitory factor | Millipore | #ESG1107 | 100 units/ml |
| OPTI-MEM | Invitrogen | #22600 | |
| X-gal | Sigma | #B4252 | 1 mg/ml |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | 3.70% |
| Dimethylformamide (DMF) | Sigma | #D4551 | |
| Potassium ferricyanide | Aldrich | #455946 | 5 mM |
| potassium ferrocyanide | Aldrich | #455989 | 5 mM |
| NaCl | Sigma | #S7653 | 150 mM |
| MgCl2 | Sigma | #M2393 | 2 mM |
| Mitomycin C | Sigma | #M4287 | 10 µg/ml |
| Propidium iodide | Sigma | #P4170 | 50 µg/ml |
| TRIzol | Ambion | #15596018 | |
| M-MLV reverse transcript-tase | Promega | #M170B | |
| Power SYBR Green PCR master mix | Applied Biosystems | #4367659 | |
| HDFs, NHDF-Ad-Der-Fibroblast | LONZA | #CC-2511 | |
| Bottle top filter | Corning | #430513 | 0.2 μm |
References
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