Introduction
La régulation de la croissance cellulaire et les réponses immunitaires de mort cellulaire est essentielle pour le rôle de la famille des facteurs de transcription de facteurs de régulation de l'interféron. IRF5 est soulignée comme étant cruciale pour la régulation des réponses immunitaires entre le type 1, une réponse inflammatoire et la promotion de type 2, une réparation tissulaire réponse immunitaire ciblage. IRF5 est la clé 1 dans le cancer, l' auto - immunité et 2, 3, 4, 5.
La souris étanche peau (Tss / +) est un modèle pour la fibrose tissulaire et la sclérodermie due à une mutation de duplication dans le gène de la fibrilline-1. Cette mutation se traduit par une peau étanche et une augmentation du tissu conjonctif. Ces souris développent une inflammation du myocarde, la fibrose et finalement une insuffisance cardiaque 5, 6, 7,> 8, 9. La sclérodermie est une maladie auto - immune affectant fibrotique environ 150.000 patients aux Etats-Unis 6. Les caractéristiques de cette maladie sont une fibrose d'organes internes , y compris le cœur 7, 8, 9, 10, 11.
La nature de l'étude a demandé la conception d'un peptide inhibiteur. L'approche du logiciel a été choisi sur une approche traditionnelle en utilisant un phage display. L'approche du logiciel est plus facile et moins consommatrice de temps. La banque de données RCSB est utilisé pour identifier les sites de liaison appropriés 12. Pour étudier l'interaction du peptide nouvellement conçu avec la protéine recombinante et de se concentrer sur les paramètres de liaison, une technique appelée interférométrie biocouche a été utilisée. Biocouche interférométrie est un techniq biocapteur baséue qui détermine l'affinité de liaison, d'association et de dissociation en utilisant un biocapteur et un échantillon de liaison. Le biocapteur peut être fluorescence, luminescence, radiométrique et colorimétriquement marqué. La mesure est basée sur l' addition ou l' épuisement de masse ressemblant à l' association et la dissociation 13, 14. Le but de cette étude était de comprendre le rôle de IRF5 dans l'inflammation du myocarde et de la fibrose. L'objectif était de mieux comprendre le rôle de IRF5 dans le développement de la fibrose tissulaire et la sclérodermie.
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Protocol
Cette étude a été réalisée en stricte conformité avec les recommandations du Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health. Le protocole a été approuvé par le Institutional Animal Care et utilisation Comité (Protocole: AUA # 1517). Toute recherche impliquant des souris a été réalisée en conformité avec la politique du PHS.
1. Conception de Decoy Peptide
- Trouver la structure 3D de la IRF5 et baser la conception sur elle. Concevoir un 17 mer, appelé IRF5D (ELDWDADDIRLQIDNPD), où aspartate (D) est remplacé par la serine (S) pour imiter la phosphorylation dans IRF5 à 421-438 (ELSWSADSIRLQISNPD). Analyse des groupes 3D sulfhydryles et les connaissances du mécanisme de IRF5 d'activation, à savoir, la serine phosphorylation, a suggéré qu'une stratégie de ciblage IRF5 était de générer un peptide leurre. Voir Figure 1. Pour identifier la meilleure région dans la structure 3D, utiliser un logiciel de modélisation moléculaire pour la conception de petits molecules et des peptides 15.
REMARQUE: L'étape critique dans ce procédé est la disponibilité de la structure 3D de la protéine cible et de ses sites de liaison possibles. La structure 3D de IRF5 représente avec précision comment se dimérise IRF5 après phosphorylation. La substitution de l'aspartate pour la serine ou la thréonine est sous-traitée. Le peptide est synthétisé séparément sans être lié à IRF5. - Répliquer la phospho-domaine simplement en substituant D pour S. Sur la base de la séquence d' origine (ELSWSADSIRLQISNPD, faire un nouveau IRF5S peptide avec la séquence d'acides aminés de Ac-ELDWDADDIRLQIDNPD-NH 2 (IRF5D).
2. interférométrie couche biologique (BLI)
NOTE: La purification pour IRF5 recombinant a été confiée. 16
- étiquette de biotine IRF5 dans un rapport molaire de 1: 1 de biotine au ligand avec un réactif de biotinylation incorporant un agent de liaison à longue chaîne. La longue liaison de la chaîne assurera une liga plus active et homogènesurface nd.
- Ajouter 1 mL de 2 mg / mL à IRF5 13 ul de 20 mM de réactif de biotine ou d'augmenter le volume si nécessaire. Incuber sur la glace pendant 2 h. Après marquage, utilisez une colonne de dessalage de spin pour éliminer le mélange de réaction de la protéine marquée.
- Incuber le ligand marqué à la biotine avec les biocapteurs pendant 15 min. Évitez de trop-étiquetage et d'ajuster le rapport 1: 1 molaire. Après marquage, utilisez une colonne de dessalage de spin pour éliminer le mélange de réaction de la protéine marquée.
- Incuber la biotine marquée biocapteurs IRF5 pendant 10 minutes à différentes concentrations de peptide IRF5 leurre. Les taux d'association et de dissociation ont été déterminées de la manière décrite 10, 17, 18.
3. Apoptose et prolifération Assays
- Essai de prolifération via bioréduction du tétrazolium
- Administrer IRF5D dilué dans du PBS (1 mg /kg / j, injecter un volume de 20 ul dans une souris de 20 g) par voie sous- cutanée avec une aiguille de calibre 27 par une technique de Scruffing standard ou par du PBS seul Tss / + et C57BL / 6J pendant 21 jours.
- Anesthésier les souris avec de l'isoflurane (5%) et d'effectuer une dislocation cervicale. Exciser le cœur en coupant ouvert la poitrine le long du sternum. Soulevez le coeur avec une pince et retirer le cœur.
- Lyser les coeurs avec un tampon de lyse protéique contenant 50 mM de Tris-HCl pH 7,4, 0,5% de NP-40, 250 mM de NaCl, 5 mM d' EDTA, 50 mM de NaF et 10 déterminer la concentration en protéine par dosage de Bradford 19.
- Manteau plaques à 96 puits avec C57BL / 6J matrice cardiaque isolé comme décrit dans la section 7. Diluer le PBS suspendu C57Bl 6J / matrice cardiaque à une concentration de 20 pg / ml et ajouter 30 ul du C57BL / 6J cardiaque à chaque puits. Laisser reposer une nuit à 37 ° C dans l'incubateur.
- cellules ombilicales humaines de culture de la veine à l'aide de 500 ml de endothéliale basale mdias avec 0,4% d'extrait de cerveau bovin, 0,1% d'acide ascorbique, 0,1% d'hydrocortisone, 0,1% de facteur de croissance épidermique humain, du sérum de foetus de bovin à 2% et de la gentamycine / amphotéricine B lui ajoute 0,1%. Culture des cellules sur des plaques à 96 puits à 5% de CO 2 et 95% l' air ambiant avec une densité de 25.000 cellules par puits. Stimuler avec des concentrations croissantes IRF5D entre 0-100 pg / ml dans le milieu (les volumes sont compris entre 0 et 50 ul / ml).
- Déterminer la prolifération cellulaire au bout de trois jours et évaluer les différences d'absorbance sur un lecteur de microplaques. La réaction est une bioréduction de MTS composé de tétrazolium. NADPH ou NADH est produit par déshydrogénases dans les cellules métaboliquement actives.
- Comme composé tétrazolium MTS est stocké congelé à -20 ° C, décongélation du composé lentement pendant environ 90 minutes à la température ambiante. Pipette 20 ul dans chaque puits d'une plaque de 96 puits et ajouter 100 ul de milieu de culture à elle. Incuber la plaque à 37 ° C pendant 1 à 4 h dans un humidified, 5% de CO 2 chambre.
- Mesurer l'absorbance à une longueur d'onde de 490 nm.
- Dosage de l' apoptose par l' activité de la caspase
NOTE: Le dispositif expérimental est le même que ci-dessus 3.1.1 à 3.1.5.- Stimuler les cellules avec des concentrations croissantes IRF5D entre 0 à 100 pg / ml dans le milieu.
- Ajouter la détection verte sur le substrat à l'CEs Caspase 3/7 et incuber pendant 30 min à 37 ° C. Évaluer la fluorescence sur un lecteur de microplaques simultanément avec une longueur d'onde d'absorption / émission de 502/530 nm. Exécutez les expériences en triple.
REMARQUE: L'agent fluorescent vert est un peptide à quatre acides aminés lié à un colorant de liaison d'acide nucléique. Ce réactif devient fluorescent lorsqu'il est clivé après caspase 3 et 7 activation. Cette fluorescence est mesurée. L'avantage est une réduction des étapes de lavage.
4. Évaluation de la IRF5 et ICAM-1 Expression dans la Heart
- Administrera IRF5D dilué dans du PBS (1 mg / kg / j, injecter un volume de 20 ul dans une souris de 20 g) par voie sous- cutanée avec une aiguille de calibre 27 par une technique de Scruffing standard ou par du PBS seul Tsk / + et C57BL / 6J fois par jour pendant 21 jours.
- Anesthésier les souris avec de l'isoflurane (5%) et d'effectuer une dislocation cervicale. Exciser le cœur en coupant ouvert la poitrine le long du sternum. Soulevez le coeur avec une pince et retirer le cœur.
- Lyser les coeurs avec un tampon de lyse protéique contenant 50 mM de Tris-HCl pH 7,4, 0,5% de NP-40, 250 mM de NaCl, 5 mM d' EDTA, 50 mM de NaF et 10 déterminer la concentration en protéine par dosage de Bradford 19.
- Effectuer un western blot sur des lysats de cœurs. Diluer les échantillons à 25 ug de protéine totale et un volume de 40 ul avec du tampon d'échantillon de Laemmli contenant 5% de mercaptoéthanol. Exécutez les échantillons sur un 4 - gel TGX 15% à 50 mV pendant 5 min. Augmenter la tension à 100 mV pendant 1 h jusqu'à ce que le front de colorant se épuise.
- Placer le gel dans 1 x tampon de transfert (Tris 25 mM, glycine 190 mM, methanol à 20%, ajuster le pH à 8,3 si nécessaire) et on incube pendant 10 - 15 min.
- Assembler le sandwich de transfert (éponge, filtre, gel, membrane de cellulose, filtre, éponge). Assurez-vous qu'aucune bulle sont piégés entre les deux. Le transfert doit se trouver sur la cathode et le gel sur l'anode. Transférer pendant 1 h dans une chambre froide à 100 mA.
- Le lendemain, rincez la tache, puis bloquer le fond dans 5% de lait écrémé en poudre pendant 30 min à température ambiante. Rincer la tache avec une solution saline tamponnée Tris contenant 5% de Tween trois fois pendant 5 minutes chacun.
- Incuber une nuit avec les anticorps primaires en utilisant des anticorps polyclonaux primaires à IRF5 ou ICAM-1. Diluent les anticorps dans une solution saline tamponnée au Tris à une dilution de 1: 1000.
- Diluer les anticorps secondaires dans une solution saline tamponnée Tris et incuber la tache pendant 1 h à température ambiante. âne Pour les anticorps secondaires, l'utilisation peroxydase de raifort conjugué anti-Ig de sourisG (1: 10000) et la peroxydase de raifort âne IgG anti-chèvre (1: 10.000), respectivement.
- Appliquer une chimioluminescence au transfert après le mélange des composants selon le protocole du fabricant et on incube pendant 3 minutes à la luminescence des bandes d'intérêt. Exposer le blot à un film X-ray. Utilisez ImageJ pour mesurer la densité. Normaliser les valeurs de densité des bandes de contrôle 10.
5. Évaluation du nombre de cellules inflammatoires après IRF5 Inhibition
- Administrera IRF5D dilué dans du PBS (1 mg / kg / j) par voie sous- cutanée avec une aiguille de calibre 27 par une technique de Scruffing standard ou par du PBS seul Tss / + et C57BL / 6J pendant 21 jours.
- Anesthésier les souris avec de l'isoflurane (5%) et d'effectuer une dislocation cervicale. Exciser le cœur en coupant ouvert la poitrine le long du sternum. Soulevez le coeur avec une pince et retirer le cœur. Snap congeler et conserver les coeurs excisés jusqu'à l'analyse.
- Monter les coeurs congelés sur tissdétenteurs ue appropriées pour le cryostat en cours d'utilisation. Couper 10 um d'épaisseur des coupes congelées sur un cryostat pour l'immunohistochimie.
- Fixer les sections congelées avec 1% de paraformaldehyde dans du tampon phosphate salin pendant 20 min à température ambiante. Perméabiliser les sections avec 0,5% de Triton X-100 dans du PBS pendant 5 min.
Attention: paraformaldéhyde est un cancérogène réglementé et doit être manipulé avec précaution. - Diluer anti-lapin CD64, un monocyte / macrophage marqueur 1: 200 dans du PBS. Appliquer sur les parties fixes et incuber pendant 30 min à 37 ° C.
- Laver les lames dans du PBS pendant 5 min trois fois à la température ambiante.
- Diluer anti-rat NIMP, primaire marqueur neutrophiles 1: 200 dans du PBS. Appliquer sur les parties fixes et incuber pendant 30 min à 37 ° C.
- Laver les lames pendant 5 min à trois reprises avec du PBS à la température ambiante.
- Diluer les anticorps secondaires anti-lapin Alexa 488 conjugué et anti-rat Alexa 488 conjugué 1: 200 dans du PBS.
- Appliquer anti-lapin Alexa 488 et conjugué anti-rat Alexa 488 anticorps secondaires conjugués aux sections pendant 30 min à 37 ° C en conséquence. Le volume d'anticorps varie en fonction de la taille de la section. Le montant devrait couvrir la section généreusement. Dans la plupart des cas, le volume est compris entre 100 et 200 ul.
- Utiliser 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) comme colorant nucléaire dans une dilution 1: 1000 dans du PBS. Ajouter 1 pi dans 1 ml de PBS et utiliser le DAPI dans la dernière étape de lavage. Ajouter un média de montage aqueux à une lamelle et mettez-la sur la diapositive.
- Analyser les sections marquées par fluorescence par microscopie confocale en utilisant un objectif d'huile 40X. Utiliser excitation des longueurs d'onde 488 et d'émission des longueurs d'onde supérieures à 530 nm pour CD64 et NIMP. DAPI a été excité à 360 nm et émise à 460 nm en bleu. Distinguer monocytes / macrophages et des neutrophiles (n = 10 images par anticorps, de 3 souris différent dans chaque groupe) par leur étiquetage différent et les compter. Exprimez les données que le nombre de cellules comptées.
6. Cellule vasodilatation dépendante après IRF5 Inhibition
- Anesthésier les souris C57BL / 6J témoins et / Tsk + souris avec et sans traitement avec un peptide de la kétamine (80 - 100 mg / kg) / xylazine (10 à 12,5 mg / kg) du mélange. Injecter le mélange kétamine / xylazine intrapéritonéale. Retiens la souris manuellement.
- Utilisez une jauge 25 ou plus petite aiguille. Insérez l'aiguille dans le quadrant inférieur droit de l'abdomen. Retirer le piston avant l'injection afin d'assurer que l'aiguille ne pénètre pas dans un vaisseau sanguin ou de l'intestin.
- Une fois un niveau suffisant de l'anesthésie a été atteinte, fixer la souris en position couchée, essuyez la fourrure avec de l'alcool imbibé tampon de gaze, et en utilisant une paire de ciseaux ouvrir la cavité thoracique et retirez le cœur.
NOTE: Exsanguination sera euthanasier la souris et faire une dissection plus facile en réduisant la pression dans le système vasculaire minimisant ainsi les saignements lors de la coupe des vaisseaux sanguins.- Ouvrez le usin de la peauga paire de ciseaux, découper de la partie latérale de la poitrine à la mâchoire avec soin à ne pas perturber les tissus sous-jacents vers l'avant de la mâchoire.
- Disséquer l'artère facialis en retirant le tissu mou autour d'elle.
- Attention: Ne pas blesser le navire ou un remorqueur sur facialis artère tout en gardant le tissu exposé baigné dans un tampon MOPS (2,0 mM CaCl 2 · 2H 2 O, EDTA 0,02, glucose 5,0 mM, KCl 4,7, 1,17 mM MgSO 4 · 7H 2 O, MOPS 3,0 mM, 145 mM de NaCl, 1,2 mM de NaH 2 PO 4 · H 2 O, de 2,0 mM d' acide pyruvique) pour éviter la dessiccation. Effectuer un zoom sous dissection microscope binoculaire stéréo (grossissement de 3,5X à 45X) et une source de lumière à fibre optique.
- Isoler l'artère facialis.
- Attrapez la proximal facialis à la première bifurcation et distale à l'endroit où l'artère est coupée. Couper l'artère de l'artère parente, l'artère carotide externe. Retirez le arterie de facialiss des souris témoins, Tsk + / souris avec et sans traitement IRF5D.
- Tout en maintenant l'artère dans la pince, couper les deux branches venant du facialis, permettant au navire d'être soulevé doucement alors que tout le tissu environnant de uncut peut être identifiée et séparée.
- Continuez ainsi jusqu'à ce que la bifurcation est atteinte coupant les deux artères fille pour libérer le navire. Il n'y a pas besoin de serrer les récipients avant la coupe due à la pression soulagée dans la vasculature d'enlever le coeur. Mettez le récipient dans un tampon MOPS tandis que l'autre artère facialis est disséquée et isolé.
- Cathétériser les vaisseaux en les attachant sur des pipettes en verre avec un diamètre de la borne de 125-175 um. Précharger les pipettes de verre et de réservoirs tampons avec un tampon MOPS.
Attention: éviter que des bulles d'air de se former dans les pipettes. - Attachez les navires sur les pipettes en utilisant des sutures ophtalmiques.
- Monter les chambres de navire sur un micr triocular inverséoscope avec une fixation de caméra vidéo. Exécuter la vidéo par le biais d'un système de mesure d'épaisseur vidéo pour les mesures sur l'écran des vaisseaux. 20
- Pressurisez dans un processus en deux étapes. Tout d'abord, les réservoirs remplis de MOPS à une hauteur au-dessus du récipient égale à la pression de 20 mm Hg, ouvrir manuellement les robinets d'isolement dans les lignes de réservoir vers la cuve. Inspecter le navire pour des signes de fuites autour des attaches le long de la longueur du navire. Deuxièmement, augmenter les réservoirs à 60 mmHg et réinspecter le navire.
- Une fois sous pression à 60 mmHg, permettre aux navires de s'équilibrer pendant 30 min.
- Afin d'évaluer la vasodilatation en réponse à l' acétylcholine (10 -7 à 10 -4 M) preconstrict le récipient à un diamètre de 50 - 75% de son diamètre maximal à l' aide de 1 à 3,0 x 10 -8 à 10 -7 M U46619. Après avoir laissé le récipient se stabiliser pendant 6 min, ajouter acétylcholine dans le bain en deux étapes min de durée de telle sorte que lales concentrations finales dans le bain est de 10 -7, 10 -6, 10 -5, 10 -4. Mesurer la vasodilatation dans les trois groupes.
7. Isolation of Cardiac Matrice Extracellulaire
- Anesthésier les souris C57BL / 6J témoins et / Tsk + souris avec et sans traitement peptidique avec de l'isoflurane (5%) et d'effectuer une dislocation cervicale. Exciser le cœur en coupant ouvert la poitrine le long du sternum. Soulevez le coeur avec une pince et retirer le cœur.
- Mettre les cœurs enlevés dans un bêcher et on ajoute 15 ml hypertonique 1% de dodécylsulfate de sodium (SDS). Agiter coeurs dans la solution à 1% de SDS pendant 18 heures à température ambiante pour briser les cellules en ajoutant une barre d'agitation à la solution SDS 1% et de mettre le bécher sur une plaque d'agitation.
Attention: Il faut savoir que la matrice extracellulaire se désintégrera si on les laisse trop longtemps dans une solution hypertonique. Inversement, si les cœurs ne sont pas agités assez longtemps dans une solution hypertonique, les cellules ne sera pas correctementdissoudra et il y aura des débris cellulaires laissée dans le bêcher. - Laver pendant 30 min dans 15 ml de 0,5% de Triton X-100. Laver ensuite pendant 15 minutes avec 15 ml de PBS. Decellularize chaque coeur individuellement.
- Snap-gel de la matrice extracellulaire dans l'azote liquide et Pulvérisation la matrice extracellulaire cardiaque congelé avec un mortier et un pilon pré-refroidi.
- Faire une suspension de la matrice en poudre dans du PBS contenant 1% d'antibiotique. Le volume ajouté dans la plupart des cas est de 300 pi. Soniquer la suspension pendant 30 - 60 s sur la glace sur le réglage élevé.
NOTE: Il est très important que l'échantillon maintient froid. Soyez conscient que la suspension est très visqueux en raison de la teneur en glycanes riches en protéines. - Déterminer la concentration de protéines en utilisant un dosage de Bradford.
REMARQUE: Assurez-vous que il est anti-biotiques et anti-fongique dans la suspension. Pénicilline / Streptomycine sont le plus couramment utilisé et recommandé.
8. Évaluation des translocation nucléaire par Immunohistochemistry
- Les plats de pelage et de diapositives utiliser une concentration finale de 20 pg / ml de la matrice extracellulaire cardiaque dans du PBS. Pipeter 500 ul de la solution cardiaque de la matrice extracellulaire dans une boîte de 100 mm pour le revêtement et 150 ul de la solution de matrice extracellulaire sur une lame finale.
- Inhibition IRF5 en ajoutant IRF5D dans un 50 pg concentration / mL pendant 24 h de rat myocytes cardiaques néonatales dans la culture. Laisser contrôler les cultures de myocytes non traitée.
- Évaluer le trafic de IRF5 du cytosol au noyau par immunofluorescence et analyse par microscopie confocale. Identifier l'étiquetage vert pour IRF5, identifiez le DAPI bleuissement pour le noyau
- Appliquer l'anticorps anti-IRF5 primaire. L'anticorps primaire a été utilisé dans une dilution 1: 200 dans du PBS. Incuber les lames pendant 30 min à 37 ° C et suivre trois étapes de lavage de 5 min. L'anticorps secondaire était de chèvre Alexa 488 marqué par un anticorps anti-IgG de souris.
- Diluer l'anticorps secondaire 1: 1000 dilution dans du PBS. Incuber l'anticorps secondaire pendant 30 min à 37 ° C. Atteindre coloration nucléaire avec DAPI. Diluer le DAPI 1: 1000 dans du PBS. Laver les lames un total de 3 fois pendant 5 minutes et ajouter DAPI à la troisième et dernière étape de lavage.
- Capturer le trafic en utilisant la microscopie confocale et mesure l' intensité de fluorescence dans les noyaux et le cytosol 10 comme décrit précédemment. Identifier l'étiquetage vert pour IRF5, identifiez le DAPI bleuissement pour le noyau. Les cellules qui présentent des noyaux bleus avec étiquetage vert en eux contiennent activés IRF5, qui traite du cytosol vers le noyau. étiquetage vert Lorsque IRF5 est pas activé se trouve dans le cytosol.
- Analyser les cellules marquées par fluorescence par microscopie confocale en utilisant un objectif d'huile 40X. Utilisez une longueur d'onde d'excitation de 488 nm et d'émission des longueurs d'onde supérieures à 530 nm pour IRF5. Utiliser une longueur d'onde d'excitation de 360 nm et une longueur d'onde d'émission de 460 nm pour la visualisation du DAPI.
- Effectuer une analyse de variance (ANOVA) pour des mesures répétées au sein et entre les groupes. Suivez ANOVA avec la modification de Bonferroni des étudiants t-test. Exprimez les données que l'erreur standard de la moyenne.
- Anesthésier les souris C57BL / 6J témoins et / Tsk + souris avec et sans traitement avec un peptide de la kétamine (80 - 100 mg / kg) / xylazine (10 à 12,5 mg / kg) du mélange. Injecter le mélange kétamine / xylazine intrapéritonéale. Retiens la souris manuellement.
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Representative Results
Les résultats ont démontré à la figure 1 montrent comment concevoir un peptide. La figure 1, en haut à gauche montre la zone (entre les 2 flèches jaunes, les acides aminés (aa) 425-436) dans IRF5 qui est phosphorylée par un certain nombre de kinases. Figure 1, en haut à droite, montre un ovale jaune où domaine phosphorylée de IRF5 lie. La structure dimérique de 3DSH a été mis en rotation pour observer une fente ou une vallée à la gauche de l'hélice 2 (aa303-312). Ceci est où le phospho-queue domaine de IRF5 est censé lier quand il est entièrement activé (ie, la sérine phosphorylée), la formation d' un homodimère et son état biologiquement actif assumé.
Sur la figure 2, l'activité de liaison mesurée par interférométrie biocouche est représentée. Déterminer que le leurre IRF5D peptide ne soit pas toxique, la prolifération et l'apoptose ont été évalués après le traitement de la caunes avec des concentrations croissantes de IRF5D (figure 3). Les expressions de ICAM-1, un marqueur inflammatoire et IRF5 ont été réduites après le traitement TSK + / souris avec IRF5D tel que déterminé par analyse Western Blot (figure 4). Le nombre de neutrophiles (NIMP) et CD64 ont été réduites , comme déterminé par immunohistochimie après le traitement avec IRF5D (figure 5). La fonction endothéliale a été améliorée dans les artères facialis de Tsk / + souris après IRF5D par rapport à Tsk / + souris sans traitement IRF5D (figure 6). Un plus grand nombre de noyaux positifs IRF5 dans les myocytes cultivées sur Tsk / + matrice cardiaque ont été visualisées par rapport à C57BL 6J / matrice cardiaque. Traitement des cultures avec IRF5D a abouti à la réduction du nombre de noyaux positifs IRF5 (figure 7).
Figure 1: Protein 3D Structure de IRF5. A) La figure en haut à gauche montre la région du peptide a été conçu. B) La région qui est phosphorylée mis en évidence par les deux flèches jaunes sont des acides aminés (aa) 425 - 436 en IRF5. C) Le panneau inférieur représente le complexe fonctionnel homodimère. Le chiffre homodimère est présenté pour faciliter la visualisation de la région où la queue domaine phosphorylée de IRF5 se lie pour former un homodimère. Ce chiffre a été publié antérieurement 21. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: interférométrie de IRF5D couche biologique. Cette figure montre la liaison de IRF5 à IRF5D évaluée par biolaye r interférométrie. Logiciel d'analyse a montré que IRF5 se lie à IRF5D avec un K d de 3,72 ± 0,75 x 10 -6 M (moyenne ± écart type, n = 3). Ce chiffre a été publié antérieurement 21. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: la prolifération cellulaire et l' apoptose. Ces graphiques à barres montrent que des concentrations croissantes de IRF5D ont aucune influence sur la prolifération cellulaire (à gauche) ou l'apoptose (à droite), et ne sont pas modifiés en augmentant les niveaux de IRF5D. Ce chiffre a été publié antérieurement 21 (moyenne ± écart type, p <0,05, n = 4).k "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: ICAM-1 et IRF5 Expression dans le coeur. IRF5 (B) expressions ICAM-1 (A) et ont diminué dans le myocarde de souris Tsk + après le traitement IRF5D tel que démontré par western blot. Les données ont été normalisées à la commande actine de chargement (moyenne ± écart type, p <0,05, n = 3). Ce chiffre a été publié antérieurement 21. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5:CD64 (A) et NIMP (B) Expression dans le coeur. Le nombre de monocytes / macrophages et les neutrophiles a été diminuée après traitement IRF5D tel que démontré par immunohistochimie (moyenne ± SD, * = p <0,05, C57BL / 6J par rapport à Tss / +; # = p <0,025, Tsk / + Tss vs / IRF5D + n = 3, 10 images par anticorps). Les flèches mettent en évidence les monocytes / macrophages (A) et (B) des neutrophiles. Les barres d'échelle sont 10 um. Ce chiffre a été publié antérieurement 21. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6: Cellule Fonction et vasodilatation. administration IRF5D améliorée acétylcholine induite par la vasodilatation des artères facialis de + souris / Tsk (moyenne &# 177; SD, p <0,05, n = 6). Ce chiffre a été publié antérieurement 21. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 7: IRF5 nucléaire translocation de IRF5 dans Cultured myocytes avec l' inhibition de la IRF5. IRF5 l'inhibition par IRF5D (50 pg / ml, 24 h) conduit à moins de noyaux positifs IRF5 dans les myocytes cultivés sur TSK / + matrice cardiaque et C57BL / 6J matrice cardiaque. Les flèches représentent IRF5 noyaux positifs (moyenne ± écart type, p <0,05, n = 3). La barre d'échelle est de 5 um. Ce chiffre a été publié antérieurement 21. S'il vous plaît cliquerk ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
L'objectif était de concevoir un inhibiteur de IRF5 pour élucider le rôle de IRF5 sur l'inflammation, la fibrose et la fonction vasculaire dans le cœur des Tsk / + souris. Les conclusions sont que IRF5D n'a pas induit la prolifération ou l'apoptose. En outre, l'inflammation a été réduite et la fonction vasculaire améliorée. Ces données suggèrent que IRF5 joue un rôle mécanistique important dans le développement de l'inflammation et de la fibrose dans le cœur de souris + / Tsk, et qu'il a le potentiel de servir de cible thérapeutique.
La première étape consistait à concevoir un inhibiteur. Quand un peptide est conçu, plusieurs points doivent être pris en considération: la longueur de la séquence, la structure secondaire, des résidus sensibles à l'oxydation, la composition d'acides aminés, l'amidation et le capsulage, les acides aminés dans la partie N-terminale et les acides aminés dans l'extrémité C-terminale, et un ligand de fixation. La longueur de la séquence idéale se situe entre 10 et 15 résidus pour assurer le meilleur rendement global, moins d'impuretés, et un coût réduit. Il est imporTant d'être au courant des structures secondaires comme la formation de feuillet bêta. formation de la feuille bêta peut entraîner un degré élevé de séquences supprimées. Évitez les résidus sujettes à l'oxydation qui peut conduire à des réactions secondaires qui peuvent avoir une incidence sur l'efficacité du peptide. Pour contrôler la solubilité, la synthèse et la purification, maintenir la composition des blocs de construction d'acides aminés pour le peptide en dessous de 50% d'acides aminés hydrophobes et veiller à ce qu'il y ait suffisamment de résidus chargés. N- et C-terminales doivent être choisis dans un état non chargé. Éviter le glutamate à l'extrémité N-terminale et éviter la cystéine, la proline et la glycine à l'extrémité C-terminale. Ajouter un espace entre le peptide et le ligand pour minimiser le pliage. Par conséquent, ils pourraient avoir besoin d'être masqué comme un amide sans frais.
la conception IRF5D était basée sur la structure 3D. A 17 mer, appelé IRF5D (ELDWDADDIRLQIDNPD) a été conçu, où aspartate (D) a été remplacé par la serine (S) pour imiter la phosphorylation dans IRF5 à 421-438 (ELSWSADSIRLQISNPD). Ceapproche est simple en raison de nouvelles technologies informatiques. L'inconvénient de cette technique est l'investissement initial dans le logiciel. Cependant, il y a des économies globales significatives en comparaison avec les coûts associés à la main - d'œuvre et les matériaux utilisés dans d' autres méthodes de conception d'inhibiteurs, comme l' affichage de phage 22. L'étape critique dans ce procédé est la disponibilité de la structure 3D de la protéine cible et de ses sites de liaison possibles. La limitation de la conception d'un inhibiteur est la possibilité qu'une mauvaise région est choisie et l'inhibiteur ne bloque pas la protéine désirée. L'autre possibilité est un blocage partiel de la protéine désirée.
Avec le peptide en main la mise au point se déplace à tester la toxicité du peptide leurre en mesurant la survie des cellules. Tout d'abord, IRF5D a été testée en utilisant des concentrations variables. IRF5D n'induit l'apoptose et ne favorise pas la prolifération même à des concentrations plus élevées. Les méthodes utilisées ici sont standard et de fournir des données fiables. La bioréduction de colorant tétrazolium a été utilisé pendant de nombreuses années 23. Cet essai a été choisie en raison de sa reproductibilité et la durée d'efficacité par rapport à d' autres méthodes, par exemple, en comptant les cellules manuellement qui prend beaucoup de temps. Utilisation de BrdU pour marquer les cellules proliférantes nécessite la radioactivité, qui est sensible, mais peut être dangereux. La bioréduction de coloration au tétrazolium est le temps efficace et ne nécessite pas de radioactivité. Les limites de la bioréduction de coloration au tétrazolium est répandue dans les études portant sur le potentiel oxydo-réducteur. Partout où le potentiel oxydo-réducteur se produit, les faux positifs sont plus fréquents 24.
L'isolement de la matrice extracellulaire a été acquise par dissolution de toutes les cellules du myocarde avec une solution hypertonique. Le protocole a été évolué à partir d' études utilisant un appareil de perfusion à un processus simple agitation 25. Le Duration a été évaluée de manière empirique en prenant des moments différents: 12, 14, 16, 18, 20 h. La matrice extracellulaire a été analysé pour les débris cellulaires après indique les différents temps 25. Les principaux écueils de décellularisation sont la contamination fongique et bactérienne. Il est conseillé d'utiliser des composés anti-fongiques et anti-microbiennes. Pour les plats de manteau, la matrice extracellulaire est pulvérisé et mis en suspension dans du PBS. En raison de la teneur élevée en matière élastique, l'échantillon ne se dissout pas complètement. Sonication sur les réglages d'intensité plus élevée sans chauffer l'échantillon est impératif. L'avantage d'utiliser une matrice extracellulaire par rapport aux autres agents d'enrobage est que la matrice extracellulaire est une fusion de protéines d' origine physiologique et elle relie le in vivo et des essais in vitro. Cette approche est plus physiologique que le revêtement avec un composé unique comme le collagène ou la fibronectine seule. Il donne également un aperçu de l'importance de la signalisation initiée par des changements dansla matrice extracellulaire. Une limitation de ce protocole est clairement la destruction de la matrice et l'enlèvement des composants importants de signalisation de la matrice. Il est impératif d'être prudent lorsque décellularisation la matrice.
L'utilisation de tissus intacts comme des navires isolés ouvre la possibilité d'étudier la vasodilatation in situ et avec un minimum d' interférences des enzymes. Cette méthode est la plus adéquate pour étudier la fonction endothéliale chez une variété d'animaux et de maladies. Duling a été le premier à décrire cette méthode dans les porcs. Les navires de porc sont profondes dans le tissu; d'où le papier décrit la fixation de la gélatine. Les premières études de vasodilatation utilisées artères carotides 26. Nous avons affiné la technique à utiliser facialis artères 27. artères sont plus facialis équivalente en taille à une artère de résistance de l'artère carotide. Une limitation de ce protocole est la fragilité du navire, qui doit être retiré requirin intactla pratique de g.
En résumé, le développement IRF5D nous a permis d'évaluer l'implication des IRF5 dans l'inflammation et la fibrose dans le cœur. Il en est résulté les données décrites dans la présente étude. IRF5D est un outil utile pour étudier les mécanismes de IRF5 dans diverses maladies, ainsi que suggère IRF5 comme une possible cible de médicament 28.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Triton X 100 | Sigma Aldrich | X100- 100ml | |
| Alexa 488-labeled goat anti-mouse IgG antibody | Thermo Fisher | A11001 | |
| Bardford reagent | Thermo Fisher | 23200 | Pierce |
| Biosensors | Forte-Bio | MR18-0009 | |
| CD64 (H-250) | Santa Cruz Biotechnologies | sc-15364 | |
| CellEvent Caspase-3/7 Substrate | Thermo Fisher/Life Technologies | C10427 | |
| CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay kit | Promega | G3580 | Promega |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fisher | D-1306 | 1:1,000 dilution in PBS |
| donkey anti rat Alexa 488 | Thermo Fisher | A-21208 | 1:1,000 dilution in PBS |
| ECL plus | GE healthcare/Amersham | RPN2133 | After a lot of trial and error we came back to this one |
| Eclipse TE 200-U microscope with EZ C1 laser scanning software | Nikon | ||
| goat anti rabbit Alexa 488 | Thermo Fisher | A-11008 | 1:1,000 dilution in PBS |
| HRP anti-goat | Santa Cruz Biotechnologies | sc-516086 | !:10,000 dilution in TBS |
| HRP donkey anti-mouse | Santa Cruz Biotechnologies | sc-2315 | 1:10,000 dilution in TBS |
| ICAM-1 antibody | Santa Cruz Biotechnologies | sc-1511 | 1:200 dilution in PBS |
| IRF5 antibody (H56) | Santa Cruz Biotechnologies | sc-98651 | |
| Micro plate reader Elx800 | Biotek | ||
| NIMP neutrophil marker | Santa Cruz Biotechnologies | sc-133821 | 1:200 dilution in PBS |
| Octet RED | Forte Bio | protein-protein binding | |
| Peptide design Medit SA software | RCSB.org | ||
| Recombinant IRF5 protein synthesis | TopGene Technologies | protein expression, synthesis service | |
| sodium dodecyl phosphate | Sigma Aldrich | 436143 | detergent |
| Ketamine | Pharmacy | Schedule III controlled substance, presciption required | |
| Xylazine | MedVet | ||
| 3.5X-45X Trinocular Dissecting Zoom Stereo Microscope with Gooseneck LED Lights | Am Scope | SKU: SM-1TSX-L6W | |
| Zeba Desalting Columns | Thermofisher | 2161515 | |
| Endothelial Basal Media EBM Bullet kit | Lonza | CC-3124 | kit contains growth supplemets |
| VIA-100K | Boeckeler Instruments | ||
| 4 - 15% TGX gel | Bio-Rad | 5671081 | |
| MedSuMo software | Medit, Palaiseau, France | ||
| Laemmli Buffer | BioRad |
References
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