Introduction
細胞増殖と細胞死の免疫応答の調節は、インターフェロン調節因子の転写因子ファミリーの役割の中心です。 IRF5は、タイプ1の間の免疫応答の調節、炎症促進応答および2型、免疫応答のターゲット組織修復のために重要であると強調表示されます。 IRF5癌1、及び自己免疫2、3、4、5のキーです。
タイト皮膚マウス（TSK / +）は、組織線維症とフィブリリン1遺伝子における重複変異に起因する強皮症のモデルです。タイト皮膚および結合組織の増加でこの変異は結果。これらのマウスは、心筋の炎症、線維化および最終的に心不全5、6、7を開発します> 8,9。強皮症は、米国6で約15万人の患者に影響を与える自己免疫線維性疾患です。この疾患の特徴は、心臓7、8、9、10、11を含む内臓の線維症です。
研究の性質は、阻害ペプチドの設計を要求しました。ソフトウェアアプローチは、ファージディスプレイを使用する従来のアプローチを介して選択しました。ソフトウェアのアプローチが容易になり、より少ない時間のかかるものです。 RCSBのデータバンクは、適切な結合部位12を同定するために使用されます。組換えタンパク質で新たに設計したペプチドの相互作用を研究し、結合パラメーターに焦点を当てて、干渉生物層と呼ばれる技術を使用しました。生物層の干渉は、バイオセンサベースのtechniqですバイオセンサーと結合サンプルを使用して結合親和性、会合及び解離を決定するUE。バイオセンサーは、蛍光、ルミネセンス、放射量および比色標識することができます。測定は、質量付加または枯渇が会合及び解離13、14に似ているに基づいています。本研究の目的は、心筋の炎症や線維症におけるIRF5の役割を理解することでした。目標は、組織線維症および強皮症の開発にIRF5の役割への洞察を得ることでした。
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Protocol
この研究は、米国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関するガイドの推奨事項に厳密に従って行きました。プロトコルは、施設内動物管理使用委員会（：AUAの＃1517プロトコル）によって承認されました。マウスを含むすべての研究はPHSポリシーに準拠して行きました。
デコイペプチドの1デザイン
- IRF5の3D構造を検索し、その上にデザインをベースにします。 17マーを設計し、421でIRF5にリン酸化を模倣するアスパラギン酸（D）がセリンに置換されIRF5D（ELDWDADDIRLQIDNPD）、（S）と呼ばれる - 438（ELSWSADSIRLQISNPD）。 3Dのスルフヒドリル基と活性化のIRF5のメカニズムの知識、 すなわち 、セリンのリン酸化の分析、IRF5を標的とする1戦略は、デコイペプチドを生成することが示唆されました。 図 1を参照してください。 3D構造で最高の領域を同定するために、小さなmoleculを設計するための分子モデリングソフトウェアを使用ESおよびペプチド15。
注：このプロセスにおける重要なステップは、標的タンパク質の立体構造の可用性およびその可能な結合部位です。 IRF5の三次元構造を正確にリン酸化した後、方法IRF5二量体化を表します。セリンまたはスレオニンのためのアスパラギン酸の置換が外部委託されています。ペプチドはIRF5にリンクされることなく、別々に合成されます。 - 単純に元の配列をもとにS.のためのDを代入することにより、リン酸化ドメインを複製（ELSWSADSIRLQISNPDは、交流- ELDWDADDIRLQIDNPD-NH 2（IRF5D）のアミノ酸配列を有する新しいペプチドIRF5Sを作ります。
2.生物層干渉（BLI）
注：組換えIRF5ための精製を外部委託しました。 16
- 長鎖リンカーを組み込んだビオチン化試薬を用いてリガンドにビオチンの1：1のモル比でビオチンラベルIRF5。長鎖リンカーは、より積極的かつ均質なLIGAを保証しますND面。
- 20 mMのビオチン試薬の13μLには2mg / mLのIRF5の1 mLを加えたり、必要に応じてボリュームを増加させます。氷上で2時間インキュベートします。標識後、標識されたタンパク質からの反応混合物を除去するための脱塩スピンカラムを使用します。
- 15分間のバイオセンサーとビオチン標識リガンドをインキュベートします。以上の標識を避け、1調整：1のモル比を。標識後、標識されたタンパク質からの反応混合物を除去するための脱塩スピンカラムを使用します。
- IRF5デコイペプチドの異なる濃度で10分間、ビオチン標識したIRF5バイオセンサーをインキュベートします。会合および解離速度は、18 17、10に記載のように決定しました。
3.アポトーシスおよび増殖アッセイ
- テトラゾリウムの生物還元を介した増殖アッセイ
- IRF5DをPBSで希釈した投与（1ミリグラム/kg /日は、21日間TSK / +及びC57BL / 6JマウスにPBSのみを標準scruffing技術によってまたはによって27ゲージ針で皮下）20グラムのマウスにボリューム20μLを注入します。
- イソフルラン（5％）をマウスに麻酔し、頚椎脱臼を行います。胸骨に沿って胸を開いて切断することによって心を切り出します。ピンセットで心臓を持ち上げて、心を取り除きます。
- 溶解の50mMのTris-HCl pH7.4中、0.5％NP-40、250ミリモルのNaCl、5mMのEDTA、50mMのNaFから10を含有するタンパク質溶解緩衝液で心臓およびBradfordアッセイ19によりタンパク質濃度を決定します。
- セクション7に記載のように単離したC57BL / 6J心臓マトリックスとコート96ウェルプレートを希釈PBSを20μg/ mLの濃度にC57BL / 6J心臓マトリックスを懸濁し、各ウェルにC57BL / 6J心臓の30μLを追加します。それはインキュベーター内で37℃で一晩を解決しましょう。
- 内皮基底mの500ミリリットルを用いて培養ヒト臍静脈細胞0.4％ウシ脳抽出物、0.1％アスコルビン酸、0.1％ヒドロコルチゾン、0.1％のヒト上皮増殖因子、2％のウシ胎児血清及びゲンタマイシン/アンホテリシンBが追加0.1％EDIA。文化ウェルあたり25,000細胞の密度で5％CO 2および95％の室内空気で96ウェルプレート上の細胞。 0の間IRF5Dの濃度を増加させて刺激する - メディアに100μg/ mLの（ボリュームが0および50μL/ mLの間でした）。
- 3日後、細胞増殖を決定し、マイクロプレートリーダーで吸光度の差を評価します。反応は、MTSテトラゾリウム化合物の生体内還元です。 NADPHまたはNADHは、代謝活性細胞内脱水素酵素によって産生されます。
- MTSテトラゾリウム化合物は、-20℃で凍結保存されているように、化合物を室温でゆっくりと約90分を解凍。ピペットで96ウェルプレートの各ウェルに20μL、およびそれに培養培地の100μLを追加します。 HUMIで1〜4時間、37℃でプレートをインキュベート、5％CO 2チャンバdified。
- 490ナノメートルの波長で吸光度を読みます。
- カスパーゼ活性を介したアポトーシスアッセイ
注：実験の設定は3.1.5に3.1.1上記と同様です。- 培地に100μg/ mLの - 0〜IRF5Dの濃度を増加させて細胞を刺激します。
- 電気部品へのカスパーゼ3/7基質に緑色の検出を追加し、37℃で30分間静置します。 530分の502 nmでの吸収/発光波長と同時に、マイクロプレートリーダーでの蛍光を評価します。三重での実験を実行します。
注：緑色蛍光剤は、核酸結合色素に結合した4つのアミノ酸ペプチドです。カスパーゼ3および7の活性化後に切断すると、この試薬は、蛍光性となります。この蛍光が測定されます。利点は、洗浄ステップの減少です。
聞けにおけるIRF5およびICAM-1の発現の4評価トン
- 標準scruffing技術によって単独TSK / +及びC57BL / 6JマウスにPBSで1回によって、27ゲージの針で皮下（20グラムのマウスにボリューム20μLを注入し、1ミリグラム/ kg /日）をPBSで希釈したIRF5Dを管理21日間一日あたり。
- イソフルラン（5％）をマウスに麻酔し、頚椎脱臼を行います。胸骨に沿って胸を開いて切断することによって心を切り出します。ピンセットで心臓を持ち上げて、心を取り除きます。
- 溶解の50mMのTris-HCl pH7.4中、0.5％NP-40、250ミリモルのNaCl、5mMのEDTA、50mMのNaFから10を含有するタンパク質溶解緩衝液で心臓およびBradfordアッセイ19によりタンパク質濃度を決定します。
- 心の溶解物のウエスタンブロットを実行します。 25μgの総タンパク質および5％メルカプトエタノールを含むLaemmliサンプルバッファーで40μLの容量にサンプルを希釈します。 5分間、50 mVの15％TGXゲル - 4上でサンプルを実行します。色素の先端がなくなるまで1時間100 mVのに電圧を上げます。
- 1×転写バッファー（25 mMトリス、190 mMグリシン、20％メタノール、必要に応じて8.3にpHを調整）にゲルを置き、10インキュベート - 15分。
- 転送サンドイッチ（スポンジ、フィルター、ゲル、セルロース膜、フィルター、スポンジ）を組み立てます。気泡が間にトラップされないことを確認してください。ブロットは、陰極と陽極でのゲルにする必要があります。 100ミリアンペアでの低温室で1時間移します。
- 翌日、ブロットを洗浄した後、室温で30分間、5％脱脂粉乳で背景をブロックします。トリスでブロットをすすぎ5分ごとに5％のTween 3回を含む緩衝生理食塩水。
- IRF5またはICAM-1に対する一次ポリクローナル抗体を用いて、一次抗体で一晩インキュベートします。千希釈：トリス中の抗体が1に緩衝生理食塩水で希釈します。
- トリス二次抗体は、緩衝生理食塩水で希釈し、室温で1時間ブロットをインキュベートします。二次抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ロバ抗マウスIgを使用G（1：10,000）および西洋ワサビペルオキシダーゼロバ抗ヤギIgG（1：10,000）、それぞれ。
- 製造業者のプロトコルに従って成分を混合した後、ブロットを化学発光を適用し、興味のあるバンドを発光さ3分間インキュベートします。 X線フィルムにブロットを公開します。密度を測定するためのImageJを使用してください。対照バンド10に濃度値を正規化します。
IRF5阻害後の炎症性細胞数の5評価
- 21日間の標準scruffing技術により単独TSK / +及びC57BL / 6JマウスにPBSにより27ゲージの針で皮下にPBSで希釈しIRF5Dを管理する（1ミリグラム/ kg /日）。
- イソフルラン（5％）をマウスに麻酔し、頚椎脱臼を行います。胸骨に沿って胸を開いて切断することによって心を切り出します。ピンセットで心臓を持ち上げて、心を取り除きます。スナップ凍結し、分析まで切除した心を格納します。
- TISS上で凍結心をマウント使用中のクライオスタットへの適切なUEホルダー。免疫組織化学のためのクリオスタットで厚さ10μmの凍結切片をカットします。
- 室温で20分間、リン酸緩衝生理食塩水で1％パラホルムアルデヒドで凍結切片を修正しました。 5分間、PBS中0.5％のTriton-X 100でセクションを透過。
注意：パラホルムアルデヒドが規制発がん性物質であり、取り扱いに注意する必要があります。 - 抗ウサギCD64、単球/マクロファージマーカー1の希釈：200のPBSで。固定部に適用し、37℃で30分間インキュベートします。
- 室温で5分間、PBSで3回スライドを洗浄します。
- PBSで200：抗ラットNIMP、一次好中球マーカー1を希釈します。固定部に適用し、37℃で30分間インキュベートします。
- 室温で5分間、PBSで3回スライドを洗浄します。
- PBSで200：抗ウサギアレクサ488コンジュゲートおよび抗ラットのAlexa 488が1を結合二次抗体を希釈します。
- 抗ウサギアレクサ48を適用します従って、37℃で30分間セクション8コンジュゲートおよび抗ラットアレクサ488コンジュゲート二次抗体。抗体の量は、区間の大きさに応じて変化します。量は寛大セクションをカバーする必要があります。ほとんどの場合、容量は100と200μLの間です。
- PBS 1,000希釈：1で核染色として4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）を使用します。 1 mLのPBSに1μLを追加し、最後の洗浄工程において、DAPIを使用しています。カバースリップに水性マウントメディアを追加し、スライド上にそれを置きます。
- 40Xの油浸対物レンズを用いた共焦点顕微鏡により蛍光標識されたセクションを分析します。励起波長488より大きい530nmでの発光波長は、CD64とNIMPのために使用します。 DAPIは、360 nmので励起し、青で460 nmで放出されました。単球/マクロファージおよび好中球を区別（各群においてn = 3匹の異なるマウスから抗体当たり10画像、）それらの異なる標識により、それらを数えます。計数した細胞数などのデータを表現します。
IRF5阻害後の6細胞依存性血管拡張
- （ - 100ミリグラム/キログラム80）/キシラジン（10から12.5ミリグラム/キログラム）の混合物とし、ケタミンを有するペプチド治療せずにC57BL / 6J対照マウスおよびTSK / +マウスを麻酔。腹腔内ケタミン/キシラジン混合物を注入します。手動でマウスを抑えます。
- 25ゲージ以下の針を使用してください。腹部の右下の象限に針を挿入します。針が血管や腸に入らないことを確実にするために、注射前にプランジャーを撤回。
- 一旦麻酔の十分なレベルが胸腔を開き、心を取り除くアルコールに浸したガーゼパッドで毛皮を拭く、仰臥位でマウスを固定し、達し、ハサミを使用しています。
注：瀉血は、マウスを安楽死させると血管を切断する際に出血を最小限に抑え、したがって血管系内の圧力を緩和することにより、容易に解剖を行います。- 皮膚のusinを開きますあごの前面に向かって下にある組織を邪魔しないよう注意して顎骨に胸の横から切るハサミのGAのペア、。
- その周囲の軟組織を除去することにより、顔面動脈を解剖。
- 注意：MOPS緩衝液（2.0 mMののCaCl 2・2H 2 O、0.02 mMのEDTA、5.0 mMグルコース、4.7のKCl、1.17 mMの硫酸マグネシウム4・7H 2を浴び露出した組織を維持しながら顔面動脈に血管や綱引きを傷つけないでください。 O、3.0 mMのMOPS、145mMの塩化ナトリウム、1.2mMののNaH 2 PO 4・H 2 O、2.0 mMのピルビン酸）は、乾燥を防止します。両眼ステレオズーム解剖顕微鏡（45Xへ3.5Xの倍率）と光ファイバ光源の下で実行します。
- 顔面動脈を分離します。
- 動脈が切断される場所への最初の分岐点と遠位に顔面の近位をつかみます。親動脈、外頸動脈からの動脈をカットします。顔面のarterieを削除しますととIRF5D処理なしの対照マウス、TSK / +マウスからの秒。
- まだ鉗子で動脈を保持しながら、二つのブランチがどのノーカット周囲の組織を識別し、切断することができるが、容器を軽く持ち上げることができるように、顔面をオフに来てカット。
- 分岐部が血管を解放するために、両方の娘動脈を切断達するまでこのように続けます。心を取り除くから血管系にほっと圧力に起因切断する前に血管をクランプする必要はありません。他の顔面動脈を切開して孤立している間にMOPS緩衝液中に容器を置きます。
- 175ミクロン - 125の端子の直径を有するガラスピペットの上にそれらを結びつけることによって、血管にカニューレを挿入。 MOPS緩衝液を用いてガラスピペットおよびバッファ貯水池をプリロード。
注意：ピペット内に気泡が生じないように。 - 眼科用縫合糸を使用してピペットに血管を接続します。
- 反転triocular MICRに容器室をマウントビデオカメラアタッチメントとOSCOPE。血管の画面上での測定のためのビデオキャリパー測定システムを介してビデオを実行します。 20
- 二段階プロセスでそれらを加圧します。まず、20 mmHgの圧力に等しい容器上の高さでのMOPS-満たされた貯水池で、手動で容器に溜めラインでストップコックバルブを開きます。ネクタイの周りや血管の長さに沿って漏れるの兆候が血管を検査します。第二に、60 mmHgのに貯水池を高め、血管を再検査。
- 60 mmHgで加圧されると、血管が30分間平衡化することができます。
- 3.0×10 -8 ~10 -7 MのU46619 - 1を使用して、その最大直径の75％ -アセチルコリン（10 -7 M〜10 -4）に応答して血管拡張を評価するために、直径50を容器preconstrict。容器6分間安定化させた後、例えば、その2分の持続時間ステップで浴にアセチルコリンを追加浴中の最終濃度は10 -7、10 -6、10 -5、10 -4です。全3群で血管拡張を測定します。
心臓細胞外マトリックスの7の単離
- し、イソフルラン（5％）を有するペプチド処理なしC57BL / 6J対照マウスおよびTSK / +マウスを麻酔し、頚椎脱臼を行います。胸骨に沿って胸を開いて切断することによって心を切り出します。ピンセットで心臓を持ち上げて、心を取り除きます。
- ビーカーに取り除か心を入れて、15 mLの高張1％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を追加します。 1％SDS溶液に撹拌棒を追加し、撹拌プレート上でビーカーを置くことによって、細胞を破壊するために、室温で18時間、1％SDS溶液中で心を攪拌します。
注意：高張液中に長すぎる放置しておくと、細胞外マトリックスが崩壊することに注意してください。心が高張液中に十分な長攪拌されていない場合は逆に、その後、細胞は正常ではないでしょう溶解し、ビーカーに残った細胞破片が存在することになります。 - 15 mLの0.5％トリトンX-100中で30分間洗浄します。その後、15 mLのPBSで15分間洗浄します。個々の心を脱細胞化。
- 液体窒素中で細胞外マトリックスをスナップ凍結し、あらかじめ冷却した乳鉢と乳棒で凍結心臓の細胞外マトリックスを粉末化。
- 1％の抗生物質を含有するPBS中で粉砕マトリックスの停止を確認します。ほとんどの場合、追加されたボリュームは300μLです。高い設定に氷上で60秒 - 30用のサスペンションを超音波処理。
注：これは、サンプルは冷たい保つことが非常に重要です。サスペンションは高いタンパク質のグリカン含有量に非常に粘性であることに注意してください。 - ブラッドフォードアッセイを用いてタンパク質濃度を決定します。
注：懸濁液中の抗生物的および抗真菌が存在することを確認してください。ペニシリン/ストレプトマイシンは、最も一般的に使用され、推奨されています。
Immunohistochemistによって核移行の8評価RY
- コートディッシュとスライドにPBSで心臓の細胞外マトリックスの20μg/ mlの最終濃度を使用します。心臓の細胞外マトリックスコーティング100 mmディッシュへの溶液とスライド上に、最終的な細胞外マトリックス溶液の150μLのピペットで500μL。
- 培養中の新生児心筋細胞をラット24時間50μg/ mlの濃度でIRF5Dを追加することにより、IRF5を阻害します。未処理の対照筋細胞培養を残します。
- 免疫蛍光法を用いて、核に細胞質ゾルからIRF5の人身売買を評価し、共焦点顕微鏡により分析します。核ブルーDAPI染色を識別、IRF5のための緑の標識を識別
- 一次抗IRF5抗体を適用します。 PBSで200倍希釈一次抗体は、1で使用しました。 37℃で30分間、スライドをインキュベートし、3 5分間の洗浄工程で従ってください。二次抗体は、アレクサ488標識ヤギ抗マウスIgG抗体でした。
- 希釈した二次抗体1：1,000のジPBS中リューション。 37℃で30分間、二次抗体をインキュベートします。 DAPIで核染色を達成。 PBSで千：DAPI 1に希釈します。スライドを5分間、3回の合計を洗浄し、第三と最後の洗浄工程にDAPIを追加します。
- 以前に10を説明したように、核と細胞質ゾルに、共焦点顕微鏡と測定蛍光強度を使用して人身売買をキャプチャします。 IRF5のための緑の標識を識別し、核の青DAPI染色を識別します。それらの中に緑の標識と青の核を示す細胞は、核に細胞質ゾルから人身売買活性化さIRF5を、含まれています。 IRF5が活性化されていない緑色の標識は、細胞質ゾル中に発見されました。
- 40Xの油浸対物レンズを用いた共焦点顕微鏡により蛍光標識した細胞を分析します。 IRF5のためのより大きい530nmでの488 nmおよび発光波長の励起波長を使用してください。 360nmの励起波長およびDAPIの可視化のため460nmでの発光波長を使用してください。
- 内およびグループ間の反復測定のために、分散分析（ANOVA）を実行します。スチューデントのt検定のボンフェローニの修正を加えてANOVAに従ってください。平均の標準誤差としてデータを表現します。
- （ - 100ミリグラム/キログラム80）/キシラジン（10から12.5ミリグラム/キログラム）の混合物とし、ケタミンを有するペプチド治療せずにC57BL / 6J対照マウスおよびTSK / +マウスを麻酔。腹腔内ケタミン/キシラジン混合物を注入します。手動でマウスを抑えます。
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Representative Results
図1で実証結果は、ペプチドを設計する方法を示しています。 図1、左上には、多くのキナーゼによってリン酸化されるIRF5中の領域（2黄色の矢印の間、アミノ酸（AA）425から436）を示しています。 図1、右上は、IRF5のリン酸化されたドメインが結合黄色の楕円形を示しています。 3DSHの二量体構造は、ヘリックス2（aa303-312）の左に裂け目や谷を観察するために回転させました。 IRF5のホスホテイルドメインはホモ二量体とその仮定生物学的に活性な状態を形成し、（ すなわち 、セリンのリン酸化）、それが完全に活性化されたときにバインドすることになっている場所です。
図2において、生物層干渉法によって測定された結合活性が示されています。デコイペプチドIRF5Dは毒性がないことを決定するために、増殖およびアポトーシスは、cを処理した後に評価しましたIRF5Dの濃度を増加させた （ 図3）とells。 ICAM-1、炎症マーカー、及びIRF5式は、ウェスタンブロット分析（ 図4）によって決定されるようIRF5DでTSK / +マウスを処置した後に減少しました。 IRF5Dでの処理（ 図5）の後に、免疫組織化学によって決定されるような、好中球（NIMP）及びCD64の数が減少しました。内皮機能はIRF5D処理（ 図6）することなく、TSK / +マウスと比較しIRF5D後のTSK / +マウスの顔面動脈に向上しました。 TSK / +心臓マトリックス上で培養筋細胞におけるIRF5陽性核のより多くの数は、C57BL / 6J心臓マトリックスに比べて可視化しました。 IRF5Dと文化の治療はIRF5陽性核（ 図7）の数の減少をもたらしました。
図1：3D タンパク質StructurIRF5の電子。 A）左上の図は、ペプチドがために設計された地域を示しています。 B）2の黄色の矢印で強調表示にリン酸化されている領域は、アミノ酸（AAある）425から436 IRF5インチC）下のパネルは、ホモ二量体の機能的複合体を示しています。ホモ二量体図はIRF5のリン酸化テイルドメインはホモ二量体を形成するために結合した領域の見易さのために提示されています。この図は、以前に21を公開されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：IRF5D の生物層干渉。この図は、biolayeによって評価IRF5DするIRF5の結合を示しています rの干渉。解析ソフトウェアはIRF5は3.72±0.75×10 -6 MのK dでIRF5Dに結合することが示された（平均値±SDを、n = 3）でした。この図は、以前に21を公開されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3： 細胞増殖とアポトーシス。これらの棒グラフはIRF5D濃度の増加は、細胞増殖（左）またはアポトーシス（右側）に影響を与えないことを示し、そしてIRF5Dのレベルを増加させることによって変化しませんでした。この図は、以前は21（平均±SD、P <0.05、N = 4）公開されています。K "> この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4： ハートICAM-1およびIRF5式。 ICAM-1（A）及びIRF5（B）式は、ウェスタンブロットによって実証されるようIRF5D処理後TSK +マウスの心筋に減少しました。データは、アクチンをローディング対照に対して正規化した（、SD、p <0.05の平均値±n = 3）でした。この図は、以前に21を公開されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5：CD64（A）とNIMP（B）ハートで表現。免疫組織化学によって示されるように、単球/マクロファージおよび好中球の数がIRF5D処理後に減少した（* = p <0.05、C57BL / 6J TSK対/ +、平均±SD; / TSK対0.025、TSK / +＃= P < + + IRF5Dあり; n = 3、抗体当たり10画像）。矢印は、単球/マクロファージ（A）および好中球（B）をハイライト。スケールバーは10μmです。この図は、以前に21を公開されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図6：細胞機能および血管拡張。 IRF5D投与は、TSK / +マウスの顔面動脈のアセチルコリン誘発される血管拡張を改善した（＆意味します＃177; SD、P <0.05、N = 6）。この図は、以前に21を公開されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図7：IRF5 阻害と培養筋細胞におけるIRF5のIRF5核移行。 IRF5DによってIRF5阻害（50μg/ mlの、24時間）は、TSK / +心臓マトリックスおよびC57BL / 6J心臓マトリックス上で培養筋細胞に少ないIRF5陽性核につながります。矢印はIRF5陽性核描いている（平均±SD、P <0.05を、n = 3）でした。スケールバーは5μmです。この図は、以前に21を公開されています。 CLICしてくださいこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをk個。
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Discussion
目標は、TSK / +マウスの心臓の炎症、線維症、および血管機能にIRF5の役割を解明するためにIRF5阻害剤を設計することでした。知見はIRF5Dの増殖またはアポトーシスを誘導しなかったことです。また、炎症を低減し、血管機能を改善しました。これらのデータは、IRF5はTSK / +マウスの中心部に炎症や線維症の発症に重要な機構的な役割を果たしていることを示唆し、それが治療標的として機能する可能性を持っていること。
最初のステップは、阻害剤を設計することでした。ペプチドを設計する際に、いくつかの点を考慮しなければならない：配列の長さ、二次構造、酸化しやすい残基、アミノ酸組成、アミド化およびキャッピング、N末端およびアミノ酸でのアミノ酸C末端で、そして、リガンドアタッチメント。理想的な配列の長さは最高の全体的な収率、より少ない不純物、及び低コスト化を確実にするために、10〜15残基の間です。それはimporですベータシート形成のような二次構造の注意すべきタント。 βシート形成が削除された配列の高度をもたらすことができます。ペプチドの有効性に影響を与える可能性が副反応につながることができ、酸化を受けやすい残基を避けてください。溶解性、合成および精製を制御するために、50％の疎水性アミノ酸以下のペプチドのアミノ酸ビルディングブロックの組成を維持し、十分な荷電残基が存在することを確認。 N末端およびC末端は、荷電していない状態で選択する必要があります。 N末端にグルタミン酸を避け、C末端にシステイン、プロリン、およびグリシンを避けることができます。折りたたみを最小限にするペプチドとリガンドとの間にスペーサーを追加します。したがって、彼らは無償でアミドとしてマスクが必要になることがあります。
IRF5Dデザインは三次元構造に基づいていました。 17マーは、アスパラギン酸（D）が421から438（ELSWSADSIRLQISNPD）でIRF5にリン酸化を模倣するために、セリン（S）に置換された場所IRF5D（ELDWDADDIRLQIDNPD）は、設計されたと呼ばれます。このアプローチはまっすぐ進む新たなコンピュータ技術によるものです。この技術の欠点は、ソフトウェアの初期投資です。しかし、労働およびファージディスプレイ22のように、他の阻害剤の設計方法に使用される材料に関連するコストと比較して有意な全体的な節約があります。このプロセスにおける重要なステップは、標的タンパク質とその可能な結合部位の三次元構造が入手可能です。阻害剤の設計の限界は、間違った領域が選択され、阻害剤は、所望のタンパク質をブロックしていないことが可能です。他の可能性は、所望のタンパク質の部分的なブロックです。
手にペプチドとフォーカスは、細胞の生存を測定することにより、デコイペプチドの毒性をテストするに移動します。まず、IRF5Dは様々な濃度を用いて試験しました。 IRF5Dは、アポトーシスを誘発しないと、より高い濃度での増殖を促進しません。ここで使用される方法は、STAですndardとは、信頼性の高いデータを提供します。テトラゾリウム色素生体内還元は、長年23のために使用されてきました。このアッセイは、非常に時間がかかるとする手動で細胞を計数し、他の方法、 例えば、と比較して、その再現性および時間効果の選択されました。増殖細胞を標識するためにBrdUを使用すると小文字が区別された放射能を、必要とするが、危険なことができます。テトラゾリウム色素の生体内還元は、時間効率的であり、放射能を必要としません。テトラゾリウム色素の生体内還元の制限は、オキシド - 還元電位を含む研究で流行しています。オキシド-還元電位が発生した場合はいつでも、偽陽性が24より頻繁です。
細胞外マトリックスの単離は、高張液ですべての心筋細胞を溶解することによって買収されました。プロトコルは、簡単な攪拌プロセス25に灌流装置を用いた研究から発展しました。 duratイオンは、異なる時間点を取ることによって経験的に評価された：12、14、16、18、20時間。細胞外マトリックスは、異なる時点25の後に細胞の破片を分析しました。脱細胞化の主な落とし穴は、真菌や細菌汚染されています。抗真菌と抗菌化合物を使用することをお勧めします。コート皿に、細胞外マトリックスは、粉末化され、PBSに懸濁しました。弾性材料の含有量が高いために、サンプルが完全に溶解しません。サンプルを加熱することなく、より高い強度設定上の超音波処理は不可欠です。他のコーティング剤の上に細胞外マトリックスを使用する利点は、細胞外マトリックスのタンパク質の融合は生理的に発生し、それがインビボおよびインビトロアッセイで接続することです。このアプローチは、コラーゲン単独またはフィブロネクチンのような単一の化合物でコーティングするよりも生理的です。それはまたの変化によって開始されるシグナル伝達の重要性への洞察を提供します細胞外マトリックス。このプロトコルの制限は、明らかに、マトリックスの破壊であり、マトリックスからの重要なシグナル伝達成分を除去します。行列を脱細胞化する際に注意が肝要です。
無傷の組織のような単離された容器の使用は、 その場で酵素の最小限の干渉で血管拡張を検討する可能性を開きます。この方法は、動物および種々の疾患における内皮機能を研究するのが最も適切です。 Dulingは、ブタにおいて、この方法を最初に記載しました。豚における血管は、組織の深部です。したがって、紙は、ゼラチンの固定を説明しました。血管拡張における初期の研究は、頸動脈26を使用します。私たちは、顔面動脈27を使用するための技術を洗練しました。顔面動脈は頸動脈よりも抵抗動脈のサイズにより同等です。このプロトコルの制限はそのままrequirinを除去する必要がある血管の脆弱性でありますグラムの練習。
要約すると、開発IRF5Dは、心臓の炎症および線維症におけるIRF5の関与を評価することができました。これは、本研究で示されたデータが得られました。 IRF5Dは、可能な創薬ターゲット28としてIRF5を示唆しているだけでなく、様々な疾患におけるIRF5のメカニズムを研究するための有用なツールです。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Triton X 100 | Sigma Aldrich | X100- 100ml | |
| Alexa 488-labeled goat anti-mouse IgG antibody | Thermo Fisher | A11001 | |
| Bardford reagent | Thermo Fisher | 23200 | Pierce |
| Biosensors | Forte-Bio | MR18-0009 | |
| CD64 (H-250) | Santa Cruz Biotechnologies | sc-15364 | |
| CellEvent Caspase-3/7 Substrate | Thermo Fisher/Life Technologies | C10427 | |
| CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay kit | Promega | G3580 | Promega |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fisher | D-1306 | 1:1,000 dilution in PBS |
| donkey anti rat Alexa 488 | Thermo Fisher | A-21208 | 1:1,000 dilution in PBS |
| ECL plus | GE healthcare/Amersham | RPN2133 | After a lot of trial and error we came back to this one |
| Eclipse TE 200-U microscope with EZ C1 laser scanning software | Nikon | ||
| goat anti rabbit Alexa 488 | Thermo Fisher | A-11008 | 1:1,000 dilution in PBS |
| HRP anti-goat | Santa Cruz Biotechnologies | sc-516086 | !:10,000 dilution in TBS |
| HRP donkey anti-mouse | Santa Cruz Biotechnologies | sc-2315 | 1:10,000 dilution in TBS |
| ICAM-1 antibody | Santa Cruz Biotechnologies | sc-1511 | 1:200 dilution in PBS |
| IRF5 antibody (H56) | Santa Cruz Biotechnologies | sc-98651 | |
| Micro plate reader Elx800 | Biotek | ||
| NIMP neutrophil marker | Santa Cruz Biotechnologies | sc-133821 | 1:200 dilution in PBS |
| Octet RED | Forte Bio | protein-protein binding | |
| Peptide design Medit SA software | RCSB.org | ||
| Recombinant IRF5 protein synthesis | TopGene Technologies | protein expression, synthesis service | |
| sodium dodecyl phosphate | Sigma Aldrich | 436143 | detergent |
| Ketamine | Pharmacy | Schedule III controlled substance, presciption required | |
| Xylazine | MedVet | ||
| 3.5X-45X Trinocular Dissecting Zoom Stereo Microscope with Gooseneck LED Lights | Am Scope | SKU: SM-1TSX-L6W | |
| Zeba Desalting Columns | Thermofisher | 2161515 | |
| Endothelial Basal Media EBM Bullet kit | Lonza | CC-3124 | kit contains growth supplemets |
| VIA-100K | Boeckeler Instruments | ||
| 4 - 15% TGX gel | Bio-Rad | 5671081 | |
| MedSuMo software | Medit, Palaiseau, France | ||
| Laemmli Buffer | BioRad |
References
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