Summary

Vasodilatation isolierter Gefäße und die Isolierung der extrazellulären Matrix von Fest-Haut Mäuse

Published: March 24, 2017
doi:

Summary

We describe the isolation of cardiac extracellular matrix from C57Bl/6J control mice, tight-skin mice, and tight-skin mice treated with the IRF5 inhibitory peptide. We also describe the vasodilation studies on the isolated vessels from C57Bl/6J, tight-skin mice and tight-skin mice treated with the IRF5 inhibitory peptide.

Abstract

The interferon regulatory factor 5 (IRF5) is crucial for cells to determine if they respond in a pro-inflammatory or anti-inflammatory fashion. IRF5’s ability to switch cells from one pathway to another is highly attractive as a therapeutic target. We designed a decoy peptide IRF5D with a molecular modeling software for designing small molecules and peptides.

IRF5D inhibited IRF5, reduced alterations in extracellular matrix, and improved endothelial vasodilation in the tight-skin mouse (Tsk/+). The Kd of IRF5D for recombinant IRF5 is 3.72 ± 0.74 x 10-6 M as determined by binding experiments using biolayer interferometry experiments. Endothelial cells (EC) proliferation and apoptosis were unchanged using increasing concentrations of IRF5D (0 to 100 µg/mL, 24 h). Tsk/+ mice were treated with IRF5D (1 mg/kg/d subcutaneously, 21 d). IRF5 and ICAM expressions were decreased after IRF5D treatment. Endothelial function was improved as assessed by vasodilation of facialis arteries from Tsk/+ mice treated with IRF5D compared to Tsk/+ mice without IRF5D treatment. As a transcription factor, IRF5 traffics from the cytosol to the nucleus. Translocation was assessed by immunohistochemistry on cardiac myocytes cultured on the different cardiac extracellular matrices. IRF5D treatment of the Tsk/+ mouse resulted in a reduced number of IRF5 positive nuclei in comparison to the animals without IRF5D treatment (50 µg/mL, 24 h). These findings demonstrate the important role that IRF5 plays in inflammation and fibrosis in Tsk/+ mice.

Introduction

Regulation von Zellwachstum und Zelltod-Immunantworten ist, um die Rolle des Transkriptionsfaktor-Familie von Interferon regulatorischer Faktoren zentral. IRF5 wird als entscheidend für die Regulation von Immunantworten zwischen Typ 1, eine entzündliche Reaktion fördern und Typ 2, eine Immunantwort Targeting Gewebereparatur hervorgehoben. IRF5 ist der Schlüssel in der Krebs – 1 und Autoimmunität 2, 3, 4, 5.

Die straffe Haut Maus (Tsk / +) ist ein Modell für Gewebefibrose und Sklerodermie aufgrund einer Verdopplungsmutation im Fibrillin-1-Gen. Diese Mutation führt zu einer tight-Haut und eine Erhöhung in Bindegewebe. Diese Mäuse entwickeln myokardiale Entzündung, Fibrose und schließlich Herzinsuffizienz 5, 6, 7,> 8, 9. Sklerodermie ist eine Autoimmun fibrotischen Erkrankung beeinflussen etwa 150.000 Patienten in den Vereinigten Staaten von Amerika 6. Die Kennzeichen dieser Krankheit sind Fibrose der inneren Organe einschließlich des Herzens 7, 8, 9, 10, 11.

Die Art der Studie forderte die Gestaltung eines hemmenden Peptids. Der Software-Ansatz wurde eine traditionelle Ansatz unter Verwendung einer Phagen-Display ausgewählt über. Der Software-Ansatz ist einfacher und weniger zeitraubend. Die RCSB Datenbank wird verwendet , 12 geeignete Bindungsstellen zu identifizieren. Um die Interaktion des neu gestalteten Peptid mit dem rekombinanten Protein zu studieren und zu den Bindungsparameter zu fokussieren, eine Technik, genannt Bioschicht Interferometrie verwendet wurde. Bioschicht Interferometrie ist ein Biosensor basiert technique, die bestimmt, Bindungsaffinität, Assoziation und Dissoziation einen Biosensor und eine Bindungsprobe unter Verwendung. Der Biosensor kann fluoreszierend, lumineszierend sein, radiometrisch und kolorimetrisch gekennzeichnet. Die Messung basiert auf Masse zusätzlich oder Abreicherung ähnelt Assoziation und Dissoziation 13, 14. Das Ziel dieser Studie war es, die Rolle der IRF5 in myokardiale Entzündung und Fibrose zu verstehen. Das Ziel war, einen Einblick in die Rolle der IRF5 in der Entwicklung von Gewebefibrose und Sklerodermie zu gewinnen.

Protocol

Diese Studie wurde in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health durchgeführt. Das Protokoll wurde von der Institutional Animal Care und Use Committee (: AUA # 1517 Protocol) genehmigt. Alle Forschung mit Mäusen wurde in Übereinstimmung mit PHS Politik durchgeführt. 1. Aufbau von Decoy Peptid Finden Sie die 3D-Struktur des IRF5 und stützen das Design auf. Entwerfen Sie ein 17 mer, genannt IRF5D (ELDW…

Representative Results

Die Ergebnisse sind in Abbildung gezeigt 1 zeigen , wie ein Peptid zu entwerfen. Figur 1 oben links, zeigt der Bereich (zwischen den 2 gelbe Pfeile, Aminosäuren (aa) 425-436) in IRF5 , die durch eine Reihe von Kinasen phosphoryliert wird. Abbildung 1, oben rechts, zeigt ein gelbes Oval , wo IRF5 die phosphoryliert Domäne bindet. Die dimere Struktur von 3DSH wurde gedreht, um eine Spalte oder das Tal auf der linken Seit…

Discussion

Das Ziel war es, ein IRF5 Inhibitor zu entwerfen, die Rolle der IRF5 auf Entzündung, Fibrose und Gefäßfunktion in den Herzen der Tsk / + Mäuse aufzuklären. Die Ergebnisse sind, dass IRF5D haben Proliferation oder Apoptose nicht induziert. Darüber hinaus wurde die Entzündung reduziert und Gefäßfunktion verbessert. Diese Daten legen nahe, dass IRF5 spielt eine wichtige mechanistische Rolle bei der Entwicklung der Entzündung und Fibrose im Herzen von Tsk / + Mäusen und daß sie das Potential als therapeutisches …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by NIH grants HL-089779 (DW), HL-112270 (KAP) and HL-102836 (KAP) and Cimphoni Life Sciences (part of DW salary). The authors thank Meghann Sytsma for editing the manuscript.

Materials

 Triton X 100 Sigma Aldrich X100- 100ml
Alexa 488-labeled goat anti-mouse IgG antibody  Thermo Fisher A11001
Bardford reagent Thermo Fisher 23200 Pierce 
Biosensors Forte-Bio MR18-0009
CD64 (H-250) Santa Cruz Biotechnologies sc-15364
CellEvent Caspase-3/7 Substrate Thermo Fisher/Life Technologies C10427
CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay kit Promega G3580 Promega
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) Thermo Fisher D-1306 1:1000 dilution in PBS
donkey anti rat Alexa 488 Thermo Fisher A-21208 1:1000 dilution in PBS
ECL plus GE healthcare/Amersham RPN2133 After a lot of trial and error we came back to this one
Eclipse TE 200-U microscope with EZ C1 laser scanning software Nikon
goat anti rabbit Alexa 488 Thermo Fisher A-11008 1:1000 dilution in PBS
HRP  anti-goat Santa Cruz Biotechnologies sc-516086 !:10000 dilution in TBS
HRP donkey anti-mouse Santa Cruz Biotechnologies sc-2315 1:10000 dilution in TBS
ICAM-1 antibody Santa Cruz Biotechnologies sc-1511 1:200 dilution in PBS
IRF5 antibody (H56) Santa Cruz Biotechnologies sc-98651
Micro plate reader Elx800 Biotek
NIMP neutrophil marker Santa Cruz Biotechnologies sc-133821 1:200 dilution in PBS
Octet RED Forte Bio protein-protein binding
Peptide design  Medit SA software RCSB.org
Recombinant IRF5 protein synthesis TopGene Technologies protein expression, synthesis service
sodium dodecyl phosphate Sigma Aldrich 436143 detergent
Ketamine Pharmacy Schedule III controlled substance, presciption required 
Xylazine MedVet
3.5X-45X Trinocular Dissecting Zoom Stereo Microscope with Gooseneck LED Lights Am Scope SKU: SM-1TSX-L6W
Zeba Desalting Columns Thermofisher 2161515
Endothelial Basal Media EBM Bullet kit Lonza CC-3124 kit contains growth supplemets
VIA-100K  Boeckeler Instruments
4-15% TGX gel Bio-Rad 5671081
MedSuMo software Medit, Palaiseau, France
Laemmli Buffer BioRad

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Weihrauch, D., Krolikowski, J. G., Jones, D. W., Zaman, T., Bamkole, O., Struve, J., Pagel, P. S., Lohr, N. L., Pritchard, Jr., K. A. Vasodilation of Isolated Vessels and the Isolation of the Extracellular Matrix of Tight-skin Mice. J. Vis. Exp. (121), e55036, doi:10.3791/55036 (2017).

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