Introduction
Regolazione della crescita cellulare e la morte cellulare risposte immunitarie è fondamentale per il ruolo del fattore di trascrizione famiglia di fattori regolatori interferone. IRF5 è evidenziato come cruciale per la regolazione delle risposte immunitarie tra il tipo 1, una risposta infiammatoria promuovendo e di tipo 2, una riparazione dei tessuti risposta immunitaria targeting. IRF5 è fondamentale nel cancro 1, e l'autoimmunità 2, 3, 4, 5.
Il mouse tight-pelle (Tsk / +) è un modello per la fibrosi dei tessuti e la sclerodermia a causa di una mutazione duplicazione nel fibrillin-1 gene. Questa mutazione si traduce in una stretta-pelle e un aumento del tessuto connettivo. Questi topi sviluppano infiammazione del miocardio, fibrosi e infine insufficienza cardiaca 5, 6, 7,> 8, 9. La sclerodermia è una malattia fibrotica autoimmune che colpisce circa 150.000 pazienti negli Stati Uniti 6. Le caratteristiche di questa malattia sono la fibrosi degli organi interni compreso il cuore 7, 8, 9, 10, 11.
La natura dello studio richiedeva la progettazione di un peptide inibitorio. L'approccio software è stato scelto per un approccio tradizionale utilizzando un phage display. L'approccio è il più semplice e meno che richiede tempo. La banca dati RCSB viene utilizzato per identificare opportuni siti di legame 12. Per studiare l'interazione del peptide di nuova concezione con la proteina ricombinante e di concentrarsi sui parametri di legame, è stata utilizzata una tecnica chiamata interferometria biolayer. Biolayer interferometria è un biosensore basato technique che determina affinità di legame, di associazione e dissociazione utilizzando un biosensore e un campione vincolante. Il biosensore può essere fluorescente, luminescently, radiometricamente e colorimetricamente etichettato. La misura si basa sulla aggiunta di massa o l'esaurimento simile associazione e dissociazione 13, 14. Lo scopo di questo studio è stato quello di comprendere il ruolo di IRF5 in infiammazione del miocardio e fibrosi. L'obiettivo era quello di ottenere una conoscenza approfondita del ruolo della IRF5 nello sviluppo della fibrosi dei tessuti e la sclerodermia.
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Protocol
Questo studio è stato condotto in stretta conformità con le raccomandazioni contenute nella Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health. Il protocollo è stato approvato dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa (Protocollo: AUA # 1517). Tutte le ricerche che coinvolgono i topi è stata condotta in conformità con la politica PHS.
1. Progettazione di Decoy Peptide
- Trova struttura 3D della IRF5 e basare il disegno su di esso. Progettare un 17 mer, chiamata IRF5D (ELDWDADDIRLQIDNPD), dove aspartato (D) è sostituito serina (S) per mimare la fosforilazione in IRF5 a 421-438 (ELSWSADSIRLQISNPD). Analisi dei gruppi sulfidrilici 3D e la conoscenza del meccanismo di attivazione di IRF5, vale a dire, serina fosforilazione, ha suggerito che una strategia per il targeting IRF5 è stato quello di generare un peptide esca. Vedere la Figura 1. Per individuare la migliore regione nella struttura 3D, utilizzare un software di modellazione molecolare per la progettazione di piccole moleculES e peptidi 15.
NOTA: Il passaggio critico in questo processo è la disponibilità della struttura 3D della proteina bersaglio e le sue possibili siti di legame. La struttura 3D di IRF5 rappresenta accuratamente dimerizza come IRF5 dopo fosforilazione. La sostituzione di aspartato per serina o treonina è in outsourcing. Il peptide viene sintetizzato separatamente, senza essere legato alla IRF5. - Replicare il fosfo-dominio semplicemente sostituendo D per S. Sulla base della sequenza originale (ELSWSADSIRLQISNPD, fare un nuovo IRF5S peptide con la sequenza aminoacidica di Ac-ELDWDADDIRLQIDNPD-NH 2 (IRF5D).
2. Biolayer Interferometry (BLI)
NOTA: La purificazione per IRF5 ricombinante è stata esternalizzata. 16
- label biotina IRF5 in un rapporto molare di 1: 1 di biotina a ligando con un reagente biotinylation incorpora un linker catena lunga. La lunga catena linker garantirà un liga più attivo e omogeneadi superficie ND.
- Aggiungere 1 ml di 2 mg / mL IRF5 a 13 ml di 20 mM reagente biotina o aumentare i volumi se necessario. Incubare in ghiaccio per 2 ore. Dopo marcatura, utilizzare una colonna dissalazione centrifuga per rimuovere la miscela di reazione dalla proteina marcata.
- Incubare il ligando marcato con biotina con i biosensori per 15 min. Evitare di etichettatura e regolare il rapporto di 1: 1 molare. Dopo marcatura, utilizzare una colonna dissalazione centrifuga per rimuovere la miscela di reazione dalla proteina marcata.
- Incubare le biotina biosensori IRF5 per 10 minuti a diverse concentrazioni del peptide IRF5 esca. I tassi di associazione e di dissociazione sono stati determinati come descritto 10, 17, 18.
3. apoptosi e proliferazione saggi
- Saggio di proliferazione tramite bioreduction del tetrazolio
- Somministrare IRF5D diluito in PBS (1 mg /kg / d, iniettare un volume di 20 ml in 20 g mouse) per via sottocutanea con un ago calibro 27 mediante una tecnica Scruffing standard o da PBS da solo per Tsk / + e C57Bl topi / 6J per 21 giorni.
- Anestetizzare i topi con isoflurano (5%) e di eseguire una dislocazione cervicale. Asportare il cuore tagliando aperto il torace lungo lo sterno. Sollevare il cuore con una pinza e rimuovere il cuore.
- Lyse i cuori con un tampone proteico lisi contenente 50 mM Tris-HCl pH 7.4, concentrazione proteica 0,5% NP-40, 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM NaF 10 e determinare di Bradford assay 19.
- Coat piastre a 96 pozzetti con C57Bl / 6J matrice cardiaco isolato come descritto nel paragrafo 7. Diluire il PBS sospesi 6J matrice C57Bl / cardiaco ad una concentrazione di 20 mg / ml e aggiungere 30 ml di C57Bl / 6J cardiaco per ciascun pozzetto. Lasciare riposare per una notte a 37 ° C in incubatore.
- umani cellule vena ombelicale coltura utilizzando 500 ml di endoteliale basale media con 0,4% di estratto di cervello bovino, acido ascorbico 0,1%, 0,1% idrocortisone, fattore di crescita epidermico umano 0,1%, siero bovino fetale 2% e 0,1% gentamicina / amfotericina B aggiunto ad esso. Cultura le cellule su piastre da 96 pozzetti a 5% di CO 2 e il 95% aria ambiente con una densità di 25.000 cellule per pozzetto. Stimola con concentrazioni crescenti di IRF5D tra 0 - 100 mg / ml nei media (volumi erano tra 0 e 50 microlitri / ml).
- Determinare la proliferazione cellulare dopo tre giorni e valutare le differenze di assorbanza su un lettore di micropiastre. La reazione è una bioreduction di composto tetrazolium MTS. NADPH o NADH è prodotto da enzimi deidrogenasi nelle cellule metabolicamente attive.
- Come il composto di tetrazolio MTS viene conservato congelato a -20 ° C, il composto scongelare lentamente nell'arco di circa 90 minuti a temperatura ambiente. Pipettare 20 ml in ciascun pozzetto di una piastra ben 96, e aggiungere 100 ml di terreni di coltura ad esso. Incubare la piastra a 37 ° C per 1 a 4 ore in una humisolidificati, 5% di CO 2 da camera.
- Leggere l'assorbanza alla lunghezza d'onda di 490 nm.
- Saggio L'apoptosi via l'attività delle caspasi
NOTA: Il set-up sperimentale è la stessa di cui sopra 3.1.1 a 3.1.5.- Stimolare le cellule con concentrazioni crescenti di IRF5D tra 0 - 100 mg / ml nella media.
- Aggiungere rilevamento verde al caspasi 3/7 substrato alla EC e incubare per 30 min a 37 ° C. Valutare la fluorescenza sul lettore di micropiastre contemporaneamente con una lunghezza d'onda di assorbimento / emissione di 502/530 nm. Esegui gli esperimenti in triplice copia.
NOTA: L'agente fluorescente verde è un peptide di quattro aminoacidi legati ad un colorante legante acido nucleico. Questo reagente diventa fluorescente quando spaccati dopo caspasi 3 e 7 di attivazione. Questa fluorescenza viene misurata. Il vantaggio è una riduzione fasi di lavaggio.
4. Valutazione della IRF5 e ICAM-1 nel Heart
- Somministrare IRF5D diluito in PBS (1 mg / kg / die, iniettare un volume di 20 ml in 20 g mouse) per via sottocutanea con un ago calibro 27 mediante una tecnica Scruffing standard o da PBS da solo per Tsk / + e C57BL / 6J volta al giorno per 21 giorni.
- Anestetizzare i topi con isoflurano (5%) e di eseguire una dislocazione cervicale. Asportare il cuore tagliando aperto il torace lungo lo sterno. Sollevare il cuore con una pinza e rimuovere il cuore.
- Lyse i cuori con un tampone proteico lisi contenente 50 mM Tris-HCl pH 7.4, concentrazione proteica 0,5% NP-40, 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM NaF 10 e determinare di Bradford assay 19.
- Eseguire un Western Blot su lisati di cuori. Diluire i campioni a 25 mg di proteine totali e un volume di 40 ml con tampone Laemmli contenente 5% mercaptoetanolo. Eseguire i campioni su un 4 - gel TGX 15% a 50 mV per 5 min. Aumentare la tensione a 100 mV per 1 h fino a quando il fronte del colorante si esaurisce.
- Porre il gel in 1x tampone di trasferimento (25 mM Tris, 190 mM glicina, 20% metanolo, regolare il pH a 8,3, se necessario) e incubare per 10 - 15 minuti.
- Montare il panino di trasferimento (spugna, filtro, gel, membrane di cellulosa, filtro, spugna). Assicurarsi che bolle sono intrappolati nel mezzo. Il blot dovrebbe essere sul catodo e il gel sull'anodo. Trasferimento per 1 h in camera fredda a 100 mA.
- Il giorno dopo, lavare la macchia e poi bloccare il fondo di 5% latte in polvere senza grassi per 30 minuti a temperatura ambiente. Sciacquare la macchia con Tris tamponata salina contenente 5% di Tween tre volte per 5 minuti ciascuno.
- Incubare per una notte con gli anticorpi primari utilizzando anticorpi policlonali principali per IRF5 o ICAM-1. Diluire gli anticorpi in Tris Buffered Saline in una diluizione 1: 1.000.
- Diluire gli anticorpi secondari in Tris Buffered Saline e incubare la macchia per 1 ora a temperatura ambiente. asino per gli anticorpi secondari, uso perossidasi coniugato anti-topo IgG (1: 10.000) e perossidasi asino anti-IgG di capra (1: 10.000), rispettivamente.
- Applicare chemiluminescenza alla macchia dopo aver componenti miscelazione secondo il protocollo del produttore e incubare per 3 minuti per luminesce le bande di interesse. Esporre la macchia di un X-ray film. Utilizzare ImageJ per misurare la densità. Normalizzare i valori di densità per le bande di controllo 10.
5. Valutazione del numero di cellule infiammatorie dopo IRF5 Inibizione
- Somministrare IRF5D diluito in PBS (1 mg / kg / die) per via sottocutanea con un ago calibro 27 mediante una tecnica Scruffing standard o da PBS da solo per Tsk / + e C57BL / 6J topi per 21 giorni.
- Anestetizzare i topi con isoflurano (5%) e di eseguire una dislocazione cervicale. Asportare il cuore tagliando aperto il torace lungo lo sterno. Sollevare il cuore con una pinza e rimuovere il cuore. Snap congelare e conservare i cuori escissi fino al momento dell'analisi.
- Montare i cuori congelate su tisstitolari UE adeguati al criostato in uso. Tagliare 10 micron sezioni congelate di spessore su un criostato per immunoistochimica.
- Fissare le sezioni congelate con 1% paraformaldeide in tampone fosfato per 20 minuti a temperatura ambiente. Permeabilize sezioni con 0,5% Triton-X 100 in PBS per 5 min.
Attenzione: Paraformaldeide è una sostanza cancerogena regolamentato e deve essere maneggiato con cura. - Diluire anti-coniglio CD64, una monociti / macrofagi marcatore 1: 200 in PBS. Applicare le sezioni fisse e incubare per 30 min a 37 ° C.
- Lavare i vetrini in PBS per 5 minuti tre volte a temperatura ambiente.
- Diluire anti-topo NIMP, un marker neutrofili primaria 1: 200 in PBS. Applicare le sezioni fisse e incubare per 30 min a 37 ° C.
- Lavare i vetrini per 5 min tre volte con PBS a temperatura ambiente.
- Diluire gli anticorpi secondari anti-coniglio Alexa 488 coniugato e anti-topo Alexa 488 coniugato 1: 200 in PBS.
- Applicare anti-coniglio Alexa 488 coniugato e anti-topo Alexa 488 anticorpi secondari coniugati alle sezioni per 30 min a 37 ° C conseguenza. Il volume di anticorpo varia a seconda delle dimensioni della sezione. L'importo dovrebbe coprire la sezione generosamente. Nella maggior parte dei casi il volume è compreso tra 100 e 200 ml.
- Utilizzare 4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) come colorazione nucleare in una diluizione 1: 1000 in PBS. Aggiungere 1 ml in 1 ml di PBS e utilizzare il DAPI nell'ultima fase di lavaggio. Aggiungere mezzo di montaggio acquoso ad un vetrino e metterlo sul vetrino.
- Analizzare sezioni fluorescente mediante microscopia confocale utilizzando un obiettivo olio 40X. Usa eccitazione lunghezze d'onda 488 e di emissione lunghezze d'onda superiori a 530 nm per CD64 e NIMP. DAPI era eccitato con 360 nm ed emessa a 460 nm in blu. Distinguere monociti / macrofagi e neutrofili (n = 10 immagini al anticorpi, da 3 diversi topi in ciascun gruppo) per la loro diversa etichettatura e contarli. Esprimere dati come il numero di cellule contate.
6. cella dipendente vasodilatazione dopo IRF5 Inibizione
- Anestetizzare topi C57BL / 6J controllo e Tsk / + topi con e senza trattamento peptide con ketamina (80 - 100 mg / kg) / xylazina periodo (10 - 12,5 mg / kg) della miscela. Iniettare la miscela di ketamina / xylazina per via intraperitoneale. Trattenere il mouse manualmente.
- Utilizzare un calibro 25 o un ago più piccolo. Inserire l'ago nel quadrante inferiore destro dell'addome. Estrarre il pistone prima dell'iniezione per assicurare che l'ago non entra un vaso sanguigno o l'intestino.
- Una volta che un livello sufficiente di anestesia è stata raggiunta, fissare il mouse in posizione supina, pulire il pelo con alcool imbevuta tampone di garza, e con un paio di forbici aprire la cavità toracica e rimuovere il cuore.
NOTA: Dissanguamento sarà eutanasia il mouse e fare la dissezione più facile da alleviare la pressione nel sistema vascolare riducendo così al minimo il sanguinamento durante il taglio dei vasi sanguigni.- Aprire il usin pellega paio di forbici, taglio dalla laterali cassa alla mandibola con cura per non disturbare i tessuti sottostanti verso la parte anteriore della mandibola.
- Sezionare l'arteria facciale rimuovendo il tessuto molle circostante.
- Attenzione: non ferire la nave o tirare facciale arterie, mantenendo il tessuto esposto immerso in tampone MOPS (2,0 mm CaCl 2 · 2H 2 O, 0,02 mm EDTA, 5,0 glucosio mM, 4,7 mm KCl, 1,17 mM MgSO 4 · 7H 2 O, 3.0 MOPS mm, 145 mm di NaCl, 1,2 mm NaH 2 PO 4 · H 2 O, 2,0 mm l'acido piruvico) per prevenire l'essiccamento. Eseguire sotto uno zoom dissezione microscopio binoculare stereo (ingrandimento di 3.5X a 45X) e una sorgente di luce in fibra ottica.
- Isolare l'arteria facciale.
- Afferrare prossimale facciale alla prima biforcazione e distale dove sarà tagliato l'arteria. Tagliare l'arteria dalla arteria principale, il carotide esterna. Rimuovere il Arterie facciales da topi di controllo, Tsk / + topi con e senza trattamento IRF5D.
- Sempre tenendo l'arteria nelle pinze, tagliare i due rami venuta fuori la facciale, consentendo alla nave di essere sollevato delicatamente mentre ogni tessuto circostante non tagliata può essere identificato e reciso.
- Continuare in questo modo fino a raggiungere la biforcazione taglio entrambe le arterie figlia per liberare il vaso. Non vi è alcuna necessità di bloccare i vasi prima del taglio a causa della pressione sollevato nella vascolatura di rimuovere cuore. Mettere il recipiente in tampone MOPS, mentre l'altra arteria facciale è sezionato e isolato.
- Cannulate vasi legandoli sul pipette di vetro con un diametro terminale 125 - 175 micron. Precaricare i pipette di vetro e serbatoi tampone con tampone MOPS.
Attenzione: Evitare la formazione di bolle d'aria nelle pipette. - Legare i vasi sulle pipette con suture oftalmiche.
- Montare le camere nave su MICR triocular invertitaoscope con un allegato di videocamera. Eseguire il video attraverso un sistema di misurazione di video pinza per le misurazioni su schermo dei vasi. 20
- li sotto pressione in un processo in due fasi. Innanzitutto, con i serbatoi MOPS-riempite ad una altezza al di sopra del recipiente pari alla pressione di 20 mmHg, aprire manualmente le valvole chiavette nelle linee serbatoio alla nave. Controllare il vaso per segni di perdite attorno ai legami e la lunghezza della nave. In secondo luogo, aumentare i serbatoi a 60 mmHg e reinspect il vaso.
- Una volta pressurizzato a 60 mmHg, permettere alle navi equilibrare per 30 min.
- Per valutare la vasodilatazione in risposta all'acetilcolina (10 -7 a 10 -4 M), preconstrict nave verso un diametro di 50 - 75% del suo diametro massimo dell'uso 1 - 3,0 x 10 -8 a 10 -7 M U46619. Dopo aver lasciato la nave si stabilizzi per 6 minuti, aggiungere acetilcolina al bagno in passi durata 2 min tale che laconcentrazioni finali nella vasca da bagno sono 10 -7, 10 -6, 10 -5, 10 -4. Misurare la vasodilatazione nei tre gruppi.
7. Isolamento di Cardiac matrice extracellulare
- Anestetizzare 6J C57BL / controllo e Tsk / + topi con e senza trattamento peptide con isoflurano (5%) e di eseguire una dislocazione cervicale. Asportare il cuore tagliando aperto il torace lungo lo sterno. Sollevare il cuore con una pinza e rimuovere il cuore.
- Mettere i cuori rimossi in un bicchiere e aggiungere 15 ml ipertonica 1% di solfato di sodio dodecil (SDS). Agitare cuori nella soluzione SDS 1% per 18 ore a temperatura ambiente per rompere le cellule aggiungendo un ancoretta alla soluzione SDS 1% e mettendo il becher su un piatto mescolare.
Attenzione: Tenere presente che matrice extracellulare si disintegrerà se lasciato troppo a lungo in soluzione ipertonica. Viceversa, se i cuori non sono agitati abbastanza a lungo in soluzione ipertonica, quindi le cellule non saranno adeguatamentesciogliere e ci saranno detriti cellulari lasciato nel bicchiere. - Lavare per 30 minuti in 15 ml di 0,5% Triton X-100. Quindi lavare per 15 minuti con 15 ml di PBS. Decellularize ogni cuore singolarmente.
- Snap-congelare la matrice extracellulare in azoto liquido e powderize matrice extracellulare cardiaca congelato con una malta pre-raffreddato e pestello.
- Effettuare una sospensione della matrice polverizzato in PBS contenente 1% di antibiotici. Il volume aggiunto nella maggior parte dei casi è di 300 microlitri. Sonicare la sospensione per 30 - 60 s su ghiaccio sul impostazione alta.
NOTA: È molto importante che il campione mantiene freddo. Sia informato che la sospensione è molto viscoso a causa dell'elevato contenuto proteico glycan. - Determinare la concentrazione di proteine con un saggio Bradford.
NOTA: Assicurarsi che ci sia anti-biotici e anti-fungine nella sospensione. Penicillina / streptomicina sono i più comunemente usati e raccomandato.
8. Valutazione della traslocazione nucleare da Immunohistochemistry
- Per piatti cappotto e diapositive utilizzare una concentrazione finale di 20 mg / ml della matrice extracellulare cardiaca in PBS. Pipettare 500 microlitri della soluzione cardiaca matrice extracellulare in un piatto 100 mm per rivestimento e 150 microlitri della soluzione di matrice extracellulare finale su un vetrino.
- Inibire IRF5 con l'aggiunta di IRF5D in una concentrazione 50 mg / ml per 24 ore al ratto miociti cardiaci neonatali nella cultura. Lasciare controllare culture miociti non trattata.
- Valutare traffico di IRF5 dal citoplasma al nucleo mediante immunofluorescenza e analizzare al microscopio confocale. Identificare l'etichettatura verde per IRF5, individuare la macchia DAPI blu per il nucleo
- Applicare l'anticorpo anti-IRF5 primaria. L'anticorpo primario è stato usato in una diluizione 1: 200 in PBS. Incubare i vetrini per 30 minuti a 37 ° C e seguire con tre fasi di lavaggio di 5 minuti. L'anticorpo secondario era di capra Alexa 488-marcato anticorpo anti-IgG di topo.
- Diluire l'anticorpo secondario 1: 1.000 diluzione in PBS. Incubare l'anticorpo secondario per 30 min a 37 ° C. Raggiungere macchia nucleare con DAPI. Diluire DAPI 1: 1000 in PBS. Lavare le diapositive un totale di 3 volte per 5 minuti e aggiungere DAPI alla terza ed ultima fase di lavaggio.
- Traffico di cattura usando la microscopia confocale e l'intensità della fluorescenza misura nei nuclei e citosol come descritto in precedenza 10. Identificare l'etichettatura verde per IRF5, individuare la macchia DAPI blu per il nucleo. Le cellule che presentano nuclei blu con etichettatura verde in essi contengono attivati IRF5, che trafficata dal citoplasma al nucleo. etichettatura verde quando IRF5 non è attivata si trova nel citoplasma.
- Analizzare le cellule fluorescente mediante microscopia confocale utilizzando un obiettivo olio 40X. Utilizzare una lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nm ed emissione di lunghezze d'onda superiore a 530 nm per IRF5. Utilizzare una lunghezza d'onda di eccitazione di 360 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 460 nm per la visualizzazione di DAPI.
- Eseguire l'analisi della varianza (ANOVA) per misure ripetute all'interno e tra i gruppi. Seguire ANOVA con la modifica di Bonferroni di studenti t-test. Esprimere dati come l'errore standard della media.
- Anestetizzare topi C57BL / 6J controllo e Tsk / + topi con e senza trattamento peptide con ketamina (80 - 100 mg / kg) / xylazina periodo (10 - 12,5 mg / kg) della miscela. Iniettare la miscela di ketamina / xylazina per via intraperitoneale. Trattenere il mouse manualmente.
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Representative Results
I risultati hanno dimostrato nella figura 1 mostrano come progettare un peptide. Figura 1, in alto a sinistra, mostra la regione (tra le 2 frecce gialle, aminoacidi (aa) 425-436) in IRF5 che viene fosforilato da un certo numero di chinasi. Figura 1, in alto a destra, mostra una forma ovale di colore giallo dove dominio fosforilata di IRF5 lega. La struttura dimerica del 3DSH è stato ruotato di osservare una fessura o valle a fianco della Helix 2 (aa303-312). Questo è dove si suppone che il dominio fosfo-coda IRF5 di impegnare quando è completamente attivato (cioè, serina fosforilata), formando un omodimero e il suo presunto stato biologicamente attiva.
In figura 2, l'attività di legame misurata dal biolayer interferometria è raffigurato. Per determinare che il IRF5D esca peptide non è tossico, la proliferazione e l'apoptosi sono stati valutati dopo aver trattato la cells con concentrazioni crescenti di IRF5D (Figura 3). ICAM-1, un marker infiammatorio, e IRF5 espressioni erano ridotti dopo trattamento TSK / + topi con IRF5D come determinato mediante analisi western blot (Figura 4). Il numero di neutrofili (nimp) e CD64 erano diminuite come determinato mediante immunoistochimica dopo il trattamento con IRF5D (Figura 5). La funzione endoteliale è stata migliorata nelle arterie facciale di Tsk / + topi dopo IRF5D rispetto a Tsk / + topi senza trattamento IRF5D (Figura 6). Un maggior numero di IRF5 nuclei positivi in miociti in coltura su matrice Tsk / + cardiaca sono stati visualizzati rispetto alla matrice cardiaca C57BL / 6J. Trattamento delle colture con IRF5D provocato una diminuzione del numero di nuclei IRF5 positivo (Figura 7).
Figura 1: 3D della proteina Structure di IRF5. A) La figura in alto a sinistra mostra la regione il peptide è stato progettato per. B) La regione che viene fosforilata evidenziata dalle due frecce gialle sono aminoacidi (aa) 425 - 436 in IRF5. C) Il pannello inferiore raffigura il complesso funzionale omodimerica. La figura omodimerica è presentato per facilitare la visualizzazione della regione in cui il dominio coda fosforilata di IRF5 si lega in modo da formare un omodimero. Questo dato è stato pubblicato in precedenza 21. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Biolayer Interferometria di IRF5D. Questa figura mostra il legame di IRF5 per IRF5D valutati da biolaye R interferometria. Software di analisi ha dimostrato che IRF5 lega a IRF5D con un K d di 3,72 ± 0,75 x 10 -6 M (media ± SD, n = 3). Questo dato è stato pubblicato in precedenza 21. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: cellulare proliferazione e l'apoptosi. Questi grafici a barre mostrano che concentrazioni crescenti di IRF5D non hanno alcuna influenza sulla proliferazione cellulare (a sinistra) o apoptosi (a destra), e non sono state alterate da livelli di IRF5D crescente. Questo dato è stato pubblicato in precedenza 21 (media ± SD, p <0.05, n = 4).k "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: ICAM-1 e IRF5 espressione nel Cuore. IRF5 espressioni (B) ICAM-1 (A) e sono diminuiti nel miocardio di Tsk + topi dopo il trattamento IRF5D come dimostrato mediante western blot. I dati sono stati normalizzati al controllo actina carico (media ± SD, p <0,05, n = 3). Questo dato è stato pubblicato in precedenza 21. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5:CD64 (A) e NIMP (B) Espressione nel Cuore. Il numero dei monociti / macrofagi e neutrofili è stata ridotta dopo il trattamento IRF5D come dimostrato da immunoistochimica (media ± SD, * = p <0.05, C57BL / 6J vs. Tsk / +; # = p <0,025, Tsk / + vs Tsk / + + IRF5D; n = 3, 10 immagini al anticorpo). Le frecce evidenziano monociti / macrofagi (A) e (B) neutrofili. Le barre di scala sono 10 micron. Questo dato è stato pubblicato in precedenza 21. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6: funzione cellulare e vasodilatazione. amministrazione IRF5D migliorato acetilcolina indotta vasodilatazione delle arterie facciale di Tsk / + topi (media &# 177; SD, p <0,05, n = 6). Questo dato è stato pubblicato in precedenza 21. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 7: IRF5 traslocazione nucleare di IRF5 in colture di miociti con l'inibizione IRF5. l'inibizione IRF5 da IRF5D (50 mg / ml, 24 h) porta ad un minor numero di nuclei positivi IRF5 nei miociti in coltura su matrice Tsk / + cardiaca e matrice cardiaco C57Bl / 6J. Le frecce rappresentano IRF5 nuclei positivi (media ± SD, p <0.05, n = 3). La barra della scala è di 5 micron. Questo dato è stato pubblicato in precedenza 21. Si prega di CLICk qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
L'obiettivo era quello di progettare un inibitore IRF5 per chiarire il ruolo di IRF5 sulla infiammazione, la fibrosi e la funzione vascolare nei cuori di Tsk / + topi. I risultati sono che IRF5D non ha indotto la proliferazione o l'apoptosi. Inoltre, l'infiammazione si è ridotta e la funzione vascolare migliorata. Questi dati suggeriscono che IRF5 svolge un importante ruolo meccanicistica nello sviluppo di infiammazione e fibrosi nel cuore di Tsk / + topi e che ha il potenziale per servire come un obiettivo terapeutico.
Il primo passo è stato quello di progettare un inibitore. Quando un peptide è stato progettato, alcuni punti devono essere presi in considerazione: lunghezza della sequenza, struttura secondaria, residui inclini all'ossidazione, composizione aminoacidica, ammidazione e tappatura, aminoacidi N-terminale e aminoacidi nel C-terminale, e l'attaccamento ligando. La lunghezza della sequenza ideale è tra 10 e 15 residui di garantire il miglior rendimento complessivo, meno impurità, e costi ridotti. E 'important di essere a conoscenza di strutture secondarie come formazione del foglio di beta. formazione del foglio Beta può comportare un elevato grado di sequenze delete. Evitare residui inclini all'ossidazione che può portare a lato reazioni che possono influenzare l'efficacia del peptide. Per controllare la solubilità, la sintesi e la purificazione, mantenere la composizione degli aminoacidi, per il peptide sotto amminoacidi idrofobici 50% e garantire che non vi siano residui carichi abbastanza. N- e C- termini devono essere scelti viene ricaricata. Evitare glutammato all'estremità N-terminale ed evitare cisteina, prolina, glicina e al C-terminale. Aggiungere un distanziatore tra il peptide e ligando per minimizzare piegatura. Pertanto, si potrebbe aver bisogno di essere mascherato come un ammide senza spese.
disegno IRF5D era basata sulla struttura 3D. A 17 mer, definito IRF5D (ELDWDADDIRLQIDNPD) è stato progettato, in cui aspartato (D), sostituito da serina (S) per mimare la fosforilazione in IRF5 a 421-438 (ELSWSADSIRLQISNPD). Questoapproccio è semplice grazie alla tecnologia informatica romanzo. Lo svantaggio di questa tecnica è l'investimento iniziale nel software. Tuttavia, ci sono notevoli risparmi complessivi se confrontato con i costi associati alla manodopera e materiali usati in altri metodi di progettazione inibitore, come phage display 22. Il passaggio critico in questo processo è la disponibilità della struttura 3D della proteina bersaglio e le sue possibili siti di legame. La limitazione di progettazione di un inibitore è la possibilità che una regione errata viene scelto e l'inibitore non blocchi la proteina desiderata. L'altra possibilità è un blocco parziale della proteina desiderata.
Con il peptide in mano l'attenzione si sposta testare la tossicità del peptide richiamo misurando sopravvivenza cellulare. In primo luogo, IRF5D è stata testata utilizzando concentrazioni variabili. IRF5D non induce apoptosi e non promuove la proliferazione anche a concentrazioni più elevate. I metodi utilizzati sono qui standard e dare dati affidabili. Il bioreduction tintura tetrazolio è stata usata per molti anni 23. Questo test è stato scelto per la sua riproducibilità e tempo efficacia rispetto ad altri metodi, per esempio, il conteggio delle cellule manualmente che è molto tempo. Utilizzo di BrdU per marcare le cellule proliferanti richiede radioattività, che è sensibile, ma può essere pericoloso. Il bioreduction colorante di tetrazolio è tempo efficiente e non richiede radioattività. Le limitazioni del bioreduction tintura tetrazolio è prevalente negli studi che coinvolgono potenziale ossido-riduttivo. Ovunque si verifica potenziale ossido-riduttivo, i falsi positivi sono più frequenti 24.
L'isolamento della matrice extracellulare è stata acquisita sciogliendo tutte le cellule miocardiche con una soluzione ipertonica. Il protocollo è stato evoluto da studi utilizzando un apparato di perfusione a un semplice processo di agitazione 25. il DURATion stata valutata empiricamente adottando differenti tempi: 12, 14, 16, 18, 20 h. La matrice extracellulare è stato analizzato per detriti cellulari dopo punta il diverso tempo di 25. Le principali insidie di decellularization sono contaminazioni fungine e batteriche. Si consiglia di usare composti anti-fungine e anti-microbiche. Per piatti cappotto, la matrice extracellulare è powderized e sospeso in PBS. Grazie all'elevato contenuto di materiale elastico, il campione non completamente sciogliere. Sonicazione sulle impostazioni di intensità più elevate senza riscaldare il campione è imperativo. Il vantaggio di utilizzare matrice extracellulare su altri agenti di rivestimento è che la matrice extracellulare è una fusione di proteine fisiologicamente verifichi e si connette in vivo e in vitro. Questo approccio è più fisiologico di rivestimento con un singolo composto come collagene o fibronectina da solo. Esso fornisce inoltre informazioni dell'importanza di segnalazione iniziata da variazionila matrice extracellulare. Una limitazione di questo protocollo è chiaramente la distruzione della matrice e la rimozione di importanti componenti segnalazione dalla matrice. E 'indispensabile essere cauti quando decellularizing la matrice.
L'impiego di tessuto intatto navi simili isolato apre la possibilità di studiare vasodilatazione in situ e con interferenza minima di enzimi. Questo metodo è più adeguata per studiare la funzione endoteliale in una varietà di animali e malattie. Duling stato il primo a descrivere questo metodo nei suini. I vasi di maiale sono profonde nel tessuto; quindi la carta descritta la fissazione gelatina. I primi studi in vasodilatazione usati arterie carotidi 26. Abbiamo raffinato la tecnica da utilizzare facciale arterie 27. arterie facciale sono più equivalente per dimensioni, a un'arteria di resistenza rispetto alla carotide. Una limitazione di questo protocollo è la fragilità della nave, che deve essere rimosso requirin intattog pratica.
In sintesi, lo sviluppo di IRF5D ci ha permesso di valutare il coinvolgimento di IRF5 infiammazione e fibrosi nel cuore. Ciò ha provocato i dati illustrati in questo studio. IRF5D è uno strumento utile per studiare i meccanismi di IRF5 in varie malattie, così come suggerisce IRF5 come un possibile bersaglio di droga 28.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Triton X 100 | Sigma Aldrich | X100- 100ml | |
| Alexa 488-labeled goat anti-mouse IgG antibody | Thermo Fisher | A11001 | |
| Bardford reagent | Thermo Fisher | 23200 | Pierce |
| Biosensors | Forte-Bio | MR18-0009 | |
| CD64 (H-250) | Santa Cruz Biotechnologies | sc-15364 | |
| CellEvent Caspase-3/7 Substrate | Thermo Fisher/Life Technologies | C10427 | |
| CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay kit | Promega | G3580 | Promega |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fisher | D-1306 | 1:1,000 dilution in PBS |
| donkey anti rat Alexa 488 | Thermo Fisher | A-21208 | 1:1,000 dilution in PBS |
| ECL plus | GE healthcare/Amersham | RPN2133 | After a lot of trial and error we came back to this one |
| Eclipse TE 200-U microscope with EZ C1 laser scanning software | Nikon | ||
| goat anti rabbit Alexa 488 | Thermo Fisher | A-11008 | 1:1,000 dilution in PBS |
| HRP anti-goat | Santa Cruz Biotechnologies | sc-516086 | !:10,000 dilution in TBS |
| HRP donkey anti-mouse | Santa Cruz Biotechnologies | sc-2315 | 1:10,000 dilution in TBS |
| ICAM-1 antibody | Santa Cruz Biotechnologies | sc-1511 | 1:200 dilution in PBS |
| IRF5 antibody (H56) | Santa Cruz Biotechnologies | sc-98651 | |
| Micro plate reader Elx800 | Biotek | ||
| NIMP neutrophil marker | Santa Cruz Biotechnologies | sc-133821 | 1:200 dilution in PBS |
| Octet RED | Forte Bio | protein-protein binding | |
| Peptide design Medit SA software | RCSB.org | ||
| Recombinant IRF5 protein synthesis | TopGene Technologies | protein expression, synthesis service | |
| sodium dodecyl phosphate | Sigma Aldrich | 436143 | detergent |
| Ketamine | Pharmacy | Schedule III controlled substance, presciption required | |
| Xylazine | MedVet | ||
| 3.5X-45X Trinocular Dissecting Zoom Stereo Microscope with Gooseneck LED Lights | Am Scope | SKU: SM-1TSX-L6W | |
| Zeba Desalting Columns | Thermofisher | 2161515 | |
| Endothelial Basal Media EBM Bullet kit | Lonza | CC-3124 | kit contains growth supplemets |
| VIA-100K | Boeckeler Instruments | ||
| 4 - 15% TGX gel | Bio-Rad | 5671081 | |
| MedSuMo software | Medit, Palaiseau, France | ||
| Laemmli Buffer | BioRad |
References
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