Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Chemistry

Situ Algılama ve Metal Oksit nano tanecikleri nükleer Microprobe analizi ile tek hücre miktar

doi: 10.3791/55041 Published: February 3, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Biz kimyasal elementler mevcut içinde in situ insan hücreleri hem de onların vitro miktar tespiti için açıklayınız. Yöntem herhangi bir hücre tipi için uygundur ve Tek Kişilik hücrelerde vitro metal oksit nano tanecikleri pozlama takip kantitatif kimyasal analizler için özellikle kullanışlıdır.

Abstract

Mikro-analitik teknikler üzerinde kimyasal element görüntüleme dayalı Yerelleştirme ve hücresel düzeyde kimyasal kompozisyon miktar etkinleştirin. Yaşayan sistemler karakterizasyonu için yeni olanaklar sunmak ve algılama, Yerelleştirme ve metal oksit nano tanecikleri hem biyolojik örnekler ve çevre varlığı miktarının için özellikle uygundur. Gerçekten de, tüm bu teknikler (i) hassasiyeti (1 en çok kuru kütlesinin 10 µg.g-1 ), (ii) ölçüm aralığı Uzaysal çözünürlük ve (iii) çoklu öğe algılama açısından ilgili gereksinimlerini karşılamak. Bu özellikleri göz önüne alındığında, microbeam kimyasal element görüntüleme güçlü rutin görüntüleme teknikleri gibi tamamlayıcı olabilir optik ve floresan mikroskopisi. Bu iletişim kuralı, kültürlü hücreleri (U2OS) için titanyum dioksit nano tanecikleri maruz üzerinde nükleer microprobe çözümlemesi açıklar. Hücreleri büyümek zorundadır ve doğrudan bir özel olarak tasarlanmış örnek tutucu üzerinde optik mikroskop ve nükleer microprobe analiz aşamalarında maruz. Dalma-donma örnekleri kriyojenik fiksasyonu hücresel organizasyon ve kimyasal element dağıtım korur. (X-ışını emisyonu tarama iletim iyon mikroskobu, Rutherford spektrometresi gelmekte ve parçacık indüklenen) eşzamanlı nükleer microprobe analiz örnek üzerinde gerçekleştirilen hücresel yoğunluk, yerel dağıtım kılavuzu kimyasal elementlerin yanı sıra nano tanecikleri hücresel içeriği. Biyoloji, özellikle bağlamında ortaya çıkan Nanotoxicology ve kendisi için bizim anlama nano tanecikleri ve biyolojik örnekler arasındaki etkileşimler derinleştirdi gerekir Nanomedicine içinde böyle analitik araçlar için büyüyen bir ihtiyaç vardır. Özellikle, nükleer microprobe analysis etiketli nano tanecikleri gerektirmez nanopartikül miktar ölçülebilir yüzey durumlarına bağımsız olarak bir hücre nüfus tek hücre düzeyine şunlardır.

Introduction

Hücresel homeostazı alımını kontrol, asimilasyon ve hücre içi yerelleştirme farklı iz elementler (iyonları, metaller, eksojen inorganik bileşikler) tarafından belirlenir. Bu bileşenleri sık sık izleri şeklinde vardır ama yine de sistem fizyolojisi önemli bir etkiye sahip. Böylece, normal ve patolojik/stresli durumlarda hücre Biyokimya hücresel metabolik mekanizmalar genel bir anlayış doğru bir anahtar adım çalışmadır. Bu nedenle, hücre içi kimyasal zenginliği, yapısal organizasyonu ve onların ilgili metabolik fonksiyonlar soruşturma etkinleştirme görüntüleme ve analitik yöntemlerin geliştirilmesi sayesinde gerekli olur. Situ nicel parçası belirli bir örnek genel olarak kimyasal doğası ile ilgili bilgiler sağlamak mümkün çok az yöntemlerdir. Toplu form örnekleri analiz yöntemleri dışında in situ analizleri biyolojik örnekleri kendi integrality böylece (eser elementler ve iyonlarının) kurucu kimyasal koruma kitle ve yapısal bilgileri kaybetmeden düşünün ve proteinler. Nanobilimler geliştirmeye devam ederken, Ayrıca, Gelişmiş görüntüleme ve hücresel ölçekte çevre izlemek için analitik yöntem gözlemlemek ve nano-nesne davranışları ve etkileşimleri ölçmek için gerekli olacaktır. 1

Nano tanecikleri (NPs) en az bir yüz boyut aralığı 1 ile 100 nm sergilenmesi nesneler olarak tanımlandı. 2 belirli fizikokimyasal özellikleri nedeniyle, NPs, yaygın olarak sektöründe kullanılır. NPs biyo-uygulamaları ve nanomedicine istihdam edilmektedir. 3 , 4 NPs rağmen çok sayıda fizikokimyasal özellikleri ürettikleri bazı risklerin insan sağlığı ve çevre üzerinde olumsuz etkileri. Bu riskler uzun süreli ve tekrarlayan Etkilenmeler çeşitli konsantrasyon düzeylerde tarafından indüklenen ve bu değil henüz açıkça kurulmuştur. 5 , 6 , 7 , 8 özellikle, NPs kaderi hücreleri ve ilişkili hücresel yanıt içinde olan, bugüne kadar tam olarak açıklanan. Bu kısmen algılama izin yöntemleri kıtlığı ve miktar tek bir hücrede içselleştirilmiş NPS'nin kaynaklanmaktadır. 9

Nano tanecikleri hücresel doz olan microscopies, kütle spektrometresi (MS), tahmin etmek için kullanılan klasik analitik araçlar İndüktif eşleşmiş plazma MS (ICP-MS)10,11 ve sıvı Kromatografi MS (LC-MS), ama onlar sadece sağlamak yararlı bilgiler makroskobik ölçekte. Hiçbiri-in onları hücre altı NPs içerik ne de ayırma yöntemlerini kullanmaya gerek kalmadan NPs dağıtımını hassas bir değerlendirme sağlar. Doz-yanıt sistematik bir değerlendirme böylece atomik spektroskopi nükleer microprobe analiz12,13, sinkrotron x-ışını Floresans mikroskobu14 gibi temel yöntemleri aksine bu yöntemler ile imkansız ve ikincil iyon kütle spektrometresi (SIMS). 15 , 16 bu yöntemler özellikle ilginç Floresans mikroskobu kullanılarak yapılan gözlemler tamamlayıcı olarak, özellikle NPs floresan molekülleri ile Etiketlenmiş olamaz ve böylece yerel durumlarında incelenmektedir. NPs ile fluorophores, hatta aşılı bir dereceye kadar (i) miktar başına NP etiketleme düzeyi bilinmiyor ve (ii) NP yüzey kimyasal değişiklik hücresel dağılımı değiştirebilir çünkü zor kalır.

Bu makalede, morfoloji ve Majör, minör, biyolojik örneklerin elemental kompozisyon görüntüleme nişan nükleer microprobe teknikleri bir arada dayalı bir yöntem odaklanmak ve konsantrasyonları iz.

Nükleer microprobe analiz eser kimyasal elementler biyolojik dokularda ölçümü için özellikle uygun olmaktadır. Işın yanal çözünürlük (0.3-1 µm) ve kimyasal element algılama hassasiyeti (1-10 µg.g-1 kuru kitle) hücresel düzeyde çalışmalar için uygundur. Nükleer microprobe teknikleri (MeV enerjilerde genellikle çalışan) iyon demeti atomlar örnek mevcut etkileşim sonra yayılan parçacıklar algılama (fotonlar, elektronlar, iyonlar) temel alır. Hücrelerde meydana gelen etkileşimleri çoğu esas olarak: 1) uyarma/iyonlaşma atomların atom temel durumlarına geri; döndükten sonra bir foton emisyon tarafından takip ve 2) kendi enerji ve yönünü değiştirmek için önde gelen parçacıkların Difüzyon. Verilmiş parçacık enerji Main'i kimlik atomların etkileşimde yer alan ilgili ölçüm birimi. Eşleme öğelerinin gerçekleştirmek için iyon microbeam art arda örnek yüzey üzerinde kez yaklaşık 100 100 µm2 birkaç hücreyi içeren bir alanın üzerinde tarama yapılır. Verilmiş parçacıkları tespit edilir ve onların enerji her ışın pozisyon için kaydedilir. Partikül ışını konumuna göre sıralanması, böylece bu tür parçacıklar emisyon için sorumlu yapısı tanımlama veri tedavi amacı olduğunu. Burada, tam olarak Floresans mikroskobu ve nükleer microprobe analiz algılamak için yanı sıra yaşam ile NP etkileşimleri sonuçlarını araştırmak için hücresel ve alt hücresel ölçeklerde eksojen NPs ölçmek için temel alan bir yaklaşımı açıklamak sistemleri. Özellikle bu yöntem in situ miktar titanyum dioksit nano tanecikleri (TiO2 NPs) toplamları hücre altı düzeyinde açısından sunduğu fırsatlar üzerinde odaklanmak zorundadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. örnek sahibi hazırlık

  1. Örnek tutucu tasarımı ve hazırlık
    1. Bir örnek sahibi bir 5 x 5 mm kare 1 mm kalınlığında PEEK çerçevesindeki Delme tarafından üretmekteyiz.
    2. Etanol %70 (v/v) durulama tarafından temiz ve steril levha kullanıma hazır kadar tutun.
      Dikkat edin. Hücre kültürü ve hücre işleme için uygun bir örnek sahibi gereklidir. Bu hücre kültürü çalışmalarının, vitro gözlemleri ile optik mikroskobu ve nükleer microprobe çözümleme ve görüntüleme için tasarlanmış olması gerekir. Bu tutucu bir göz çerçeve13yapılır.
  2. Örnek sahibi hazırlık
    1. Formvar çözüm Formvar tozu 100 ml kloroform 1 mg çözülerek hazırlayın.
    2. Böylece hiçbir kat sunar polikarbonat folyo metalik bir karede germek.
    3. Steril bir ipucu Formvar çözüm örnek sahibi deliğin etrafında yaymak için kullanın.
    4. İnce gergin polikarbonat folyo (5 x 5 mm kare) üzerine tutkal ile örnek sahibi yere bırak.
    5. Bir örnek sahibi her çoğaltma için hazırlamak için önceki sıra yineleyin.
      Dikkat edin. Polikarbonat (PC) Biyouyumlu, yeterince kalın ve dayanıklı farklı protokolleri ve analitik kısıtlamaları filmidir.
      Dikkat- kloroform zehirlidir. Solunum, sindirim önlemek veya cilt ile temas. Her zaman düzgün işleyen bir kimyasal duman başlık ve uygun filtreler kullanın.
  3. Örnek sahibi sterilizasyon
    1. Takılı örnek sahibi konik bir şişesi 50 mL etanol %70 (v/v) gecede, ajitasyon 180 rpm ve 37 derece ° C altında ile bir kuluçka makinesi/karıştırıcı kullanarak yerleştirin.
    2. Steril distile su içinde birkaç kez sahibinin durulayın.
    3. Hava Kuru onları steril koşullarda ve ultraviyole ışık (Biyogüvenlik tezgah, sınıf II antiseptik lamba) için her iki taraftaki 30 dk için karşılaşmazlar.
    4. Steril 12-şey tabak (her şey bir örnek sahibi) örneklerinde kullanıma hazır kadar tutun.
      Not: Birden çok örnek sahipleri parafilm ile birkaç gün için kapalı kuru ve steril 12-şey tabak içinde oda sıcaklığında muhafaza edilebilir.

2. uygun örnek tutucu hücrelerinin büyümesini.

Uyarı: İletişim kuralı bir biyogüvenlik laminar akış Bank (sınıf II) bulaşıcı mikro-organizmaların dışlamak için yapılmalıdır. Antibiyotikler (örneğin penisilin, streptomisin) eldiven ile başa. En iyi uygulamalar biyolojik malzemeleri (hücre hatları, genetik olarak değiştirilmiş insan hücreleri türetilmiş) saygı gösterin.

Kritik: kullanılan hücre hatları ile Mycoplasmabulaşmadığından emin olmak için kontrol edilmelidir.

  1. U2OS hücre satır üreticisi tarafından kurulan iletişim kuralına uygun olarak bir transfection yöntemini kullanarak matris-roGFP 17,18,19 taşıyan plazmid ile transfect.
  2. Transfection plazmid taşıyan ile onaylamak için Biyoalgılayıcı ve plazmid kaybını önlemek için seçin ve uygun kültür ortamdaki transfected hücreleri korumak.
  3. Transfected hücreleri floresan mikroskopi transfection oluştu, Floresans ifade ve Retiküler ve borulu mitokondrial ağ19görüntüsünü onaylamak üzere görselleştirin.
    Durma noktası: Hücreler sıvı azot içinde birkaç yıldır donmuş olabilir.
  4. Transfected hücre nüfus uygun bir ortamda hücre kültürü çalışmalarının alt Konfluent hücre popülasyonlarının elde etmek için kullanın. 37 ° c, % 5 (v/v) CO2 bir doymuş su atmosferde hücrelerin büyümesine.
  5. Fiksasyon yapıldığı gün % 80'i izdiham olduğu gibi tohum bir konsantrasyon hücreleri. Genellikle, bir konsantrasyon µL başına 500 hücre kullanılabilir. Tripsin-EDTA 400 µL % 0.25 kullanarak hücreleri (v/v) hasat ve 37 ° C'de 3 dakikadır tutmak Tripsin eylem 1 mL ile Kültür ortamının durdurun. Hücreleri tarafından Santrifüjü at 230 x g ve 4 ° C 5 min için cips, süpernatant kaldırın ve istediğiniz birimin taze kültür ortamının ekleyin.
    Not. İletişim kuralı tüm hücresel türleri için geçerlidir ve seribaşı hücreleri hücre boyutu ve zaman katlama cep bağlıdır.
    Uyarı: Tripsin, antibiyotik ve serum tekrarlanan donma-çözülme çevrimleri için tabi kaçının. Onları steril tutmak. Hisse senedi çözüm aliquots bölmek ve onları dondurma −20 ° C. Aliquots sona erme tarihine kadar saklayın. Dikkatle tripsin tamamen kaldırmak için hücre Pelet durulayın. Artık tripsin izleri gecikme ve kaplama verimliliği azaltır.
  6. Hücreleri saymak ve taze tam kültür orta bir hücre süspansiyon µL başına 500 hücreleri ile elde etmek için 37 ° C'de muhafaza ile bir seyreltme gerçekleştirin.
    Not: Hücre süspansiyon konsantrasyon hücre tipi, bir fonksiyonu olarak bir 40 µL damla plaka için adapte zorunda.
  7. Bir 40 µL damla polikarbonat folyo Merkezi üzerine plaka. Dikkatle 37 derece ° c 2 h ve %5 (v/v) CO2 için örnek bir doymuş su atmosferde yer.
    Kritik: Bir kez örnek da kuluçka makinesine yerleştirilir, mümkün olduğu kadar hızlı hücre eki lehine herhangi bir mekanik hareketi sınırlamak. Hücre tipine göre hücreleri en uygun platting verimlilik için 2 h daha uzun kuluçkaya için gerekli olabilir. Kontrol kuluçka atmosfer iyi buharlaşan dan damla önlemek için doymuş.
  8. Hücreleri iyi bir optik mikroskop kullanarak polikarbonat folyo bağlı olduğundan emin olun. Yavaşça taze tam orta 2 mL ekleyin ve 24 saat tutun.

3. nano tanecikleri hazırlık ve maruz kalma

Not: Floresan boya-modified TiO2 NPs tasarlanmış, sentez ve tetramethyl rodamine isothiocyanate (TRITC) kimyasal olarak değiştirilmiş. 20 , 21 nanopartikül algılama, izleme ve Yerelleştirme in situ ve cellulo içinde yaşayan ve sabit hücreleri veya çok hücreli organizmalar bu yüzey modifikasyonu sağlar. 12 , 13 , 18

Uyarı: Nanomalzemeler ve nano tanecikleri dikkatle ele alınması gerekir. Solunum, sindirim önlemek veya cilt ile temas. Havada yayılması önlemek için nano tanecikleri çözüm (ultrasaf su) korunur.

  1. 1 mg.mL– 1 TiO2 ultrasaf su NPS'de bir süspansiyon hazırlamak. RT yoğun 1-dak sonication darbeleri kullanarak TiO2 NPs dağıtmak (750 W, 20 kHz, genlik: % 30) ultra ses bir jeneratör ve adanmış bir konik microprobe kullanarak.
  2. 4 µg.cm−2 (son konsantrasyonu) bir pozlama askıya almak için TiO2 NPs adlı kültür orta istenen konsantrasyon sulandırmak. Orta içeren NPs hücreleri üzerinde uygun hacmi orta yerine ve TiO2 NPs. hazırlama homojen dağılımını kontrol hücreleri TiO2 NPs ek olmadan benzer şekilde karışımı yavaşça.
  3. Hücre popülasyonlarının 24 h 37 ° C, % 5 (v/v) CO2 ve doymuş su atmosfer için kuluçkaya.

4. paraformaldehyde fiksasyon ve floresan mikroskopisi.

  1. Taze bir çözüm paraformaldehyde çözüm (PFA, % 4 w/v) içinde fosfat tampon tuzlu (PBS, pH 7,4) arabelleğe hazırlayın.
    1. 4 g PFA tozu 100 ml PBS çözülür. Çözüm ila 65 ° C bir mıknatıs ve manyetik karıştırıcı bir duman mahallede kullanarak karıştırma sırasında ısı. PH çözüm temizlenene kadar bir defada 1 M NaOH bir damla ekleyerek artırmak. Oda sıcaklığında çözümü serin ve pH 7.4 için ayarlayın. Taze hazırlanmış çözüm hemen kullanın veya 4 ° C'de almak ve ışıktan korumak.
      Not: İngiltere'de yılın hazırlıksız bir hazırlanması daha fiksasyon kaliteli ve sabit örnekleri uzun vadeli korunması garanti eder ancak önceden yapılmış İngiltere'de yılın çözümleri kullanılabilir.
      Uyarı: İngiltere'de yılın toksik; solunum, sindirim önlemek veya cilt ile temas. Her zaman düzgün işleyen bir kimyasal duman başlık ve uygun filtreler kullanın.
  2. Bir kez, kuluçka süre geçtikten, TiO2 NPs. durulama taze kültür orta ile bir kez ve bir kez PBS (2 mL) ile hücre popülasyonlarının içeren hücre kültür orta kaldırın. PBS kaldırmak için hızlı bir şekilde taze ve soğuk PFA (% 4 w/v, 4 ° C) bir aliquot ile durulayın.
    1. İngiltere'de yılın (2 mL, % 4 w/v, 4 ° C) ekleyin. Oda sıcaklığında 15 dk kuluçkaya.
    2. PFA kaldırmak için PBS (2 mL, 3 kez, 5 min) hücrelerle ajitasyon altında durulayın.
      Durma noktası: Bunlar kimyasal olarak sabit örnekleri-ebilmek var olmak kullanılmış için "Dalma-freeze" yordamı floresan sonra (5 adım git) görüntüleme veya sadece floresan (4.3 adım git) görüntüleme için kullanılan.
  3. PBS 10 min için hücreleri kuluçka Höchst33342 ile çekirdek leke. Hoescht33342 500 son bir konsantrasyon kullanılan nM. Kuluçka sonra çözümü kaldırmak ve PBS ile durulayın.
    Uyarı: Höchst33342 hücre permeant ve toksik olabilir. Doğrudan temas önlemek ve hazırlama ve Höchst33342kullanarak eldiven kullanın.
    Kritik: çözüm boyama Höchst33342 taze hazırlanmış ve steril koşullarda muhafaza emin olun.
  4. İşlem örnekleri in situ ve floresan mikroskobu (şekil 1) kullanarak tek hücre görüntüleme için sabit.

5. "dalma-Dondurma" fiksasyon ve dehidrasyon

  1. Bir alüminyum transfer plaka sıvı azot soğutma tarafından hazırlayın. Mağaza içine bir kutu plaka sıvı azot ile dolu ve plaka yüzeyi üzerinde soğuk azot buharı sıvı korumak.
    Not: Transfer plaka metalik herhangi bir tabak yapılabilir (burada, alüminyum kullanılan) o soğuduktan sıvı azot sıcaklık ve Donma kurutma makinesi örnek odası girebilirsiniz.
    Kritik: Kutuyu mümkün olduğu kadar soğuk levha yüzeyine su buhar biriktirme önlemek için kapalı tutulmalıdır. Hazırlık sırasında plaka üzerinde depolanan örnek nitrojen tarafından kapsanmayan.
  2. Hücre kültürü ortamında bir kez durulama ve sonra iki kez daha, kısaca, steril ve ultrasaf su almak için kalan ekstraselüler tuzları izine kurtulmak.
    Kritik: Medya taze hazırlanmış ve steril koşullarda muhafaza emin olun. 37 ° C'de tüm medya kullanılmadan önce ısı. Durulama (birkaç saniye) çok kısa olmalı ve aşırı sıvı örnekleri üzerinde kısa sürede kaldırıldı.
  3. Dalma-hücreleri dondurma-150 ° c sıvı azot soğutulmuş 2-methylbutane sırasında 30 s ve yer içinde onlar üzerine alüminyum plaka aktarmak. Buraya örnekleri diğer örnekleri hazırlanması sırasında saklayın. Tüm cryofixed olduğu, all-at-donma kurutucuya transfer plaka yerleştirerek once aktarın.
    Kritik: Cryofixation işlemi daha--dan 20 dk yapısal değişiklikleri geçici olarak transfer kutusunda depolanan örnekleri görünmesini önlemek için idare eder değil.
  4. Aşağıdaki dizileri kullanarak örnekleri şeytanibir: 1) 12-24 h (-99 ° C, 10-3 mbar) düşük basınç ve düşük sıcaklık için birincil bir kuruma gerçekleştirmek, sonra 2) en az 24 h plaka sýcaklýðýna artan, ikincil kurutulma aşaması gerçekleştirmek + 40 ° C süre basınç düşük (+ 40 ° C, 10-3 mbar) tutmak.
    Uyarı: Sıvı nitrojen aşırı soğuk ve şiddetli soğuk ısırması veya göz temas üzerine zarar verebilir. Ulaşımına adapte tezgah üst kaplar kullanın ve güvenlik ekipmanları (kriyojenik eldiven, göz ve yüz koruma) giymek.
    Dikkat: 2-Methylbutane çok kolay alevlenebilir. Havadaki zararlı bir kirlenme buharlaşma + 20 ° C'de bu madde üzerinde oldukça hızlı bir şekilde ulaşılabilir Solunum, sindirim önlemek veya cilt ile temas. Nefes ve göz koruması ve koruyucu eldiven kullanın. Her zaman düzgün işleyen bir kimyasal duman başlığı kullan. 4 ° C'de depolanmış olabilir
    Kritik: 2-Methylbutane sıcaklıklar "Dalma-freeze" oturumu sırasında izlemek için uygun bir termometre (-150 ° C) kullanın. 2-methylbutane bir sıvı faz serin tutulması gerekir. Cryofixed örnekleri için ortam atmosfer aktarma sıcaklık artışı veya su buharı örnek yüzeyinde yoğuşma nedeniyle hücre hasarına neden. Buna göre transfer yapılması gereken olabildiğince hızlı şekilde makul (30 s)
    Durma noktası: Cryofixation sonra örnekleri oda sıcaklığında (toz ve nem korumalı) steril ve kuru koşullarda birkaç gün saklanabilir. Dikkatlice örnekler iyi Forseps ile idare ve parafilm ile kapalı steril bir 12-şey plaka koyun. Kurutucu atmosfer kuru için kullanılabilir.

6. nükleer Microprobe analizi

Not: Nükleer Microprobe analiz tamamlayıcı iyon demeti analitik teknikler parçacık x-ışını emisyonu indüklenen (μ-microbeam hattı ile AIFIRA (uygulamalar Interdisciplinaires des Faisceaux d'Ions tr Région Aquitaine), gerçekleştirilmiştir PIXE) ve iletim iyon mikroskobu (μ-STIM) tarama. Tesisin MeV enerji aralığı içinde ışık iyon kirişler teslim 3,5 MV parçacık hızlandırıcı temel alır. 22 , 23

Durma noktası: AIFIRA önerilen deneme bilimsel değerlendirme sonrasında ulusal ve uluslararası takımlar bir ulaşılıyor Bordeaux Üniversitesi ev sahipliğinde bir iyon demeti tesistir.

  1. PEEK örnek sahipleri çift taraflı bant kullanarak apertured bir tabağa bağlayın.
  2. Işın yönüne dik bir dikey düzlemde örnek destekleyen tabak koyun.
  3. Analiz odası kapatın ve analiz odası vakum.
  4. İletim iyon mikroskobu (μ-STIM) tarama
    Not: STIM alan yoğunluğu haritalar hücre hücresel kitle, enerji kaybı dönüştürme sonra kaydetmek için enerji kaybı (µg.cm-2ifade edilir) örnek alan yoğunluğu ile orantılı olduğu gerçeğini yararlanarak kullanılır.
    1. Bir sonda bir boyutu yaklaşık 300 odak düzlemi ile 2 MeV helyum (He+) microbeam kullanmak nm çapındadır ve düşük akıcılık (2000 ions.s-1). Ölçü enerji (tırtıl dedektörü, 25 mm2, 5,4 MeV @ 11 keV enerji çözünürlük), düzlemsel Silisyum dedektörü ile iletilen iyonların yerleştirilen kiriş eksenindeki örnek arkasında.
  5. Parçacık x-ışını emisyonu (μ-PIXE) ve Rutherford gelmekte spektrometresi (μ-KÇY) indüklenen.
    Not: μ-Pixe ve μ-KÇY analizleri miktar alt mikrometre çözünürlüğü ile kimyasal elementlerin ve kayma dağıtımı sağlar.
    1. 1 µm ve tarama çapı aşağı 4 STIM 8 saat ve yaklaşık 100 x 100 µm2tarafından ilgi aynı hücreleri üzerinde odaklanmış bir 1,5 MeV proton (H+) microbeam (50-150 pA) kullanın.
    2. Atomlar bir yüksek çözünürlüklü Si(Li) katı hal dedektörü (145 eV enerji çözünürlük, @Mn-Kα) tarafından (Na ağır) örnek mevcut gelen ışın eksenden 45 ° konumlandırılmış üzerinden yayılan indüklenen X-ray fotonlar toplamak. Tespit edilen foton enerji emitters (örneğin öğesinin Z) ve x-ışını yoğunluğu öğe konsantrasyonu belirlemek için doğasını belirlemek için kullanın.
    3. Aynı anda arka dağınık proton-135 ° silikon bulmak ile toplamak (kısmen tükenmiş dedektörü, 25 mm2, 11 keV 5,4 MeV @ FWHM) gelen parçacıklarının toplam sayısı ölçmek için ve x-ışını yoğunluklarda normalize etmek.
      Kritik: Atomik konsantrasyon miktar için Sertifikalı kalibrasyon standartları topluluğu x-ışını dedektörü yanıt kalibre için kullanılır. Başvuru malzemeleri ince atomik filmlerin 6.3 µm kalınlığında Mylar folyo yatırılır bir koleksiyon bulunmaktadır. Yayılan x-ışını enerji aralığından 0.6 (Li, K line) 20,2 keV (Rh, K satır).

7. veri analizi

  1. IBA-J eklentisi kullanarak ImageJiçin kimyasal temel haritalar yeniden. 24
    Not: ImageJ bir eklenti şeklinde adanmış yazılım ham nükleer microprobe analiz verileri işlemek için geliştirilmiştir. Ham veri olayların kronolojik bir sıra olarak ışın konumunu birlikte kaydedilir hücreleri ile partikül ışını etkileşimi kaynaklanan karşılık gelir.
    1. IBA-J eklenti olayları tipine göre sıralamak için kullanın: iyon enerji (STIM) aktarılan, backscattered iyon enerji (KÇY) ya da x-ışını foton enerji (PIXE). Sonra ayrı ayrı her veri türü işlem.
    2. STIM alan yoğunluğu harita hesaplamak
    3. Ortalama x-ışını foton enerji spectra hesaplamak ve öğe kayma dağıtım almak için ilgi bir enerji pencere kimyasal her öğe için tanımlayın.
    4. Faiz (ROI) (örneğin tek tek hücreler, yoğun yapısı, toplamları, vb) bölgelerinde tanımlamak ve karşılık gelen x-ışını spektrumları hesaplamak.
  2. Olay parçacıklar25toplam sayısını hesaplamak için karşılık gelen KÇY spectra analiz.
  3. X-ışını spektrumları her yatırım Getirisi için öğe konsantrasyonu belirlemek için Gupix yazılım26 kullanarak uygun.
    Not: Tipik algılama (lod olarak) yöntemi için aralığı 1-10 µg.g-1 (LOD Z ile azalıyor) elementlerin atom numarası bağlı olarak kuru kütlesi sınırıdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hücre kültürü ve fluorescently etiketli TiO Floresans görüntüleme 2 NPs

Hücre kültürü, hücre işleme gibi multimodal analiz için uyarlanmış bir örnek sahibi dizayn ettik. Özellikle, sahibi de nükleer microprobe çözümleme ve görüntüleme rutin optik mikroskobu izin önemliydi. Bu örnek sahibi bir göz karede yatırılır 2-µm kalınlığında polikarbonat folyo temel alır. Hücreleri doğrudan polikarbonat, birkaç gün için steril kültür koşullarında yetiştirilen ve NPs pozlama gibi farklı deneysel ayarlar için kullanılır.

Kimyasal yüzey değiştirme fluorophores (TRITC) ile TiO2 NPs yanı sıra onların içinde in situ ve vitro yerelleştirme tespiti oturma veya hücreleri floresan mikroskopi kullanarak sabit paraformaldehyde izin. Hücre çekirdeği ve mitokondri boya hayati Höchst33342 (çekirdek için mavi) ve transfected matris-roGFP (mitokondri yeşil), sırasıyla kullanarak lekeli. Bu birden çok boyama TRITC-TiO2 NPs hücre içi lokalizasyonu (floresan yayan onun kırmızı tarafından) 20 h maruz kaldıktan sonra izin. NPs yalnızca çekirdek içinde hiçbir algılama ile maruz kalan hücrelerin sitoplazma içinde bulundu. NPs rastgele sitoplazma perinükleer bölgede lokalize ve tamamen (Hayır TRITC ve GFP sinyalleri örtüşen) mitokondri hariç.

Floresans mikroskobu NPs maruz kalan hücrelerin içinde yerelleştirmek çok yararlı olsa da, NPs tam sayısı hücre başına değerlendirmek mümkün değildir. Floresans mikroskobu NPs miktar ile ilgili ana zorluk (i) verilen NP ve seçilmiş fluorophore ağartma kararlılığını gözlem sırasında bağlı fluorophores sayısı hakkında belirsizlik bağlandığı ve (ii) NPs hücre içindeki toplama durumu.

Figure 1
Resim 1 : tüp bebek ve yerinde matris-RoGFP ifade U20 transgenik hücrelerinin görüntüleme ve TRITC-TiO için maruz floresan 2 NPs. Höchst33342 ile (mavi), matris-roGFP (yeşil) işaretli U2OS hücreleri (üst) 4 µg.cm-2 TRITC etiketli TiO2 nano tanecikleri için maruz kalan 20 h. (kırmızı) gözlemler o TiO2 NPS'de hücrelerde toplama belirtmek bir perinükleer bölge. Ölçek çubuğu: 10 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Bu eksiklikler, nükleer microprobe analiz techniquesprovide geleneksel optik mikroskobu kullanılması floresan üzerinden bir aşılı gibi ara herhangi bir sinyal, önler onların hassasiyet NPS'ye nedeniyle tamamlayıcı bir yaklaşım üstesinden gelmek için boya. Ayrıca, onlar da tam kantitatif, aksi takdirde bilinmiyor (i alt hücresel biyokimyasal içeriği ve (ii) NPs tek hücre düzeyinde hücre içi miktarı hakkında veri sağlayan vardır.

Cryofixation hücre canlı görüntüleme sonra.

Nükleer microprobe analiz yapmakta yüksek vakum şartlar altında çalışmayı sınırlamadır. Biyolojik ultrastructure korunması ve biyolojik örnek biyokimyasal bütünlüğünü sağlayan bir hücre fiksasyon protokol geliştirdik. Kimyasal fiksasyonu hücresel onların orta yerine gerektirdiğinden hücreleri izleme öğesi kompozisyonu değiştirmek hücresel ultrastructure korumak için kullanılan bir polimer olduğu bilinmektedir. Ayrıca, su kaldırılması da ücretsiz iyonları genel değiştiren diğer türler, serbest bırakmak ve örnek kompozisyon. Bu nedenle, bir fiziksel fiksasyon yöntemi, özellikle kriyojenik yöntemleri öncelik vermeye zorunlu hale gelir. Kriyojenik bu yordamları hücresel hareketlilik ve bu, hızlı kesilmesi milisaniyelik zaman ölçeğinde neden.

Nükleer microprobe analiz mikroskobu ve NPs miktar hücresel ölçekte.

Tarama iletim iyon mikroskobu (μ-STIM) ve x-ışını parçacık kaynaklı emisyon (μ-PIXE) analiz örnekleri üzerinde cryofixation ve dehidratasyon elemental kimyasal bileşimi kesin nicel veriler elde etmek için sonra yapıldı.

Μ-STIM görüntüleri yoğunluğu yerel farklılıkları ortaya koydu ve hücre yapıları çekirdeği ve sitoplazma gibi algılanmasını sağlar. Yoğun bir gözlem ışın yanal çözünürlük sağlar, ancak yapıları 300 nm geniş, benzeri dar toplamları görünür burada içinde sitoplazma ince, STIM yöntemleri NP toplamları ve diğer yoğun hücresel yapılar arasında ayırt edemez. Bunun nedeni gibi transmisyon elektron mikroskobu (TEM), aktarılan enerji değişimi için önde gelen fiziksel gelen ION atom elektron bulut ile etkileşim sürecidir. Tüm hücre cilt analiz edilir çünkü TEM analiz ancak, yerel kalınlığı varyasyonları yüksek-Z yapıları ve hücresel yoğunluk yerel bir artış arasında ayrımcılık engel.

Figure 2
Resim 2 : Yoğunluk ve elemental dağılımı görüntülerini elde µ-STIM ve μ-PIXE cryo-sabit U2OS hücrelerde. U2OS kontrol hücreleri (yukarı) maruz hücrelere (aşağı 4 µg.cm-2 için TiO2 NPs, maruz) cryo-sabit U2OS karşılaştırılır ve nükleer microprobe analiz/mikroskobu kullanarak görülmektedir. STIM mikroskobu (sol, gri tonlamalı haritalar) yoğun içi veya ekstra cellular yapıları (çekirdek, tuz toplamları, nano tanecikleri) açığa. Uzaysal çözünürlüğü (300 nm) floresan mikroskopi için karşılaştırılabilir ve NP agrega gibi yapıları perinükleer bölgede gösterir. Sadece onların yoğunluğu üzerinde temel yapıları tanımlaması yine de belirsiz olabilir. K, P ve Ti (termal renk ölçeği) µ-PIXE temel haritalar µ-STIM haritalar için tamamlayıcı niteliktedir. NPs hücrelerdeki varlığını sağlamak için kullanılabilir. Her hücre ayrı ayrı öğe toplama açısından analiz edilebilir (bkz. şekil 3). Ölçek çubukları: 10 µm. renk ölçekleri aralığı (mavi) en az ve en fazla yoğunluk (gri). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2' de gösterildiği gibi tek tek hücreleri içinde hem bir nüfus ve aynı zamanda çekirdekçik ve çekirdek gibi hücre içi alt bölmeler tanınması µ-STIM işleme sağlar. Ne yazık ki ve daha önce belirttiğimiz gibi NPs her zaman µ-STIM imar kullanarak tespit edilemedi.

X-ışını emisyonu (μ-PIXE) analiz parçacık kaynaklı sadece örnek değil, aynı zamanda onların elemental eşleme (Şekil 2) kimyasal bileşimi sağlar. Heyecan verici ışın ile etkileşimi sırasında kimyasal elementlerin sonunda atom numarası heyecanlı öğesinin karakteristik enerji sergileyen bir foton emisyon neden atomik uyarma-de-uyarma işlemler geçmesi. Bir karakteristik tepe spektrum tüm verilmiş foton olayları toplamı inşa ve kimyasal bir imza örneği olarak kabul edilir.

Standart deneysel kurulumları ve dedektörleri µ-PIXE deneyler için kullanılan tüm öğelerin aynı anda miktar Na bir 1-10 µg.g– 1 kuru kitle algılama sınırı ile daha ağır izin verir. Elemental konsantrasyonları ölçüm doğruluğu genellikle yaklaşık % 20 ücret toplama ve Dedektör verimliliği nedeniyle sınırlıdır.

Bu çalışmada, potasyum ve fosfor gibi ve TiO2 NPs titanyum eşleme ile hücre içi miktarını ölçmek için öğelerin dağıtım göre nükleer microprobe analiz görülmektedir. Fotonlar zamanlama ışın konumda kayıt ve seçimi belirli bir öğenin merkezli bir enerji pencerenin göre sıralanır sonra kimyasal element haritalar hesaplanır. Haritalar ışın konumundaki algılanan olayların sayısını temsilcisi ve nicel vardır. Gürültü ve arka plan sayısal simülasyonu ve filtrelenir. Ayrıca, kimyasal eşleştirmesi miktar için gerekli yerel PIXE spektrum ayıklamak için kullanılabilir.

Şekil 2' de gösterildiği gibi fosfor rastlanılmaması hücresiyle beklendiği gibi dağıtılır kadar yoğun nükleer alanda. Potasyum homojen hücre hacmindeki dağıtılır. Titanyum toplamları, Floresans mikroskobu (şekil 1) kullanarak daha önce gözlenen şeklinde perinükleer sitoplazmik bölgede yer alır. NPs görüntülenen aynı perinükleer yerelleştirme ne olursa olsun onların yüzey durumu: functionalized (şekil 1) veya doğal (Şekil 2). Bu arada, titanyum hiçbir iz µ-PIXE tarafından gözlenen titanyum dağıtım TiO2 NPs, bizim önceki analizlere Floresans mikroskobu ile anlaşarak atfedilen gerekir teyit kontrol hücreleri tespit edildi.

Buna ek olarak, Şekil 2' de gösterildiği gibi NPs hücre içi dağıtım ve nicel NPs konsantrasyonları ilgi belirli bölgelerden ayıklamak mümkündür. STIM haritalar ve fosfor/potasyum dağıtımları ile ilişki içinde dayalı, tek hücre analizi mümkündür.

Figure 3
Şekil 3 : Tek hücre kantitatif analiz µ-PIXE. Şekil 2 ' de gösterilen hücreleri hesaplanan bireysel x-ışını spektrumları hücresel düzeyde öğe konsantrasyonu belirlemek için takılabilir. Bu özellik, nerede hücresel konsantrasyonları genellikle aynı nüfus içinde güçlü varyasyonları göstermek NP analiz için özellikle ilginçtir. Örneğin, için aynı pozlama, 0.2 1.8 µg.cm-2kadar Ti konsantrasyonları aralığından demek. Denetimler için tedavi edilmezse hücre popülasyonlarının karşılık gelir. Maruz kalma doz: 4 µg.cm-2. Öğretici Boxplots ortanca değer (yatay çizgi) ile bireysel hücresel konsantrasyonları dağıtımını temsil ve en düşük ve en yüksek doğru uzanan çubukları ölçülen değerler. Kontrol hücreleri: N = 14; Maruz hücreleri: N = 16.

Buna göre sadece titanyum bir hücre nüfus ortalama içeriği sayılabilir ama aynı zamanda hücre belirli bir deneysel durumda bir nüfus başına titanyum dağıtım gösterilmiştir. Burada ölçülen titanyum medyan içeriği oldukça (500 ng.cm-2) 4 µg.cm-2 maruz kalma doz hücre nüfus (şekil 3) ile karşılaştırıldığında düşük ve çeşididir hücreler arasında büyük (Ti konsantrasyonları arasındadır 0.2 1.8 µg.cm kadar olur -2 göre analiz hücreleri). Ayrıca potasyum ve kalsiyum TiO2 NPs, birden çok yazar tarafından daha önce açıklandığı gibi varlığı ile indüklenen hücresel değişiklik homeostazı düşündüren maruz örneklerdeki gibi hücre içi iyonların bir artış fark ettik. 21 , 27

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Biz ne hücre altı düzeyinde özellikle diğer görüntüleme teknikleri ile mümkündür ötesinde yararlı bilgiler sağlayan bir yöntem açıklanmaktadır. Görüntüleme yeteneğini yanı sıra, nükleer microprobe analiz de miktar biyolojik örnek kompozisyon girerek kimyasal elementlerin olanakları sunuyor. Mevcut çalışmada, biz insan hücre popülasyonlarının okudu ve aşağı seçilen bölge TiO2 için NPs maruz tek bir hücre temel ilgi analiz odaklı. Diğer teknikleri ile onun birlikte morfolojik hücresel görüntüleme ve hassas Nicel veri temel kimyasal kompozisyona sağlar.

Nükleer microprobe analiz başarıyla uygulamak için potansiyel tuzaklar önlemek için aşağıdaki noktaları saygı zorunludur. İlk olarak, onun ultrastructure ve biyokimyasal bütünlüğünü korumak için hücre fiksasyon için kriyojenik protokolünü kullanmaları zorunludur. İkinci olarak, analiz ince örnekleri aşağıda 20 µm kalınlık ile gerçekleştirmek için zorunludur. Gerekirse, cryofixed örnekleri kesit gerçekleştirilebilir. Örnekleri kesinlikle dondurulmuş tutulmalıdır. Üçüncü olarak, nükleer microprobe analiz biyolojik örnekler iki boyutlu bir gösterimini ortaya koymaktadır akılda tutmak önemlidir. Böylece, elde edilen kimyasal element muhtemelen yanlış tanıtmak bir iki boyutlu projeksiyon dağılımıdır. Bu sınırlama gelecekte tomografik edinme kullanımı ile atlanır.

Nükleer microprobe analiz Ayrıca sınırlamalar vardır. Bu onun ana kısıtlaması çözümlemesi vakumaltında gerek olduğunu vurguladı olmalı. Bu nedenle, bu hücre ultrastructure ve biyokimyasal bütünlüğü korur hücre fiksasyon iletişim kuralı kullanmak üzere zorunludur. Bu nedenle kriyojenik yordama (kimyasal reçine ek) olmadan biyolojik örnekler direncini test etmek gereklidir. Bu nükleer microprobe analiz kullanımı sınırı olabilir.

Nükleer microprobe analiz taşımak için İmkanlar için erişilebilirlik başka bir kısıtlamadır. Atanan ışın kez bu nedenle bazen sınırlıdır ve bu zaman alan deney bu tür için ek bir sınırlamadır. Birkaç saat kez bir satın alma için ihtiyaç vardır.

Bu teknik mikroskobu, kütle spektrometresi (MS), İndüktif eşleşmiş plazma MS (ICP-MS), sıvı Kromatografi MS (LC - MS), dahil olmak üzere diğer analitik yöntemleri, farklı ve radyoaktif izotop. İkincisi gerçekten kimyasal elementler hücresel dozunun tahmin etmek için kullanılır ancak yalnızca bir makroskopik bilgileri sağlamak onlar Yani makroskopik bir örnek uzun ölçek. Nükleer microprobe analiz yapar, hassas algılama ve eşleme belirli kimyasal elementlerin hücre altı bir doz, hiçbiri-in onları erişim, verebilir (iyonları, metal veya metal oksit NPs). Bu veriler daha fazla sistematik çalışmanın bir doz-yanıt değerlendirme için erişim yardımcı.

NPs hücrelerdeki içselleştirilmesi okurken doz kesin tahmin her iki nicel NP toksikoloji ve Farmakoloji açılardan önemlidir. Olarak gözlenen NP içeriği, minimum ve maksimum konsantrasyonları (şekil 3) gözlenen arasında 10 kat bir fark gösterir, büyük tutarsızlık tarafından önerilen ortalama hücresel konsantrasyon açıklamak için ilgili bir parametre olmayabilir parçacık pozlama olgusu. İnhomogeneous doz pozlama çelişkili gözlemler açabilir, çünkü yerini almak için bir eşik etkisi gerekirken bu özellikle doğrudur. Nano tanecikleri fraksiyonlara doğası açıkça hücresel düzeyde göründüğü, bu çalışmada bu nedenle tekrar genel değişkenler konusunda davranışı adresleme sorunlarını maruz hücre analizi temelli yöntemleri alaka soru poz veriyor kirletici inhomogeneous dozda.

Burada okudu durumda gösterildiği, gözlem ve NPs miktar tek tek hücreleri içinde metal oksit NPs gibi endojen/eksojen öğeleri biyoakümülasyon daha iyi anlamak sağlamak. Bu kritik bir görev daha da NPs uygulamalarında Biyomedikal, yerde yatan zavallı bir anlayış NP dağıtım hücrelerdeki yanlış yorumlandığını sonuçlara neden olabilir.

Bu iletişim kuralı biyolojik örnekler ile NP etkileşimlerin gelecekteki değerlendirmeler için diğer teknikleri ile nükleer microprobe analizi kullanılarak uygunluğu vurgulamaktadır. Kantitatif yaklaşım böyle NPS'nin tespit, teşhis, Yerelleştirme ve bir tek hücre düzeyinde miktar açısından etkileri hakkında bilgiler sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Serge Borderes yönetmenlik ve video düzenleme için teşekkür ederiz. Fransız Ulusal araştırma ajansı araştırma programı TITANIUMS (ANR CES 2010, n ° CESA 009 01) destekler. CNRS ve entegrasyon etkinlik olarak Avrupa Topluluğu "destek genel ve endüstriyel araştırma kullanarak iyon ışın teknolojisi (ruhu)" EC sözleşme n ° 227012 altında sağlanan. Bu eser EC Sözleşme No 317169 altında Marie Curie eylemleri - bir "entegre etkinlik destekleyen yüksek lisans araştırma ile staj in sanayi ve eğitim Excellence" (SPRITE, D1.3) olarak ilk eğitim ağları (ITN) tarafından desteklenmiştir. C'NANO Grand Sud Ouest ve bölge Aquitaine araştırma programı zehir-NANO (n ° 20111201003) ve araştırma programı POPRA (n ° 14006636-034) destekler.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture
U2OS ATCC, LGC STANDARDS ATCC HTB-96
Medium MCCOY 5A w/o L-Glutamine Dominique DUTSCHER L0211-500
FBS 500 mL Dominique DUTSCHER 500105U
Penicillin/Streptomycin  ThermoFisher Scientific 11548876
 L-Glutamine 200 mM, 100 mL  Invitrogen 25030024
Geneticin,  20 mL ThermoFisher Scientific 10092772
Trypsin-EDTA 0.25% (v/v)  500 mL ThermoFisher Scientific 11570626
Viromer Red Lipocalyx VR-01LB-01
Matrix-roGFP Plasmid AddGene #49437
Hoechst 33342 ThermoFisher Scientific H3570 Handle with care
NPs preparation
TiO2 P25 AEROXIDE Degussa/Evonik
Tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC) SIGMA-ALDRICH T3163 Surface modification of NPs
Sample preparation
Polycarbonate foil Goodfellow CT301020
Polyether Ether Ketone support (PEEK) Matechplast A-239-4047
Ethanol, ACS absolute SIGMA-ALDRICH 02860-6x1L
Chlorform, Anhydrous, 99% SIGMA-ALDRICH 372978-1L  Caution toxic
Formvar 100 g Agar Scientific AGR1201 Harmful. Use in a concentration of 10 µg per mL of chloroform
NaOH SIGMA-ALDRICH S5881-500G
Sample fixation
Powder, 95% Paraformaldehyde SIGMA-ALDRICH 158127-500G Caution toxic. Use as a 4% solution in PBS
PBS (pH 7.4, without Ca2+ and Mg2+) ThermoFisher Scientific 11503387
Prolong Gold Antifade Reagent ThermoFisher Scientific P36934
Triton X-100 SIGMA-ALDRICH 93443 Harmful
Sample cryofixation
Liquid nitrogen air liquids sante Harmful
Methylbutane >=99% SIGMA-ALDRICH  M32631-1L Caution toxic
Aluminium transfer plate Home-made
Distilled and deionized water Home-made Produced in the laboratory using the Barnstead Smart2Pure system
Parafilm VWR 52858-000
Equipment
Barnstead Smart2Pure ThermoFisher Scientific 50129870
Biosafety bench, class II ThermoFisher Scientific MSC-Advantage
TC20 automated cell counter Biorad 145-0102SP
Counting slides 2 wells Biorad 1450016
PIPS detector, 25 mm2, 12 keV energy resolution @5.5 MeV Canberra  PD25-12-100AM
High-resolution Si (Li) solid-state detector,145-eVenergy resolution, @Mn-Kα Oxford Instruments
Everhart-Thornley type secondary electron detector (SED)  Orsay Physics 1-SED
XRF Calibration Standard sodium or Chlorine as NaCl Micromatter 34381
XRF Calibration Standard Magnesium as MgF2 Micromatter 34382
XRF Calibration Standard Aluminium as Al metal Micromatter 34383
XRF Calibration Standard Silicon as SiO Micromatter 34384
XRF Calibration Standard Sulfur as CuSx Micromatter 34385
XRF Calibration Standard Calcium as CaF2 Micromatter 34387
XRF Calibration Standard Titanium as Ti metal Micromatter 34388
XRF Calibration Standard Iron as Fe metal Micromatter 34389
Sonicator 750W Sonics Materials 11743619
3MM microprobe Bioblock scientific 220-05
Lyophilizer in vacuum Elexience EK3147
Optical microscope Zeiss AxioObserver Z1 Carl Zeiss MicroImaging, GmbH 431006-9901
Motorized stage xy Carl Zeiss MicroImaging, GmbH 432031-9902
EC Plan-Neofluar 20X, NA 0.50 Ph2 M27 objective Carl Zeiss MicroImaging, GmbH 420351-9910
Plan-Apochromat 63X, NA 1,40 Ph3M27 objective Carl Zeiss MicroImaging, GmbH 420781-9910
Zeiss filterset 02 Carl Zeiss MicroImaging, GmbH 488002-9901
Zeiss filterset 38HE Carl Zeiss MicroImaging, GmbH 489038-9901
Zeiss filterset 31 Carl Zeiss MicroImaging, GmbH 000000-1031-350
Chemical fume hood Erlab Captair SD321
Particle accelerator HVEE singletron
Software
ImageJ software National Institutes of health, USA ImageJ 1.51
SimNRA software Max-Planck-Institut für Plasmaphysik, Germany SIMNRA 6.06
Gupix software Guelph university, Canada GUPIXWIN 2.2.4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Krug, H. F., Wick, P. Nanotoxicology: An Interdisciplinary Challenge. Angew. Chem. Int. Ed. 50, (6), 1260-1278 (2011).
  2. Van Hove, M. A. From surface science to nanotechnology. Catalysis Today. 113, (3-4), 133-140 (2006).
  3. Le Trequesser, Q., Seznec, H., Delville, M. H. Functionalized nanomaterials: their use as contrast agents in bioimaging: mono- and multimodal approaches. Nanotox. Rev. 2, (2), 125-169 (2013).
  4. Oberdorster, G. Safety assessment for nanotechnology and nanomedicine: concepts of nanotoxicology. J. Int. Med. 89-105 (2009).
  5. Savolainen, K., et al. Nanotechnologies, engineered nanomaterials and occupational health and safety - A review. Saf. Sci. 48, (8), 957-963 (2010).
  6. Savolainen, K., Alenius, H., Norppa, H., Pylkkanen, L., Tuomi, T., Kasper, G. Risk assessment of engineered nanomaterials and nanotechnologies - A review. Toxicol. 269, (2-3), 92-104 (2010).
  7. Arora, S., Rajwade, J. M., Paknikar, K. M. Nanotoxicology and in vitro studies: The need of the hour. Toxicol. . Appl. Pharm. 258, (2), 151-165 (2012).
  8. Donaldson, K. Resolving the nanoparticles paradox. Future Med. 1, (2), 229-234 (2006).
  9. Schaumann, G. E., et al. Understanding the fate and biological effects of Ag- and TiO2-nanoparticles in the environment: The quest for advanced analytics and interdisciplinary concepts. Sci Total Environ. 535, 3-19 (2014).
  10. Olesik, J. W. Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometers. Treatise on Geochemistry. Elsevier Ltd. (2014).
  11. Krystek, P. A review on approaches to bio-distribution studies about gold and silver engineered nanoparticles by inductively coupled plasma mass spectrometry. Microchem. J. 105, (November 2011), 39-43 (2012).
  12. Le Trequesser, Q., et al. Multimodal correlative microscopy for in situ detection and quantification of chemical elements in biological specimens. Applications to nanotoxicology. J .Chem. Biol. 8, (4), 159-167 (2015).
  13. Le Trequesser, Q., et al. Single cell in situ detection and quantification of metal oxide nanoparticles using multimodal correlative microscopy. Anal. Chem. 86, (15), 7311-7319 (2014).
  14. Ackermann, C. M., Lee, S., Chang, C. J. Analytical Methods for Imaging Metals in Biology: From Transition Metal Metabolism to Transition Metal Signaling. Anal. Chem. 89, (1), 22-41 (2017).
  15. Legin, A. A., et al. NanoSIMS combined with fluorescence microscopy as a tool for subcellular imaging of isotopically labeled platinum-based anticancer drugs. Chem. Sci. 5, 3135 (2014).
  16. Lanni, E. J., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Mass spectrometry imaging and profiling of single cells. J. Proteomics. 75, (16), 5036-5051 (2012).
  17. Waypa, G. B., et al. Hypoxia triggers subcellular compartmental redox signaling in vascular smooth muscle cells. Circ. Res. 106, (3), 526-535 (2010).
  18. Dooley, C. T., et al. Imaging Dynamic Redox Changes in Mammalian Cells with Green Fluorescent Protein Indicators. J. Biol. Chem. 279, (21), 22284-22293 (2004).
  19. Hanson, G. T., et al. Investigating Mitochondrial Redox Potential with Redox-sensitive Green Fluorescent Protein Indicators. J. Biol. Chem. 279, (13), 13044-13053 (2004).
  20. Chen, X., Mao, S. S. Titanium dioxide nanomaterials: Synthesis, properties, modifications and applications. Chem. Rev. 107, (7), 2891-2959 (2007).
  21. Simon, M., Barberet, P., Delville, M. H., Moretto, P., Seznec, H. Titanium dioxide nanoparticles induced intracellular calcium homeostasis modi fi cation in primary human keratinocytes. Towards an in vitro explanation of titanium dioxide nanoparticles toxicity. Nanotox. 5, (June), 125-139 (2011).
  22. Sorieul, S., et al. An ion beam facility for multidisciplinary research. Nucl. Instr. Meth. Phys. Res., B. 332, 68-73 (2014).
  23. Barberet, P., et al. First results obtained using the CENBG nanobeam line: Performances and applications. Nucl Instr Meth Phys Res B. 269, (20), 2163-2167 (2011).
  24. Devès, G., et al. An ImageJ plugin for ion beam imaging and data processing at AIFIRA facility. Nucl. Instr. Meth. Phys. Res. B. 348, 62-67 (2015).
  25. Mayer, M. SIMNRA User's Guide, Report IPP 9/113. Max-Planck-Institut für Plasmaphysik. Garching, Germany. (1997).
  26. Campbell, J. L., Boyd, N. I., Grassi, N., Bonnick, P., Maxwell, J. A. The Guelph PIXE software package IV. Nucl. Instr. Meth. Phys. Res. B. 268, (20), 3356-3363 (2010).
  27. Yu, K., Chang, S., Park, S. J., Lim, J., Lee, J. Titanium Dioxide Nanoparticles Induce Endoplasmic Reticulum Stress-Mediated Autophagic Cell Death via Mitochondria- Associated Endoplasmic Reticulum Membrane Disruption in Normal Lung Cells. PLoS ONE. 1-17 (2015).
<em>Situ</em> Algılama ve Metal Oksit nano tanecikleri nükleer Microprobe analizi ile tek hücre miktar
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Muggiolu, G., Simon, M., Lampe, N., Devès, G., Barberet, P., Michelet, C., Delville, M. H., Seznec, H. In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis. J. Vis. Exp. (132), e55041, doi:10.3791/55041 (2018).More

Muggiolu, G., Simon, M., Lampe, N., Devès, G., Barberet, P., Michelet, C., Delville, M. H., Seznec, H. In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis. J. Vis. Exp. (132), e55041, doi:10.3791/55041 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter