Summary
人間の死後脳から軟膜外植片培養プロトコルは6-8週間以内にフィブロネクチン陽性髄膜線維芽細胞を導出し、約20から30000000細胞を凍結保存するための技術的に堅牢かつ簡単な方法です。
Abstract
大きな進歩は、パーキンソン病の臨床的特徴付けてなされたものであっても、いくつかの研究は、パーキンソン病の診断は病理学的に、臨床的に診断されたパーキンソン病の25％までで確認されていないことを報告しています。したがって、特発性パーキンソン病と臨床的に診断された患者から採取した組織は、誤診率の高さを持つことができます。したがって、前臨床モデルとして、パーキンソン病を研究するために、このような組織からのin vitro試験で無駄になることができます。
パーキンソン病の確認神経病理学的診断と死後の人間の軟膜を収集し、黒質線条体細胞損失およびレビー小体と呼ばれる細胞内タンパク質封入体によって特徴づけられることで、1は、臨床的に観察されたパーキンソニズムは、他の基礎疾患プロセス（ 例えば、腫瘍、動脈硬化症）によって引き起こされていないことを確信することができます。
このプロトコルPRESEN髄膜線維芽細胞培養の導出のための死後の人間の軟膜の解剖と準備TS。この手順は、堅牢であり、高い成功率を有します。脳の調達は、一般的に無菌条件下で行われていないとして、文化の課題は、無菌性です。従って、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびアンホテリシンBのカクテルで培地を補充することが重要です
パーキンソン病の剖検で確認例から髄膜線維芽細胞の導出は、パーキンソン病のin vitroモデル化のための基盤を提供します。髄膜線維芽細胞は3-9日、試料調製後に表示され、約20〜30万個の細胞を6〜8週間で凍結保存することができます。髄膜線維芽細胞培養物は、均質であり、細胞は、フィブロネクチン、髄膜を識別するために一般的に使用されるマーカーを発現します。
Introduction
硬膜、くも膜と軟膜：髄膜は脳を保護する3膜で構成されています。より最近には、髄膜も脳の発達と脳のホメオスタシス1で重要な役割を果たすことが認識されています。髄膜は、間葉系および神経堤由来細胞から誘導され、興味深いことに、髄膜内に存在する前駆細胞は、in vitroおよびin vivo 2、3、4 における移植後の神経細胞を生じさせることができることが示されています。それらはドーパミン作動性ニューロン5に、胚性幹細胞の分化のための間質細胞由来誘導活性を有するような髄膜培養物はまた、成功裏に、フィーダー層として使用されてきました。また、軟膜は直接虚血状態6の下で、ニューロン、アストロサイト、およびオリゴデンドロサイトに分化する能力を持っています。
このプロトコルでは、人間の死後髄膜サンプルをまとめて、くも膜と軟膜から収集された軟膜と呼ばれ、研究目的のために人間の脳の寄付金の一部として調達されています。脳の解剖死の24時間以内に行われ、このプロトコルでここに示されているように軟膜サンプルは、次の6~8時間以内にさらなる処理のために冷増殖培地中に置かれます。
このプロトコルは、患者の一次軟膜細胞培養の開発のための解剖と人間の髄膜試料の調製を記載します。組織は、約3ミリメートル×3ミリメートルの正方形の25-30片に切断されています。三枚は各6ウェルに配置されたゼラチンでコーティングされたウェルと丸いガラスカバースリップでダウンして開催されました。髄膜切開は、約25-35分かかります。この文化の主な課題は、脳の調達、輸送、および解剖などの無菌性は、一般的に無菌条件下で行われていないです。 Therefore、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびアムホテリシンBのカクテルで培地を補足し、別々に培養組織片にマルチウェルディッシュを使用することが重要です。
髄膜線維芽細胞の増殖は、最初の週以内に通常発生します。細胞がコンフルエントになるまで培地を2〜3日ごとに変化させ、細胞を酵素的に継代します。髄膜線維芽細胞は、凍結保存培地mLの/バイアルあたり100万個の細胞で凍結保存します。このプロトコルでは、20から30000000髄膜線維芽細胞は、凍結保存のため6-8週間で導出することができます。これらの髄膜線維芽細胞の下流のアプリケーションが、疾患の研究、直接神経分化または病気のメカニズムの理解のため、および薬物開発のための軟膜から誘導された多能性幹細胞の誘導のための一次培養物です。
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Protocol
脳の寄付登録が寄付する意思の登録者によってドキュメントが含まれています。法律で認められているように、組織の検索のために剖検許可は近親者により提供されます。収集した剖検標本を用いた調査研究は、医療保険の携行性と責任に関する法律（HIPAA）規制の遵守を確保するために、治験審査委員会（IRB）によって検討されています。
注：軟膜試料は脳解剖中脳切開または神経病理学者によって収集され、25〜30 mLの髄膜増殖培地を含有する50mLのコニカルチューブに格納されています。試料は、試料調製まで4℃で保存します。細胞の生存率は、時間死後と減少する処理が可能な限り早く行われるべきです。
1.セットアップ軟膜解剖を開始する前に
注：1.1ステップ - 1.3は、生物学的安全キャビネットの内部で実行されるべきです。
- ダルベッコ改変イーグル培地、ウシ胎仔血清を100mLの375ミリリットルを組み合わせることにより、髄膜増殖培地を準備し、5 mLの10 mMの非必須アミノ酸、5 mLの200 mMのL-アラニル-L-グルタミン、5mlの100mMのピルビン酸ナトリウム、 5mLの万U / mLのペニシリン/ストレプトマイシンおよび5 mLの250 / mlのアムホテリシンBを500mLのフィルターユニットです。フィルタと混ぜます。 4週間までのメディアを使用してください。
- 解剖を開始する前に、バイオセーフティキャビネット内のすべての材料を配置する：4倍ペトリ皿、2×6ウェルプレート、2倍メス、15-20滅菌15 mmのカバースリップ、ピペットを吸引するリン酸緩衝生理食塩水（PBS）、血清学的ピペット、。
- 6ウェルプレートの各ウェルに滅菌オートクレーブ0.1％ゼラチン溶液1mLを加えます。 30〜60分間脇にプレートを設定します。 2×6ウェルプレートを準備します。
軟膜サンプルの調製
注：2.1ステップ - 2.3は、生物学的安全キャビネットの内部で実行されるべきです。
- にPBSの約10 mLを加え滅菌10 cmの組織培養皿と皿に髄膜サンプルを配置します。鉗子を使用して、静かに血液を除去するためにPBSで軟膜を洗います。
- 新鮮な10mLのPBSを含む新しい10-cmの組織培養皿に髄膜を移し、洗浄を続けます。できるだけ多くの血液を除去するために、必要に応じて繰り返します。
- 2メスを使用して、X 6センチメートル約6センチメートルに大部分を軟膜の組織を切断します。
- 培養皿と水平層流フード内で解剖顕微鏡への転送の上に置いて蓋。
軟膜組織の3解剖
注：3.1手順 - 3.3解剖顕微鏡を使用して、水平層流フード内で実行されます。
- 少なくとも20-25 3ミリメートル×3ミリメートルの作品を作成するのに十分な大き軟膜ピース（ステップ2.3）上の領域から血管を削除します。 1メスでの場所で軟膜を持ち、他に、穏やかな浅い掻きカ月を使用ションは、血管を分離します。
- 準備された領域から組織の小さな正方形をカット。最初の大きい作品を作り、その後、小さなセクションにそれらをスライスして、段階的プロセスでカットします。
- 揺動運動と組織を切断する代わりに、組織と別のメスを保持するために1メスを使用してください。組織の一貫性のために、互いに対してメスをスライドすることは困難です。これは離れて組織を引き裂くとギザギザのエッジになります。
- 約20〜25 3ミリメートル×3ミリメートル片が存在するまで、半分に作品を切断続けます。
組織培養プレート上に解剖髄膜個の4譲渡
注：ステップ4は、生物学的安全キャビネットの内部で行われるべきです。
- （ステップ1.3から）6ウェルプレートから吸引除去ゼラチン。各ウェルに、髄膜増殖培地の1 mLを加え。滅菌ピンセットを用いて、各ウェルに3-4生検片を配置します。
Mの上カバースリップの5配置eninges小品
注：5.1手順 - 5.2解剖顕微鏡を使用して、水平層流フード内で実行されます。
- ウェル当たり1-2滅菌15-mmの円形カバースリップで作品をカバーしています。
- 片がプレートの底に触れていることを確認するために鉗子でしっかりと押し下げます。これは、井戸の底に組織片の付着を可能にします。
- 37℃、5％CO 2インキュベーターに6ウェルプレートに置き。
6.細胞培養のメンテナンス
注：6.1ステップ - 6.3は、生物学的安全キャビネットの内部で実行されるべきです。カバースリップは、髄膜片を移動させ、取り除くべきではないよう注意して培養皿を扱います。
- 文化の中で2日後、各ウェルに新鮮な髄膜増殖培地の追加の1 mLを加え。
- 7日目に、慎重にメディアを吸引し、各ウェルに新鮮な培地の2 mLを加え。
- 9日後、増殖培地毎に変化し続けます文化まで、他の日は、コンフルエントになります。
7.継代
注：すべてのステップは、生物学的安全キャビネットの内部で実行されるべきです。髄膜線維芽細胞は、髄膜組織片の外に移行し、より大きな培養皿に髄膜線維芽細胞を、培養容器の縁に向かって成長拡大を開始した後。
- 継代を開始する前に、コート15-30分間1％ゼラチンで培養皿。
- 6ウェル皿から培地を吸引し、2mLのPBSで細胞を洗浄。
- 各ウェルにトリプシン/ EDTAを1 mLを加え、5〜10分間37℃でインキュベートします。カバースリップまたはこのステップの髄膜組織を除去する必要はありません。
- 細胞は丸みを帯びていると、デタッチ培地2mLのを追加して起動すると。
- ピペット細胞最大とまでは完全にすべての塊を破壊し、より大きな培養皿に細胞溶液を移します。
- 三6ウェル皿から細胞を結合するために4：1〜3：1の比率を使用し1 T75培養皿に。
- 髄膜線維芽後細胞を、細胞をトリプシン処理、T75培養フラスコ中でコンフルエントに、バイアル当たり1×10 6細胞/ mlで凍結保存培地中で凍結保存します。コンフルエント髄膜線維芽細胞の一つのT75培養フラスコは、約5〜7万個の細胞が含まれています。
免疫染色により髄膜線維芽細胞の8キャラクタリゼーション
注：手順を開始する前に、4％パラホルムアルデヒド溶液を調製し、PBS中の5％正常ヤギ血清（ブロッキング緩衝液）、0.3％トリトンX-100 PBS（透過化緩衝液）、一次および二次抗体溶液中で、およびを1μg/ mLでのヘキスト33342は、10mg / mLのストックからPBSで希釈しました。
- 0.1％ゼラチンでコーティングした8ウェルチャンバースライドに15,000〜30,000髄膜線維芽細胞をシード。
- 細胞が付着している場合、24時間後、室温で10分間、ウェルあたり100μLの4％パラホルムアルデヒドで細胞を固定します。 1×PBSでウェルを3回洗浄。
- 室温で5分間、0.3％トリトンX-100150μlで細胞を透過性。 1×PBSでウェルを3回洗浄。
- 室温で1時間ブロッキング溶液200μL（PBS + 5％正常ヤギ血清）を加えます。
- ブロッキング溶液を吸引除去し、ブロッキング溶液中に希釈し、所望の一次抗体の150μLを追加します。二重染色のために、次のように氷上で別々の遠心分離管中の一次抗体の作業希釈液を準備します。
- 抗フィブロネクチン+ 1の300倍希釈液：ブロッキング溶液中の抗ネスチンの200倍希釈を準備します。抗SERPINH1 + 1の250倍希釈液：ブロッキング溶液中の抗TUJ1 1,000希釈1を準備します。抗SERPINH1 + 1の250倍希釈液：ブロッキング溶液中の抗SOX2 100希釈の1を準備します
- 4℃で一晩インキュベートします。
- 1×PBSでウェルを3回洗浄。
- 抗ウサギ（緑ヤギ二次抗体を蛍光標識の400希釈; EX /エム2：作業1を準備します2 617分の590 nm）をブロッキング溶液中で、各ウェルに100μLを追加します。室温、暗所で1時間インキュベートします。その後、1×PBSで一回、ウェルを洗浄します。
- 各ウェルへの解決策を、3分間、暗所でインキュベートし; 100を1μg/ mLのヘキスト33342のμL（例/エム2 461分の358 nmの青に）を追加します。ウェルの最終1×PBS洗浄に残して、1×PBSでウェルを3回洗浄し、アルミ箔でスライドをカバーしています。
- 蛍光顕微鏡下で細胞を分析します。
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Representative Results
軟膜の処理プロトコルが成功したときに、これは脳のための死後変化の長さに依存することができますが、髄膜線維芽細胞の増殖は最初、3〜9日切開後に観察されます。 図1は、4つの異なるドナーの髄膜線維芽細胞培養物を示しています。 図1Aは、4日10時間20分の死後変化と88歳のドナーからの処理後の組織の周りにガラスカバースリップ（ダーク対角線）および線維芽細胞成長によって押し下げ軟膜部分を示しています。 図1Bは、70歳のドナーと11時間45分死後変化から疎な線維芽細胞成長7日後の処理を示しています。 図1Cは、13日88歳のドナーと24時間死後変化から切開後の線維芽細胞の伸長を示しています。 図1Dは、T75ヴェスに継代したコンフルエント文化を示していますE1および細胞は、この段階で凍結保存することができます。
髄膜線維芽細胞は双極または多極であり、細長くているか、不規則な形状（ 図2）。これらは、小胞体（ 図2A-2C）に局在している糖タンパク質、フィブロネクチンおよび線維芽細胞マーカーSERPINHの発現によって特徴づけられます。髄膜線維芽細胞は、未分化幹細胞（ 図2A）のマーカーである転写因子SRY（セックスが決定領域Y）-box 2（SOX2）への免疫反応性でありません。しかし、軟髄膜線維芽細胞のサブセットは、VI型中間径フィラメントであるネスチン、神経幹細胞マーカー（ 図2B）、およびニューロン特異的クラスIIIのβ-チューブリン（TUJ1）（ 図2C）について陽性です。
図1。4人の異なるドナーからの髄膜線維芽細胞の伸長の例。 A）軟膜の組織片は、組織の周りにガラスカバースリップ（ダーク対角線）および線維芽細胞成長によって押されて4日10時間20分の死後変化と88歳のドナーからの処理後に観察されました。 70歳のドナーと11時間45分死後変化からB）スパース性線維芽細胞成長7日後に処理。 C）13日88歳のドナーと24時間死後変化から解剖後の髄膜線維芽細胞成長。 D）コンフルエント髄膜線維芽細胞培養は、T75容器に継代しました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2. Immunost髄膜ためaining、細胞、神経幹細胞、ニューロンマーカー幹。線維芽細胞マーカーA）免疫蛍光染色SERPINH1（緑）、細胞マーカーSOX2（赤）を生じます。 SERPINH1をすべて数え細胞核中で発現させました。幹細胞マーカーSOX2これら軟膜培養では検出されませんでした。髄膜特異的マーカーのフィブロネクチン（緑）、神経幹細胞マーカーであるネスチン（赤色）のためにB）免疫蛍光染色。カウント細胞核の52.1パーセントは、ネスチンおよびフィブロネクチンの両方に対して陽性でした。 SERPINH1用C）免疫蛍光染色（緑）、ニューロンのマーカーTUJ1（赤）。カウント核の6.9％はSERPINH1とTUJ1陽性でした。細胞計数データは、ImageJの上に手動細胞カウンター複数選択ツールを使用して決定しました。単一染色された画像は、パーセントで各マーカーについて陽性の細胞の数と比較して、DAPI陽性細胞の数を計数することによって評価しました。痩せ細った ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 日 | 期待される結果 | |||||
| 3-9 | 最初の髄膜線維芽細胞の突起伸長。 | |||||
| 7-18 | 髄膜線維芽細胞は展開し、文化がより密になります。 2 mLの一日おきの培地交換。 | |||||
| 18-25 | （：1〜3：1で通路4）髄膜線維芽細胞がコンフルエントである後6ウェルプレートをT75培養フラスコ中に3つのウェルを組み合わせ、コンフルエントになります。 | |||||
| 26から45 | 5から7000000細胞における一つのコンフルエントT75培養フラスコをもたらします。 100万細胞/バイアルで髄膜線維芽細胞を凍結保存。 | |||||
タブル1：携帯伸長のタイムライン。
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Discussion
このプロトコルは、脳の寄付金と合わせて採取したヒト死後の軟膜から髄膜線維芽細胞培養を導出するためのシンプルかつ堅牢なプロトコルを記述します。死後の人間の材料から細胞培養物を導出するプロトコルの非常にいくつかの説明があります。二つの研究は、皮膚由来線維芽細胞培養物7を説明する 8、9、一つの研究は、硬膜サンプル10について説明し 、他は非凍結保存された冷凍硬膜サンプル11について説明しています。
私たちは、凍結保存の前に十分な成長と拡大を確実にするために、各ウェル中の2-3組織片（約3mm×3 mm）の持つ2つの6ウェルプレートを準備します。髄膜片を所定の位置にそれらを保持するために組織片の上に滅菌ガラスカバースリップを押すと穏やかことにより、培養皿に付着していることが重要です。カバースリップすることなく、髄膜片がNOますトンは、培養皿の底に付着します。組織片は、プラスチック底と直接接触しているときに成功した伸長にのみ観察されます。組織片を培地に浮遊した場合、組織からの細胞の成長は観察されません。これは、サンプルを乾燥した後、容器に増殖培地の1 mLにならないために、約500μLの成長のメディアで実行する必要があります。さらに、所定の位置にカバースリップを保持するためにシリコーンを使用する必要はありません。
片×3 mm 3でmMより小さい場合、成長は遅くなり、場合によっては何のコンフルエントな培養物を確立することができません。あまりにもまばらな細胞を増殖しないことが重要であり、我々は1のスプリット比をお勧めします：3〜1：4。個々の小さなウェルは、より良い管理汚染の可能性を可能にします。ウェルズは、個別に供給することができ、ピペットをウェル間で変更する必要があります。
我々が正常にpoで9死後サンプルから髄膜線維芽細胞を導出しました10-24時間の間隔をstmortem。ドナーは、年齢の70〜88歳であったと8月31日年の間にパーキンソン病の疾患の持続時間を有します。私たちは、最初の細胞は（9日まで）うちに成長する前に長い死後変化と組織は時間がかかることがわかります。短い死後変化を有する試料では、我々はできるだけ早く3日、調製後のような伸長を観察します。我々は、ドナーの年齢に基づいて成長の違いを気づいていないが、我々は唯一の> 70歳のドナーを持っていました。
この方法の重要性は、現在、剖検12で確認することができるパーキンソン病、13 のような散発性神経変性疾患のための初代細胞培養物の誘導である14ない完全に臨床的特徴、イメージング技術または缶のバイオマーカーが定義されていないので人生15の間に明確な診断を提供します。我々は以前DEVEを持っています主に私たちは、人工多能性幹細胞を生成し、病気のメカニズム17、18を研究するために許可されているパーキンソン病16の遺伝的に確認された場合の皮膚生検からの線維芽細胞の誘導のためのプロトコルをlopedが、この新しいプロトコルは、直接神経病理学的変化を比較することが非常に重要になります孤発性パーキンソン病のin vitroでの知見と。我々の知る限り、これは死後の人間の軟膜から髄膜線維芽細胞を誘導する最初のプロトコルです。
髄膜線維芽細胞培養物を直接疾患または損傷に関連する分子メカニズムを研究するために、または人工多能性幹細胞又は散発性パーキンソン病または他の神経変性障害19のための高度な前臨床モデルとしてニューロン培養物に直接変換に核初期化のためのソースとして使用することができます。これらのHU男性患者由来のモデルは、基盤を提供し、パーソナライズされた再生医療の進歩を加速させます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corning Petri dishes | Fisher Scientific | 351029 | |
| Nunc 6-well plate | Fisher Scientific | 14-832-11 | |
| 15-mm cover slips | Fisher Scientific | 12-545-83 15CIR-1D | |
| Scalpels, sterile blade, No. 15 | Miltex | 4-415 | |
| Curved precision tip forceps | Fisher Scientific | 16-100-122 | |
| Serological pipettes | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 22-230490 | |
| Gelatin | Sigma | G1890-100G | |
| Phosphate Buffer Saline | Fisher Scientific | SH30264.02 | |
| Corning 500 mL filter unit | Fisher Scientific | 430770 | Combine media components and filter. |
| Nunc Cell Culture Treated Flasks with Filter Caps, T175 cm2 | Thermo Scientific | 178883 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Growth Media | |||
| Hyclone DMEM | Fisher Scientific | SH30081.02 | |
| Hyclone FBS | Fisher Scientific | SH30910.03 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| GlutaMAX Supplement (100x) | Thermo Fisher | 35050-061 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Thermo Fisher | 11360-070 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Amphotericin B (Yellow Solution/250 µg/mL) | Fisher Scientific | BP264520 | |
| Bambanker Freeze 120 mL | Fisher Scientific | NC9582225 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibronectin Staining | |||
| 8 well chamber slides | Fisher Scientific | 1256518 | |
| 20% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15713 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| 100% Glycerol | BioRad | 9455 | |
| 100% normal goat serum | Fisher Scientific | 101098-382 | |
| Anti-Fibronectin antibody [F1] | Abcam | ab32419 | 1:300 dilution in blocking solution |
| Anti-SERPINH1 | Sigma | S5950-200ul | 1:250 dilution in blocking solution |
| Anti-SOX2 | Millipore | MAB4343 | 1:100 dilution in blocking solution |
| Anti-Nestin | Millipore | MAB5326 | 1:200 dilution in blocking solution |
| Anti-TUJ1 | Covance | MMS-435P | 1:1,000 dilution in blocking solution |
| Alexa Fluor 488 anti-rabbit | Thermo Fisher | A11029 | 1:400 dilution in blocking solution; (green channel; Ex/Em2 495/519 nm) |
| Alexa Fluor 555 anti-mouse | Thermo Fisher | A21424 | 1:400 dilution in blocking solution; (red channel; Ex/Em2 590/617 nm) |
| Hoechst 33342 stain | Thermo Fisher | H3570 | dilute to a final concentration of 1.0 μg/mL; (blue channel; Ex/Em2 358/461 nm) |
| Suppliers are suggestions, similar products from alternative vendors can be used as well. | |||
References
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