Cell-libero DNA analisi di integrità nei campioni di urina

Abstract

Anche se la presenza di circolante DNA libero-cellule nel plasma o nel siero è stato ampiamente dimostrato di essere una fonte adeguata di biomarcatori per molti tipi di cancro, alcuni studi si sono concentrati sul potenziale utilizzo del DNA dell'urina cell-free (UCF). A partire dalle ipotesi che le normali cellule apoptotiche producono DNA molto frammentato e che le cellule tumorali rilasciare più il DNA, il ruolo potenziale di integrità del DNA UCF è stata valutata come un marker diagnostico precoce in grado di distinguere tra i pazienti con prostata o il cancro della vescica e individui sani.

Un'analisi integrità UCF DNA viene proposta sulla base di quattro PCR quantitativa in tempo reale su quattro sequenze più lunghe di 250 bp: c-MYC, BCAS1, HER2, e AR. Sequenze che hanno spesso un aumento del numero di copie di DNA nei tumori della vescica e della prostata sono stati scelti per l'analisi, ma il metodo è flessibile, e questi geni potrebbero essere sostituiti con altri geni di interiposo. Il potenziale utilità di UCF DNA come fonte di biomarcatori è già stata dimostrata per neoplasie urologiche, aprendo così la strada a ulteriori studi sulla caratterizzazione UCF DNA. Il test di integrità del DNA UCF ha il vantaggio di essere non invasiva, rapida e facile da eseguire, con pochi millilitri di urina necessari per effettuare l'analisi.

Introduction

-Free Cell DNA può essere rilevato nel sangue e nelle urine causa di morte cellulare da meccanismi apoptotici o necrotiche. DNA libero-Cell nel sangue è stata ampiamente studiata per scopi diagnostici e prognostici in varie malattie, in particolare il cancro ^1. Tuttavia, meno si sa circa il ruolo del DNA urinario cell-free (UCF). UCF DNA può provenire da passaggio di sangue attraverso il sistema di filtrazione glomerulare o da cellule che entrano direttamente in contatto con questo corpo fluido ² (ad esempio, cellule uroteliali o cellule prostatiche). L'uso di UCF DNA come fonte di biomarker è stato principalmente studiato per la diagnosi precoce di renale, della vescica, della prostata e cancro a causa dell'elevata percentuale di UCF DNA proveniente direttamente dalle cellule del tratto urinario ^3,4.

Poco si sa circa UCF DNA ed i migliori metodi per isolare e caratterizzare esso. Dato l'ipotesi che le cellule tumorali rilasciano frammenti di DNA più lunghi rispetto alle cellule normali, la valutazionedell'integrità DNA cell-free è stato studiato in un tentativo di chiarire l'origine del DNA nella circolazione sanguigna ^5. Alcuni studi hanno dimostrato che cell-free integrità del DNA nel sangue rappresenta un buon test diagnostico per molti tipi di cancro ^6, e la stessa ipotesi è stata proposta in relazione agli urine ^7-9.

Questo documento descrive un nuovo metodo per UCF DNA analisi di integrità di una potenziale applicazione per il rilevamento del cancro della vescica e della prostata. In particolare, l'integrità del DNA UCF frammenti più di 250 bp è stato testato in 4 regioni note per avere un maggior numero di copie di DNA nei tumori solidi, tra cui la prostata e tumore della vescica: c-Myc (8q24.21), HER2 (17q12.1 ), BCAS1 (20q13.2), e AR (Xq12) ^10-14. oncogeni specifici, piuttosto che sequenze casuali, sono stati scelti per aumentare la probabilità di trovarle frazione priva di cellule di pazienti affetti da cancro. Uno dei principali vantaggi diquesto metodo è che è flessibile e che altre regioni può essere selezionato sulla base del tipo di tumore e caratteristiche.

Protocol

Il protocollo segue le linee guida del Comitato Etico umana ricerca IRST.

NOTA: In questo protocollo, abbiamo isolato il DNA da campioni di urina per eseguire un'analisi di integrità UCF DNA. LNCaP e cellule MRC linee sono stati utilizzati per costruire gli standard. Tecniche come l'estrazione del DNA, la quantificazione del DNA (spettrofotometro e real-time PCR per il gene di controllo, STOX1), e real-time PCR per oncogeni specifici sono stati eseguiti (Figura 1).

1. urina raccolta e lavorazione

1. Ottenere un clean-cattura di prima mattina campione di urina in un bicchiere pulito, asciutto, di plastica. Raccogliere almeno 50 ml del campione di urina.
2. Mantenere l'urina a 4 ° C per un massimo di 3 h ed inviarlo al laboratorio alla stessa temperatura.
3. Mescolare ogni campione invertendo due volte immediatamente dopo l'arrivo in laboratorio e il trasferimento in due tubi di polipropilene a fondo conico da 50 ml.
4. Centrifugare le provettea 850 xg per 10 min a 4 ° C oa temperatura ambiente.
5. Trasferire accuratamente 10 mL della parte superiore del surnatante urine in due provette da 5 mL, lasciando almeno 2 mL del supernatante sopra il pellet di cellule.
   NOTA: Trasferire la parte superiore del surnatante riduce il rischio di contaminazione da cellule o detriti cellulari. Non c'è una chiara demarcazione tra la parte superiore e quella inferiore.
6. Eliminare il pellet e congelare immediatamente il surnatante a -80 ° C fino al momento dell'uso.

2. Isolamento del DNA dal surnatante delle urine e linee cellulari

NOTA: Isolare il DNA da una linea cellulare (ad es, LNCaP per cancro alla prostata o MRC per il cancro della vescica) utilizzando un kit commerciale e seguendo le istruzioni del produttore. Isolamento del DNA dal surnatante urine deve essere eseguita utilizzando il protocollo commerciale, modificato come segue:

1. Scongelare un'aliquota del surnatante urine a temperatura ambiente. </ Li>
2. Vortex e mescolare il campione di urina e trasferire 1 ml di surnatante urina in un chiaro tubo da 5 mL. Congelare l'urina residua a -80 ° C.
3. Aggiungere 100 ml di proteinasi k direttamente al campione.
4. Aggiungere 1 ml di tampone AL al campione e mescolare bene pipettando.
5. Chiudere le provette e incubare i campioni a 56 ° C per 15 min.
6. Durante l'incubazione, preparare una colonna per ogni campione e preparare i tamponi di lavaggio, AW1 e AW2, come da istruzioni del produttore (aggiungere l'importo indicato di 100% di etanolo).
7. Portare i campioni a temperatura ambiente e aggiungere 1 ml di etanolo assoluto. Mescolare completamente pipettando.
8. Aggiungere 650 microlitri della miscela ottenuta nello stadio 2.7 alla colonna e centrifugare a 6000 xg per 1 min.
9. Eliminare il tubo contenente il flow-through e posizionare la colonna su un nuovo, tubo di raccolta pulito. Ripetere i punti 2.8 e 2.9 fino a quando tutta la miscela campione è stato utilizzato (5 volte).
10. Aggiungere 500 &# 181; L di tampone AW1 senza bagnare il bordo della colonna. Centrifugare a 6000 xg per 1 min.
11. Eliminare il tubo contenente il flusso continuo e sostituirla con una nuova, tubo di raccolta pulita.
12. Aggiungere 500 microlitri di tampone AW2 senza bagnare il bordo della colonna. Centrifugare alla massima velocità (20.000 xg) per 3 min.
13. Eliminare il tubo contenente il flusso continuo e sostituirla con una nuova, tubo di raccolta pulita.
14. Ripetere il passaggio 2.12 per rimuovere eventuali residui di tampone di lavaggio.
15. Porre la colonna in una provetta pulita da 1,5 ml. Aggiungere 50 ml di tampone di eluizione AE e attendere 7 minuti per garantire che le bagna tampone colonna.
16. Centrifugare a 8000 xg per 1 min.
17. Pipettare il eluente dal punto 2.15 nel mini-colonna e centrifugare alla massima velocità per 1 min per garantire il massimo recupero di DNA.

3. DNA Quantificazione e diluizione

1. Utilizzando uno spettrofotometro, eseguire la quantificazione di DNA da both la linea cellulare ei campioni di urina supernatante. Utilizzare 2 ml di campione su uno spettrometro da banco, come da istruzioni del produttore.
2. Diluire i campioni UCF DNA per ottenere una concentrazione di 1 ng / ml e conservare il DNA a -20 ° C fino all'analisi integrità del DNA.
   NOTA: Se la quantità di DNA non è sufficiente procedere con PCR in tempo reale (almeno 100 ng), eseguire un nuovo processo di isolamento del DNA.
3. Diluire il DNA da campioni di linee cellulari di ottenere sei standard con differenti concentrazioni: 0,001, 0,01, 0,1, 1, 0,5 e 2 ng / ml, ciascuno con un volume di 100 microlitri (ST1, ST2, ST3, ST4, ST5, e ST6). Conservare le norme DNA linea cellulare a -20 ° C fino all'analisi integrità del DNA.

4. DNA Integrity Test - PCR

1. Scongelare i primer (la concentrazione dipende dal tipo di test), Supermix verde, standard nel DNA delle cellule-line, e campioni di DNA UCF diluito su ghiaccio.
2. Preparare le provette strip nella piastra Fo il disco di rotore 72 pozzetti. Aliquota 10 ml in duplicato per ciascuno standard e campione diluito e 10 ml di acqua RNase-free per il controllo negativo.
3. Preparare una miscela di 1 ml di ciascun primer (le concentrazioni sono riportati in Tabella 1), 12,5 ml di Supermix verde, e 6,5 ml di acqua priva di RNasi per ogni campione. Nel preparare la miscela, utilizzare il seguente numero di campioni: 6 standard per 2 repliche, numero di campioni per 2 repliche, controllo negativo per 2 repliche, e 2 campioni in più.
4. Aliquota 15 ml della miscela in ciascun pozzetto. Non pipetta o girare i tubi.
5. Avviare il protocollo con le condizioni di PCR indicati nella tabella 1.
   NOTA: Per il valore UCF DNA, 29 campioni di DNA sono stati trattati per ciascun esperimento in tempo reale utilizzando il disco rotore 72-bene: 29 x 2 campioni + 6 x 2 + standard negativo di controllo x 2 = 72 (valore UCF DNA).
   NOTA: Il protocollo per l'analisi di integrità UCF DNA può anche essereeseguita utilizzando un altro strumento real-time PCR (quando si utilizza un altro dispositivo, colorante ROX potrebbe essere necessario aggiungere).

5. DNA Integrity Test - Analisi dei dati e interpretazione

NOTA: Il valore UCF DNA per ciascun campione è stata ottenuta con un sistema software strumento di rilevamento in tempo reale utilizzando una costruzione curva standard per ogni singola valutazione gene PCR e mediante interpolazione curva standard, come descritto in precedenza ^7-9 (Figura 2).

1. Valutare le repliche; campione replica con una differenza ≥1 Ct deve essere scartata e ri-valutato in un secondo esperimento.
2. Calcolare la mediana Ct per ogni campione e prendere in considerazione campioni con un valore Ct ≤ 36.
3. Valutare la specificità dei prodotti di PCR utilizzando l'analisi di fusione.
4. Valutare la concentrazione di ogni amplicone per interpolazione con la curva standard; ottenere un valore di concentrazione (ng / mL) per ogni amplicone.

Representative Results

La concentrazione totale di DNA libero era quantificabile mediante spettrometria per tutti i campioni analizzati, che mostra un intervallo compreso tra 1,51 e 138 ng / ml. Cinque campioni di controllo sono stati utilizzati per la riproducibilità dei dati: due esperimenti in tempo reale indipendenti sono stati eseguiti per c-myc, HER2, BCAS1, AR, e STOX1. I coefficienti di variazione (CV) sono stati poi calcolati per ciascun gene (Tabella 2), con un buon grado di riproducibilità tra i due esperimenti indipendenti (Tabella 2).

La sequenza STOX1 125-bp è stata analizzata per escludere la presenza di inibitori della PCR. Se i campioni presentavano un'amplificazione STOX1, il test di integrità UCF DNA è stata eseguita. Una mancanza di amplificazione ha fatto sì che la quantità di DNA non era sufficiente per eseguire il test di integrità UCF DNA, che indica la necessità di ripetere tegli analisi con una nuova raccolta delle urine. Poiché non vi sono poche informazioni disponibili su l'amplificazione o la cancellazione di STOX1 nel cancro della vescica e della prostata, questo gene potrebbe essere usato come una sequenza di controllo per questi tipi di tumore. Infine, la valutazione dell'integrità UCF DNA è stata eseguita sommando i valori ottenuti per i tre oncogeni (Figura 3).

L'uso della somma dei geni c-MYC, HER2, e BCAS1 è stato proposto per il rilevamento del cancro della vescica ^9, mentre c-MYC, AR, e HER2 sono stati suggeriti per il cancro alla prostata ^7,8. I migliori valori di cut-off individuati per la vescica e il rilevamento del cancro alla prostata sono 0,1 ng / ml e 0,04 ng / ml, rispettivamente. L'utilizzo di questi valori di cut-off, una sensibilità del 73% e una specificità del 84% sono stati ottenuti nel rilevare il cancro alla vescica rispetto a individui sintomatici, mentre il 58% di sensibilità e il 44% specificalità sono stati osservati nel rilevare il cancro alla prostata rispetto ai pazienti con malattie del tratto urogenitale benigne ^7-9. In conclusione, il test di integrità UCF DNA è flessibile, per cui i geni utilizzati nel presente studio potrebbe essere sostituito con altre sequenze lunghe di interesse, a seconda della malattia.

Figura 1. urine DNA libero-Cell integrità del flusso di lavoro e Timeline. Il flusso del metodo è diviso in diverse fasi e tempi. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Relazione per il c-myc Amplicon Analysis. Un esempio di analisi di fusione, plot di amplificazioneE curva standard sono riportati per la valutazione c-MYC. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. UCF DNA Integrità Analisi del flusso di lavoro. è riportato un semplice flusso di lavoro per l'analisi integrità del DNA UCF. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Gene	sequenza di riferimento	forward Primer	Primer retromarcia	Lunghezza Amplicon (bp)	Protocollo in tempo reale
MYC (c-myc) (V-Myc aviaria Myelocytomatosis Viral Oncogene Homolog, locus 8q24.21)	NG_007161.1	TGGAGTAGGG ACCGCATATC	CCCAACACCA CGTCCTAAC	264	95 ° C per 3 minuti seguito da 45 cicli a 94 ° C per 40 secondi, 56 ° C per 40 secondi e 72 ° C per 1 minuto.
ERBB2 (HER2) (Erb-B2 recettore della tirosin-chinasi 2, locus 17q12.1)	NG_007503.1	CCAGGGTGTT CCTCAGTTGT	TCAGTATGGC CTCACCCTTC	295
BCAS1 (Carcinoma della mammella Amplified Sequence 1, locus 20q13.2)	NC_000020	GGGTCAGAGC TTCCTGTGAG	CGTTGTCCTG AAACAGAGCA	266
AR (Recettore degli androgeni, locus Xq12)	NG_009014.2	AGCCCAGGTT CTCTCCTGAT	TGGCTAGTC CTCAGCTT	265
STOX1 (Storkhead Box1, locus 10q21.3)	NG_012975.1	GAAAACAGG GCAGCAAGAAG	CAGACAGCAT GGAGGTGAGA	125	95 ° C per 90 secondi seguiti da 45 cicli a 94 ° C per 40 secondi e 54 ° C per 1 minuto.

Tabella 1. Primer sequenze e il dosaggio condizioni.

Campione	HER2		CV (%)	BCAS1		CV (%)	c -MYC		CV (%)	AR		CV (%)	STOX1		CV (%)
	Repli-cate 1 *	Repli-cate 2 *		Repli-cate 1 *	Repli-cate 2 *		Repli-cate 1 *	Repli-cate 2 *		Repli-cate 1 *	Repli-cate 2 *		Repli-cate 1 *	Repli-cate 2 *
1	0.0	0.0		0.1	0.1	3.4	0.1	0.1	14.0	0.6	0.5	29.1	0.6	0. 8	4.5
2	2.6	2.7	2.3	0.0	0.0	0.0	0.9	1.5	28.6	0.1	0.1	22.0	2.6	3.0	6.1
3	0.4	0.2	17,0	0.1	0.1	5.9	2.6	3.2	11.6	0.0	0.0	0.0	0.7	1.2	23.1
4	0.0	0.0	NE	1.1	1.0	3.0	NE	0.0	NE	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	NE
5	2.5	3.1	9.8	0.1	0.1	14.0	NE	0.0	NE	0.1	0.0	27.1	0.0	0.0	NE

Tabella 2. Real-time PCR riproducibilità per ogni gene.
* I risultati riportati in ng / mL
CV, coefficiente di variazione; NE, non valutabili

I geni per l'integrità del DNA UCF	Disalleviare	Malati di cancro (n)	I controlli (n)	Tagliare (ng / mL)	Tasso di sensibilità (95% CI)	Tasso di specificità (95% CI)	Riferimento
MYC HER2 BCAS1	Cancro alla vescica	52	46 soggetti sintomatici 32 individui sani	0.1	0,73 (0,61-0,85)	0,83 (0,72-0,94)	Casadio V et al. 2013 9
MYC HER2 BCAS1	Cancro alla prostata	29	25 individui sani	0.04	0,79 (0,62-0,90)	0,84 (0,65-0,94)	Casadio V et al. 2013 8
c-myc AR BCAS1	Cancro alla prostata	67	64 pazienti con malattie benigne del tratto urogenitale	0.04	0,58 (0,46-0,73)	0,44 (0,30-0,58)	Salvi S et al. 2015 7

Tabella 3. Sintesi dei risultati ottenuti per la diagnosi precoce della prostata e della vescica tumori.

Discussion

UCF analisi dell'integrità del DNA è un nuovo metodo, non invasivo per valutare l'integrità del DNA nelle urine. E 'stato recentemente proposto per la diagnosi precoce della vescica e della prostata ^{9 7,8.} Un certo numero di vantaggi e svantaggi del test di integrità del DNA UCF sono discussi qui, insieme con le prospettive future.

Il principale vantaggio del metodo è che offre un metodo non invasivo e poco costoso un semplice protocollo per studiare l'urina come potenziale fonte di biomarker, richiede solo una conoscenza di base di tecniche di biologia molecolare. Il test è veloce da eseguire, ed i risultati, disponibili dopo giorni di lavoro 2 (Fig. 1), può facilmente essere interpretata senza l'aiuto di un medico. Composto da solo i processi di isolamento del DNA e 2 PCR in tempo reale, l'approccio ha anche un buon rapporto costi-benefici. In termini di precisione, UCF integrità del DNA ha elevata sensibilità (73%) e specificità (84%) nella rilevazionecancro della vescica in pazienti sintomatici ^9. Infine, il metodo è flessibile, ed i geni proposte può essere facilmente sostituito con altri geni di interesse, purché siano più di 250 bp.

Il test ha anche un numero di limitazioni. In primo luogo, il metodo di quantificazione spettrofotometrica DNA è spesso imprecisa e potrebbe essere sostituita con altri più precisi, approcci, fluorimetrica (ad esempio, qubit o PicoGreen). La qualità del DNA è anche piuttosto scarsa, come dimostrano i frequenti basse 260/280 e 260/230 rapporti. Inoltre, in uno dei nostri studi, molto bassa specificità (44%) è stata osservata in pazienti con cancro della prostata rispetto a pazienti con malattie benigne del tratto urogenitale ^7, che era probabilmente un risultato benigni cellule necrotiche infiammatorie rilasciano più DNA intatta nella circolazione. Questa è una questione critica, perché entrambi i pazienti affetti da cancro alla prostata e gli individui con malattie benigne possono avere una componente infiammatoria nella loro ucellule rinary. Così, nel contesto della diagnosi precoce del cancro alla prostata, i risultati di una analisi di integrità UCF DNA potrebbe essere fuorviante.

UCF integrità del DNA è stata valutata in 314 campioni di urina di pazienti con cancro alla prostata o alla vescica, individui sani e sintomatici, e pazienti con malattie benigne del tratto urogenitale. Uno studio prospettico su una serie di casi più ampia è necessaria per definire meglio il ruolo di questo approccio come un marker diagnostico precoce per i tumori del tratto urogenitale.

Anche se poco è stato pubblicato sul tema della UCF DNA come fonte di biomarcatori per il cancro, l'interesse in questo settore è in aumento. Recentemente, Togneri et al. ⁴ pubblicato un interessante in cui il DNA cell-free estratto dal supernatante urine di pazienti affetti da cancro alla vescica ha mostrato un carico tumorale genoma superiore a quella del DNA cellulare isolato dal pellet urine, suggerendo che lo studio della frazione acellularedel DNA nelle urine potrebbe essere utile per caratterizzare i tumori urologici.

Nella nostra esperienza, il test di integrità del DNA UCF non ha dimostrato di essere un buon test diagnostico precoce per il cancro alla prostata. Al contrario, ha mostrato potenziale come marker per la diagnosi precoce del cancro della vescica quando usato in combinazione con la citologia convenzionale urina. Uno studio di conferma in uno studio prospettico caso di serie più grande è attualmente in fase di progettazione.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
QIAamp DNA Mini Kit	Qiagen	51304
iQ SYBR Green Supermix, 100 x 50 µL rxns, 2.5 mL (2 x 1.25 mL)	Biorad	1708880
IDT custom DNA oligos	IDT		HPLC purification, 100nMole DNA oligo
NanoDrop 1000 Spectrophotometer	Thermo Scientific		Other spectrophotometric methods could also be used to quantify DNA
Rotor-Gene 6000	Corbett		Another Real Time PCR instrument could also be used
microcentrifuge
one centrifuge for 50 mL tubes
incubator
-80 °C freezer
-20 °C freezer
10 μL pipette
20 μL pipette
200 μL pipette
1,000 μL pipette
pipette tips (10; 20; 200; 1,000)
1.5 mL tubes
50 mL tubes
15 mL tubes
Rotor-Disc 72 Rotor	Corbett	9018899
Strip Tubes and Caps, 0.1 mL (250)	Qiagen	981103
Collection Tubes (2 mL)	Qiagen	19201
Buffer AL (264 mL)	Qiagen	19075
Proteinase K (10 mL)	Qiagen	19133