Cellfritt DNA Integrity analys i urinprov
Summary
A method for analyzing DNA integrity in the cell-free supernatant fraction of urine samples is proposed. The method is suitable for early detection of urological malignancies and has proven accurate for the early diagnosis of bladder cancer.
Abstract
Även om närvaron av cirkulerande cellfria DNA i plasma eller serum har i stor utsträckning visat sig vara en lämplig källa för biomarkörer för många typer av cancer, har få studier fokuserat på den potentiella användningen av urin cellfri (UCF) DNA. Utgående från de hypoteser som normala apoptotiska celler producerar mycket fragmenterat DNA och att cancerceller släppa längre DNA, potentiella roll UCF DNA integritet utvärderades som en tidig diagnostisk markör kan särskilja mellan patienter med prostatacancer eller blåscancer och friska individer.
En UCF DNA integritet analys föreslås på grundval av fyra kvantitativa realtid PCR av fyra sekvenser längre än 250 bp: c-MYC, BCAS1, HER2, och AR. Sekvenser som ofta har en ökad DNA-kopietal i urinblåsan och prostatacancer valdes för analysen, men metoden är flexibel, och dessa gener kan vara substituerade med andra gener av integreresten. Den potentiella nyttan av UCF DNA som en källa för biomarkörer har redan visats för urologiska maligniteter, vilket banar väg för fortsatta studier på UCF DNA karaktärisering. UCF DNA integritetstest har fördelen av att vara icke-invasiv, snabb och enkel att utföra, med endast ett fåtal milliliter urin behövs för att utföra analysen.
Introduction
Cellfria DNA kan detekteras i blod och urin beroende på celldöd genom apoptotiska eller nekrotiska mekanismer. Cellfria DNA i blodet har i stor utsträckning studerats för diagnostiska och prognostiska ändamål i olika sjukdomar, särskilt cancer 1. Men mindre är känt om den roll som urincellfria (UCF) DNA. UCF DNA kan härröra från blod som passerar genom glomerulär filtreringssystem eller från celler som kommer direkt i kontakt med denna kroppsvätska 2 (t.ex. urotelceller eller prostataceller). Användningen av UCF-DNA som en källa för biomarkörer har huvudsakligen undersökts för den tidiga diagnosen av njur-, urinblåsa och prostata cancer på grund av den höga andelen UCF-DNA som kommer direkt från urinvägsceller 3,4.
Lite är känt om UCF DNA och de bästa metoderna för att isolera och karakterisera det. Med tanke på den hypotesen att tumörcellerna släpper längre DNA-fragment än normala celler, utvärderingenav cellfria DNA-integritet har studerats i ett försök att klarlägga ursprunget för DNA i blodcirkulationen 5. Vissa studier har visat att cellfria DNA-integritet i blod utgör en bra diagnostiskt test för många typer av cancer 6, och samma hypotes har föreslagits i förhållande till urinen 7-9.
Detta dokument beskriver en ny metod för UCF DNA integritet analys med en potentiell ansökan till urinblåsan och upptäckt av prostatacancer. I synnerhet integritet UCF DNA-fragment längre än 250 bp testades i 4 regioner kända för att ha en ökad DNA kopietal i solida tumörer, inklusive prostata och cancer i urinblåsan: c-MYC (8q24.21), HER2 (17q12.1 ), BCAS1 (20q13.2), och AR (Xq12) 10-14. Specifika onkogener, snarare än slumpmässiga sekvenser, valdes för att öka sannolikheten för att hitta dem i den cellfria fraktionen av cancerpatienter. En av de viktigaste fördelarna meddenna metod är att den är flexibel och att andra regioner kan också väljas på grundval av tumörtypen och egenskaper.
Protocol
Representative Results
Discussion
UCF DNA integritet analys är en ny, icke-invasiv metod för att bedöma DNA integritet i urin. Det har nyligen föreslagits för tidig diagnos av urinblåsan 9 och prostatacancer 7,8. Ett antal fördelar och nackdelar med UCF DNA integritetstest diskuteras här, tillsammans med framtidsutsikter.
Den främsta fördelen med metoden är att det erbjuder ett billigt, icke-invasiv metod och ett enkelt protokoll för att studera urin som en potentiell källa till biomarköre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Gráinne Tierney and Silvia Bellissimo for their editorial assistance.
Materials
| QIAamp DNA Mini Kit |
Qiagen | 51304 | |
| iQ SYBR Green Supermix, 100 x 50 µl rxns, 2.5 ml (2 x 1.25 ml) | Biorad | 1708880 | |
| IDT custom DNA oligos | IDT | HPLC purification, 100nMole DNA oligo | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | Other spectrophotometric methods could also be used to quantify DNA | |
| Rotor-Gene 6000 | Corbett | Another Real Time PCR instrument could also be used | |
| microcentrifuge | |||
| one centrifuge for 50 ml tubes | |||
| incubator | |||
| -80°C freezer | |||
| -20°C freezer | |||
| 10 ul pipette | |||
| 20 ul pipette | |||
| 200 ul pipette | |||
| 1000 ul pipette | |||
| pipette tips (10;20;200;1000) | |||
| 1,5 ml tubes | |||
| 50ml tubes | |||
| 15 ml tubes | |||
| Rotor-Disc 72 Rotor | Corbett | 9018899 | |
| Strip Tubes and Caps, 0.1 ml (250) | Qiagen | 981103 | |
| Collection Tubes (2 ml) | Qiagen | 19201 | |
| Buffer AL (264 ml) | Qiagen | 19075 | |
| Proteinase K (10ml) | Qiagen | 19133 |
References
- Francis, G., Stein, S. Circulating Cell-Free Tumour DNA in the Management of Cancer. Int.J.Mol.Sci. 16 (6), 14122-14142 (2015).
- Bryzgunova, O. E., Laktionov, P. P. Extracellular Nucleic Acids in Urine: Sources, Structure, Diagnostic Potential. Acta Naturae. 7 (3), 48-54 (2015).
- Szarvas, T., et al. Deletion analysis of tumor and urinary DNA to detect bladder cancer: urine supernatant versus urine sediment. Oncol.Rep. 18 (2), 405-409 (2007).
- Togneri, F. S., et al. Genomic complexity of urothelial bladder cancer revealed in urinary cfDNA. Eur.J.Hum.Genet. , (2016).
- Zonta, E., Nizard, P., Taly, V. Assessment of DNA Integrity, Applications for Cancer Research. Adv.Clin.Chem. 70, 197-246 (2015).
- Hao, T. B., et al. Circulating cell-free DNA in serum as a biomarker for diagnosis and prognostic prediction of colorectal cancer. Br.J.Cancer. 111 (8), 1482-1489 (2014).
- Salvi, S., et al. Urine Cell-Free DNA Integrity Analysis for Early Detection of Prostate Cancer Patients. Dis.Markers. 2015, 574120 (2015).
- Casadio, V., et al. Urine cell-free DNA integrity as a marker for early prostate cancer diagnosis: a pilot study. Biomed.Res.Int. 2013, 270457 (2013).
- Casadio, V., et al. Urine cell-free DNA integrity as a marker for early bladder cancer diagnosis: preliminary data. Urol.Oncol. 31 (8), 1744-1750 (2013).
- Salvi, S., et al. Circulating cell-free AR and CYP17A1 copy number variations may associate with outcome of metastatic castration-resistant prostate cancer patients treated with abiraterone. Br.J.Cancer. 112 (10), 1717-1724 (2015).
- Ishkanian, A. S., et al. High-resolution array CGH identifies novel regions of genomic alteration in intermediate-risk prostate cancer. Prostate. 69 (10), 1091-1100 (2009).
- Oxley, J. D., Winkler, M. H., Gillatt, D. A., Peat, D. S. Her-2/neu oncogene amplification in clinically localised prostate cancer. J.Clin.Patho. 55 (2), 118-120 (2002).
- Nord, H., et al. Focal amplifications are associated with high grade and recurrences in stage Ta bladder carcinoma. Int.J.Cancer. 126 (6), 1390-1402 (2010).
- Tabach, Y., et al. Amplification of the 20q chromosomal arm occurs early in tumorigenic transformation and may initiate cancer. PLoS One. 6 (1), e14632 (2011).
