Introduction
على مدى العقود القليلة الماضية، المصفوفة خارج الخلية (ECM) أصبح معترف بها بوصفها بيئة متنوعة ودينامية، والمعقدة التي تشارك في عمليات الخلية الفسيولوجية والمرضية متعددة. على مستوى الأنسجة، وECM تؤثر إشارات الخلية، والحركة، والتمايز، الأوعية الدموية، بيولوجيا الخلايا الجذعية، تكون الأورام، والتليف، الخ 1،2. دراسة منظمة ECM والعمليات التي تعتمد على ECM وبالتالي له آثار واسعة لبيولوجيا الخلية وعلم وظائف الأعضاء الأنسجة. من أجل التوصل إلى فهم الآلية من تكوين ECM، والتنظيم، والخصائص الفنية، مطلوبة طرق لعزل دقيقة من ECM. في حين أن أقرب تحديد البروتينات ECM الاعتماد عليها بمعزل عن الأنسجة 3، أصبح إعداد ECM من الخلايا المستزرعة الآن أكثر انتشارا.
عزل وتحليل ECM المستمدة من الخلايا معقدة لسببين رئيسيين. أولا، وجود خلايا ويمكن أن الأشعة تحت الحمراء البروتينات داخل الخلايا وفيرة تجعل من الصعب عزل ECM كهيكل خارج الخلية منفصلة. في الواقع، بعض البروتينات ECM لها أدوار داخل الخلية وكذلك في ECM 4؛ وبالتالي، فإن إزالة فعالة من البروتينات داخل الخلايا من ECM المستمدة من الخلية الحيوية إذا كانت دراسة البروتينات داخل ECM لا ينبغي الخلط بينه وبين أدوارهم داخل الخلية. ثانيا، يتكون ECM المستمدة من خلية العديد من الكبيرة والبروتينات بلازميدة قليلة القسيمات، التي غالبا ما تكون عبر ربط على التجمع ECM تساهميا وبالتالي فهي غير قابلة للذوبان في المنظفات القياسية. هذه الخصائص يمكن أن يعقد استخراج وتحليل مزيد من ECM. لمعالجة هذه القضايا، لا بد من طريقة تمكن الفصل الفعال للبروتينات ECM من المكونات الخلوية.
وقد وصفت العديد من الطرق في الأدب لعزل ECM إما من زراعة الخلايا أو الأنسجة مقتطفات. وتهدف العديد من هذه الطرق في استخراج العلاقات العامة ECM وفيرةotein، الكولاجين، من أنسجة وتشمل استخدام أملاح محايدة 3، الظروف الحمضية 5،6، أو البيبسين 7. عزل ECM إجمالي مقتطفات من الأنسجة غالبا ما ينطوي على decellularization من الأنسجة قبل عزل ECM. على سبيل المثال، فقد وصفت طريقة الاستخلاص المتسلسل الذي يعزل ECM من أنسجة القلب الإنسان 8. أولا، تم استخراج البروتينات ECM ملزمة فضفاضة مع 0.5 M كلوريد الصوديوم قبل كبريتات الصوديوم دوديسيل (SDS) كان يستخدم لإزالة الخلايا. وأخيرا، تم استخراج البروتينات ECM المتبقية باستخدام 4 M غوانيدين 8. ECM يمكن أيضا أن تذوب من العينات decellularized باستخدام 8 M اليوريا 9. تقنيات أخرى تستخدم المنظفات، مثل حمض deoxycholic 10، لاستخراج كل من الخلايا وECM قبل فصل البروتينات ECM غير قابلة للذوبان من الخلايا المحللة للذوبان عن طريق الطرد المركزي.
طريقة لعزل وتحليل ECM المستمدة من الخلية المذكورة في هذا التقرير يوفر إعدادها في صورة جاهزةطريقة ducible لإزالة المواد خلية، وترك ECM المستمدة من الخلايا التي يمكن تحليلها من قبل في المناعي الموقع أو المستخرجة لمزيد من التحليل الكيميائي الحيوي. ويمكن تكييف هذه الطريقة لأي نوع من الخلايا الملتصقة ويمكن زيادتها لإجراءات المصب، مثل immunoblotting أو قياس الطيف الكتلي، أو الاستفادة من ECM معزولة في الدراسات الفنية. ويمكن أيضا استخدام أسلوب بالتزامن مع الفحص المجهري متحد البؤر الخلايا الحية لتعقب ترسب ECM من البروتين الموسومة الفائدة في الوقت الحقيقي. ويتحقق ذلك من خلال استخدام طبق الشبكية، القاع الزجاجي. وعموما، يوفر نهج العزلة دقيقة من ECM المستمدة من الخلايا، وكذلك مجالا لتحديد ورصد ترسب وديناميكية من البروتينات ECM الفردية.
Protocol
1. إزالة الخلايا مع الأمونيوم هيدروكسيد الحل
- إعداد خلايا منتسب بواسطة الطلاء على الكثافة المناسبة.
ملاحظة: هذه الخلايا يمكن أن يكون أي نوع من الخلايا الملتصقة التي تنتج ECM كافية للتحليل. هنا، نحن تصف استخدام COS-7 الخلايا، قرد الأخضر الكلى مثل الخلايا الليفية خط الخلية الأفريقي الذي يحتوي SV-40 تسلسل الحمض النووي الفيروسي. RCS، خط الفئران خلايا غضروفية. أو طبيعية الخلايا الليفية الجلد البشري (اتش دي اف) سلالات من القلفة الأحداث. تستخدم HDF من مرور 1 إلى مرور 8 فقط.- لوحة الخلايا coverslips على لتصوير الخلايا الحية وECM، للدراسات مضان المجهر من ECM ثابت، أو لإعداد ECM المستمدة من الخلايا لفحوصات وظيفية على نطاق صغير. لوحة الخلايا على أطباق زراعة الخلايا لتحليل SDS-PAGE، طخة مناعية، أو دراسات البروتينات.
ملاحظة: إن الظروف ثقافة الخلية (عدد الخلايا لوحة ومستنبت) تعتمد على نوع من الخلايا. فإن عدد الخلايا إلى لوحة تحتاج إلىتنشأ تجريبيا للخط خلية معينة أو سلالة الخلية. - السماح الوقت المناسب للخلايا أن تودع ECM، وعادة> 16 ساعة. ملاحظة: إن الفترة الزمنية تعتمد على نوع من الخلايا، وسوف تحتاج إلى أن تحدد تجريبيا. إذا كان إجراء التعبير خارج الرحم، إتاحة الوقت المناسب للتعبير عن البروتين transfected من الفائدة ولترسب ECM.
- لوحة الخلايا coverslips على لتصوير الخلايا الحية وECM، للدراسات مضان المجهر من ECM ثابت، أو لإعداد ECM المستمدة من الخلايا لفحوصات وظيفية على نطاق صغير. لوحة الخلايا على أطباق زراعة الخلايا لتحليل SDS-PAGE، طخة مناعية، أو دراسات البروتينات.
- في هود النازع، إعداد 20 ملي الأمونيوم هيدروكسيد في سفينة مناسبة عن طريق تمييع الحل الأوراق المالية 14/01 مع H دي المتأينة 2 O.
- إزالة الخلايا من الحاضنة وبلطف إزالة مستنبت. إضافة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) دون الكالسيوم 2+ / المغنيسيوم 2+ بصب بلطف على جدران الطبق. صخرة الطبق مرتين وإزالة السائل مع نقل ماصة بلاستيكية. كرر مرتين أكثر.
- في غطاء محرك السيارة مستخرج، إمالة كل طبق وإزالة برنامج تلفزيوني من الخطوة 1.2 مع نقل ماصة بلاستيكية. إضافة 3مل من هيدروكسيد الأمونيوم في صحن 100 ملم واحتضان لهم في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. خلال فترة الحضانة 5 دقائق، تستنهض الهمم بلطف طبق كل دقيقة لضمان تحلل من جميع الخلايا. كما سيتم تنفيذ الخطوات 1،4-1،7 في غطاء محرك السيارة مستخرج.
وتشمل إزالة الخلايا البديلة الكواشف 2 M أو 8 M اليوريا، التي حضنت مع الخلايا لمدة 10 دقيقة: ملاحظة. - إضافة كميات وفيرة من دي المتأينة H 2 O إلى كل طبق، لا يقل عن 20 مل لكل طبق 100 ملم، مع هزاز. التخلص من الأمونيوم هيدروكسيد بالفاعلات المواد التي تتألف من هيدروكسيد الأمونيوم، والخلايا هي lysed، والمتأينة H 2 O-بواسطة الشفط مع ماصة نقل. نقل هذا الحل النفايات في حاوية للنفايات السائلة.
- غسل طبقة ECM غير قابلة للذوبان في غزير دي المتأينة H 2 O أربع مرات أكثر لضمان إزالة كاملة لجميع المواد هيدروكسيد الأمونيوم بالفاعلات.
- لفحص ECM المناعي، وتحديد ECM بإضافة 2٪بارافورمالدهيد (منهاج العمل، 3 مل في صحن 100 ملم) في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
تحذير: PFA غير خطرة جدا في حالة الجلد أو العين الاتصال والتعرض المفرط الحاد يمكن أن ينتج تلف الرئتين والاختناق والإغماء، أو الموت. يجب أن يتم التعامل معها فقط في غطاء محرك السيارة مستخرج، ويجب ارتداء معدات الوقاية الشخصية. - يغسل كل عينة ثابتة مرتين مع برنامج تلفزيوني، كما في الخطوة 1.2، والتخلص من الحل PFA في وعاء النفايات السائلة مناسبة. إذا لزم الأمر، وتخزين العينات ECM في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية قبل إعدادهم للفحص المجهري مضان.
2. تتبع ترسب بروتين ECM التي كتبها متحد البؤر المجهري التصوير من الخلايا الحية
- عد الخلايا تحت عدادة الكريات. لCOS-7 خلايا، لوحة 250،000 الخلايا على طبق خلية ثقافة 60 ملم لترنسفكأيشن.
ملاحظة: للحصول على تصوير الخلايا الحية، يجب transfected الخلايا مع ناقلات ترميز البروتين ECM من الفائدة، تنصهر في الإطار مع يتألق المشفرة وراثياالإقليم الشمالي العلامة. هذا هو تمكين تحديد البروتين ECM من الفائدة خلال التصوير الخلية الحية. - بعد مرور فترة زمنية مناسبة للتعبير البروتين (على سبيل المثال، 16 ح) إزالة الخلايا من الطبق مع الحل التربسين-EDTA، نعدهم في عدادة الكريات، ولوحة ~ 150،000 الخلايا على طبق 35 ملم الشبكية، القاع الزجاجي للتصوير. السماح 2 ساعة للخلايا أن أعد وتبدأ ECM ترسب (والفترة الزمنية تعتمد على نوع من الخلايا، ويجب أن تنشأ تجريبيا).
ملاحظة: استخدام وسيلة الخلية التي لا تحتوي على الفينول الأحمر، وهذا يمكن أن تعطي مسحة الحمراء التي تؤثر على جودة الصورة. - خلال الفترة 2 ح أعلاه، وانشاء المجهر متحد البؤر مع C غرفة الحاضنة 37 درجة والعرض CO 2. تسمح درجة الحرارة في الغرفة وفي طبق لتحقيق الاستقرار إلى 37 درجة مئوية قبل التصوير. هذا يمكن أن يستغرق ما يصل إلى 1 ساعة.
- احتضان الخلايا مطلي على 35 مم الشبكية طبق مع علامة الخلية الفلورسنت لمدة 30 دقيقة. ثم، وغسل الخلايامرتين في الفينول مستنبت الحمراء الخالية قبل التصوير.
ملاحظة: علامة فلوري حشوية يمكن استخدامها لتصور أحجام الخلية، أو علامة، تشتمل غشاء يمكن استخدامها لتصور حواف الخلية. - باستخدام الهدف 20X والمرحلة على النقيض المجهر متحد البؤر، التعرف على ساحة شبكة المناسب الذي يحتوي على عدد (> 3) من تمسكا، الخلايا السليمة. تأكيد التعبير عن بروتين الهدف من خيار في هذه الخلايا داخل مربع الشبكة المحدد باستخدام أهداف 63X أو 100X وموجات المناسبة تحت المجهر مضان.
- إعداد مضان وعلى النقيض من المرحلة الوقت الفاصل بين التصوير باستخدام البرمجيات ض المكدس. تعيين "بيغن" كومة أن يكون أسفل طبقة ECM و "إنهاء" كومة سيكون فقط فوق جسم الخلية. تعيين حجم ض خطوة إلى 0.3 ميكرون وض حجم ما بين 5 و 10 ميكرومتر عمق في المجموع، وهذا يتوقف على نوع من الخلايا. هذا سيعطي بين 15-30 ض أقسام في نقطة زمنية.
- Capturالبريد مضان (للبروتين أحمر فلوري (RFP)، الإثارة = 555 نانومتر، والانبعاثات = 584 نانومتر) والصور على النقيض من المرحلة دوريا خلال فترة زمنية محددة. على سبيل المثال، استخدام البرنامج الوقت الفاصل بين لتعيين الفاصل الزمني في 2 دقيقة ومدة إلى 2 ساعة. حدد زر "ابدأ" لبدء الاستيلاء على القسم ض الصور على مدى فترة زمنية محددة.
- في نهاية الفترة الزمنية، وإزالة الخلايا من الطبق، كما هو موضح في الخطوات 1،1-1،5، لتأكيد توطين البروتين fluorescently الموسومة الفائدة في ECM.
- استخدام التصوير على النقيض من المرحلة والهدف 20X لنقل مربع شبكة ذات الصلة.
- التبديل إلى الهدف 63X وتحديد طبقة ECM تحت المجهر مضان. قارن هذه الصورة إلى الصورة قبل استخراج
3. إعداد العقيمة من ECM المستمدة من خلية لخلية المقايسات الفنية
- النمو السكاني واحدة من الخلايا (و"منتج مصفوفة" خلايا) coverslips على والشعبية التي أخرىlation (الخلايا "اختبار") في الثقافة المعيارية في طبق خلية ثقافة 100 ملم لمدة 24 ساعة على الأقل.
ملاحظة: يمكن أن تكون هذه أي اثنين من أنواع مختلفة من الخلايا الملتصقة، والتصميم التجريبي ويمكن أن تشمل ترنسفكأيشن من السكان واحد أو كلا خلية للتعبير عن البروتين ECM fluorescently الموسومة. - في غطاء تدفق الصفحي، كما تستخدم لزراعة الخلايا، وإعداد الحلول العقيمة من برنامج تلفزيوني من دون كا 2+ / المغنيسيوم 2+، وهيدروكسيد الأمونيوم 20 ملم (راجع الخطوة 1.3)، وغير المتأينة H 2 O عن طريق تمرير كل من خلال العقيمة 0.2 مرشح ميكرون في وعاء معقم المناسبة.
- الحفاظ على تقنية معقمة، وغسل بلطف خلايا "منتج مصفوفة" coverslips على ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني العقيمة (انظر الخطوة 1.2).
- إزالة برنامج تلفزيوني بواسطة الشفط مع ماصة معقمة والتصرف بها في حاوية النفايات السائلة مناسبة. إضافة 20 ملي هيدروكسيد الأمونيوم المعقم (3 مل / 100 طبق مم)، واحتضان لهم لمدة 5 دقائق مع هزاز على فترات.
- إضافة كميات وفيرةالعقيمة غير المتأينة H 2 O إلى طبق "منتج المصفوفة"، لا يقل عن 20 مل لكل طبق 100 ملم، مع هزاز، وتصب بعيدا المحللة الخلية في حاوية النفايات مناسبة.
- كرر الخطوة 3.5 أربع مرات أكثر لضمان الاستئصال الكامل للمادة هيدروكسيد الأمونيوم بالفاعلات.
ملاحظة: ECM المودعة من قبل خلايا "منتج مصفوفة" على لل coverslips ثم يقدم ECM عقيمة لفحوصات وظيفية مع أي خلايا اختبار الفائدة. - احتضان الخلايا اختبار من الطبق الأسهم الخلية مع 1.5 مل من محلول التربسين-EDTA لكل طبق 100 ملم (0.05٪ ث / التربسين الخامس و 0.02٪ ث / ت EDTA في محلول ملحي متوازن هانك) حتى يتم فصل الخلايا اختبار من الطبق . إضافة المتوسطة الخلية، الطرد المركزي الخلايا الاختبار في 400 x ج لمدة 5 دقائق، وإزالة السائل طاف.
- resuspend الخلايا اختبار في الطازجة والمتوسطة العقيمة والاعتماد عليها في عدادة الكريات. لوحة عددا مناسبا من هذه الخلايا اختبار على العقيمة، ECM معزولة على coversliملاحظة. ثقافة لهم في المتوسط خلية المناسب لمدة 2-3 ساعة، أو للفترة الزمنية اللازمة لتصميم تجريبي.
- لدراسة تنظيم الهيكل الخلوي الأكتين، إصلاح الخلايا اختبار في 2٪ PFA وصمة عار لهم مع ثيوسيانات فلوريسئين (FITC) -phalloidin (الإثارة = 490 نانومتر، والانبعاثات = 525 نانومتر) لتصور F-الأكتين ومع 4، 6 -diamidino-2-phenylindole (دابي، الإثارة = 358 نانومتر، والانبعاثات = 461 نانومتر) لتصور نوى 11.
ملاحظة: مقارنة التشكل وتنظيم الأكتين في الخلايا اختبار مطلي على مغاير ECM المستمدة من الخلايا بخلايا اختبار مطلي على ECM الخاصة بهم.
4. عزل ECM لSDS-PAGE، تحليل طخة مناعية، أو البروتيوميات
- تنمو الخلايا الملتصقة الفائدة على أطباق زراعة الخلايا 100 ملم (5-10 أطباق البروتينات أو 1-2 أطباق لimmunoblotting) عن 24-96 ساعة، بما يتناسب مع نوع من الخلايا، للسماح للإفراز وترسب ECM.
- إزالة الخلايا كما أن described في خطوات 1،1-1،5.
- إمالة كل لوحة في زاوية لاستنزاف H 2 O المتبقية إلى أسفل الطبق، وإزالة بعناية أي H 2 O المتبقية مع الماصة P200 حتى لوحة جافة تماما.
- في موازاة ذلك، الحرارة SDS-PAGE عينة العازلة التي تحتوي على 100 ملي dithiothreitol (DTT) إلى 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة باستخدام كتلة الحرارة، ومن ثم إضافته إلى لوحة. 200 ميكرولتر من العازلة عينة لكل لوحة 100 ملم مناسبة للعينات لفحصها من قبل طخة مناعية.
- لتحليل ECM التي كتبها الطيف الكتلي، وتحقيق نموذج أكثر تركيزا من خلال جمع عينة العازلة SDS-PAGE من الطبق (كما هو موضح في الخطوات 4.5 و 4.6 أدناه)، وإعادة تسخين الإلكتروني إلى 95 درجة مئوية، وباستخدام نفس قسامة عبر 2-3 لوحات إضافية.
- استخدام مكشطة خلية لتتخلص تماما من ECM خارج الطبق، وضمان أن جميع مجالات الطبق تم كشط.
- مع مكشطة الخلية، وجمع العينة إلى جانب واحد من الطبق وإزالته مع 200ميكرولتر ماصة في أنبوب.
- نقل أي بقايا SDS-PAGE استخراج عينة العازلة من طرف خلية مكشطة في أنبوب للحد من فقدان المواد ECM. لعينة مركزة، وإعادة تسخين نفس SDS-PAGE عينة العازلة قسامة إلى 95 درجة مئوية، وإعادة استخدام ذلك في جميع أنحاء 2-3 لوحات إضافية.
- حل البروتينات ECM التي كتبها SDS-PAGE 12، وذلك باستخدام إما 7٪ أو 4-7٪ الهلام التدرج بولي أكريلاميد.
ملاحظة: أنه لأمر مريح للاستخدام علامات البروتين قبل الملون. - لزيادة دقة من البروتينات ECM عالية الوزن الجزيئي، تمديد الوقت هلام تشغيل هذا أن 37 كيلو دالتون الوزن الجزيئي علامة تمتد على مقربة من الجزء السفلي من هلام وعلامات الوزن الجزيئي <37 كيلو دالتون وتشغيل قبالة هلام.
- لتحليل البروتين البروتينات ECM، وصمة عار الجل مع وصمة عار البروتين والتقاط صورة. قطع العصابات من الاهتمام من هلام، هضمها مع التربسين، وتحليلها من قبل الامتزاز مصفوفة بمساعدة الليزر / التأين (MALDI) الطيف -mass <سوب> 13.
- بدلا من ذلك، على تحليل أكثر شمولا للاستخراج ECM وتحليل العينة بأكملها، شريحة حارة هلام إلى أقسام، هضمها مع التربسين، وأداء السائل الطيف اللوني الشامل (LC-MS) 14.
- بدلا من ذلك، لimmunoblotting 15، ونقل البروتينات من هلام SDS-PAGE على الفلوريد (PVDF) غشاء البولي فينيل في 15 V لا يقل عن 1 ساعة 10 دقيقة (طريقة شبه الجافة) لضمان نقل البروتينات ECM عالية الوزن الجزيئي . تصور البروتين الكلي نقلها إلى الغشاء مع وصمة عار الشقائقية S.
- الخطوة التالية 4.11، استخدام أجسام مضادة لتأسيس وجود و / أو إجراء تحليل نصف الكمية من البروتينات ECM الفردية 15.
- منع الغشاء مع 2٪ (ث / ت) الحليب في TBS-توين 20 (عازلة تمنع) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. تمييع الأجسام المضادة المحددة للبروتينات ECM في عرقلة العازلة واحتضان مع غشاء مقابل 1.5 ساعة عند درجة حرارة الغرفة (الأجسام المضادة لفيبالمخفف ronectin 1/600 والأجسام المضادة لthrombospondin-1 المخفف 1/150. الجدول التكميلي 1).
- اختبار جودة من العزلة ECM من خلال إعادة التحقيق نفسها وصمة عار مع الأجسام المضادة للبروتينات الخلايا وفيرة، مثل الأكتين أو تويولين (المضادة للالأكتين المخفف 1/10000 ومكافحة تويولين المخفف 1/5000).
Representative Results
البروتوكول هو موضح في الخطوات 1،1-1،5 أعمال لإزالة الخلايا وترك وراء ECM المستمدة من الخلية. تم تنفيذ بروتوكول خارجا على COS-7 الخلايا المزروعة لمدة 96 ساعة على coverslips الزجاج، ومن ثم تم تحليل ECM المستمدة من الخلايا بواسطة المجهر مضان. علاج هيدروكسيد الأمونيوم إزالة الخلايا بشكل فعال، على النحو الذي حددته فقدان نواة الخلية والهيكل الخلوي الأكتين، وفقا لدابي وتلطيخ phalloidin، على التوالي (الشكل 1). كان استخراج الخلايا مع 2 M اليوريا يست فعالة كما هيدروكسيد الأمونيوم. تم الكشف عن آثار دابي وتلطيخ Phalloidin بعد العلاج. زيارتها 8 M اليوريا تأثير مماثل لهيدروكسيد الأمونيوم (الشكل 1). بعد ذلك تم تقديم تصور ECM المستمدة من الخلية قبل وبعد العلاج هيدروكسيد الأمونيوم (الخطوات 2،1 حتي 2،11). و transfected COS-7 خلايا مع بروتين أحمر فلوري أحادى (MRFP) -tagged thrombospondin-1 C-محطة أرتب، (mRFPovTSP1C) 11 ونمت على طبق 35 ملم مع قاعدة الزجاج الشبكية.
ساعتين بعد الطلاء، مربع شبكة مناسبة التي تحتوي على العديد من الخلايا السليمة معربا عن mRFPovTSP1C وتصور تحت المجهر متحد البؤر. وقد اتخذ صورة النقيض مرحلة المرجعية في هذا المجال، وبعد ذلك تم إجراء التصوير مضان الوقت الفاصل من كل 1 دقيقة لمدة 2 ساعة (الشكل 2A). ثم تم إزالة الخلايا باستخدام هيدروكسيد الأمونيوم، ونقل نفس مربع الشبكة على طبق إطار المرحلة على النقيض من ثم إعادة تحليلها عن طريق الفحص المجهري مضان. وكانت الخلايا لم تعد موجودة في الساحة الشبكة، لكنه بقي mRFPovTSP1C داخل ECM، الكشف عنها بواسطة الفحص المجهري مضان كما مميزة نقاط و(الشكل 2A). تم تحديد أي mRFPovTSP1C المودعة في ECM قبل إزالة الخلايا من خلال مقارنة ما قبل نمط مضان وبعد إزالة الخلايا. ونقاط والفلورسنت التي تم تحديدها في كل من الصور (فيقوإعادة 2A، arrowed سبيل المثال) والاستدلال على أن تكون مرتبطة مع ECM.
ثم تم استخدام العلاج هيدروكسيد الأمونيوم لعزل ECM الأصلي من الخلايا المستزرعة، ملتصقة. كانت تزرع الخلايا الليفية الجلدية الإنسان (اتش دي اف) على coverslips الزجاج لمدة 96 ساعة. تم إزالة الخلايا باستخدام هيدروكسيد الأمونيوم، وتم بحثها في ECM مع أنا الأجسام المضادة لمكافحة الكولاجين، التي أظهرت مميزة ييفي وتلطيخ شبكه نمط 16 (الشكل 2B). تم فحص الفيبرونكتين الزخرفة، غير permeabilized الخلايا الثابتة على الفئران غضروفية (RCS) وداخل ECM بعد إزالة الخلايا RCS (الشكل 2C). وجرى عزل هيدروكسيد الأمونيوم من ECM أيضا تحت ظروف معقمة بحيث خلايا "اختبار" يمكن إعادة مطلي-على ECM لالمظهرية أو الدراسات الوظيفية. على سبيل المثال،-COS 7 تم مطلي "اختبار" الخلايا لمدة 2 ساعة على ECM العقيمة التي تنتجها الخلايا RCS، ورالدجاجة التي كانت ثابتة، permeabilized، وتحليلها لمنظمة F-أكتين من تلطيخ FITC-phalloidin، بالمقارنة مع COS-7 الخلايا المنتجة ECM الخاصة بهم (الخطوات 3،1-3،9) (الشكل 3).
وعلى نطاق أوسع، واستخدمت طريقة لعزل ECM لإجراءات البيوكيميائية. على سبيل المثال، ما نمت الخلايا RCS على اثنين من أطباق زراعة الخلايا 100 ملم لمدة 7 أيام، وكانت الإجراءات المتبعة في خطوات 4،1-4،7. تم جمع البروتينات في ECM المستمدة من الخلايا عن طريق كشط لهم في عينة العازلة SDS-PAGE الساخن وفصلوا من قبل SDS-PAGE على هلام بولي أكريلاميد 7٪ تحت الحد الظروف. كانت ملطخة هلام للبروتين، وكانت أربعة نطاقات رئيسية عزل كل وتحليلها بواسطة مطياف الكتلة (الشكل 4A). وقد تم التعرف على عدد من البروتينات ECM، بما في ذلك فبرونيكتين، thrombospondin 1 (TSP1)، thrombospondin 5 / الغضروف بلازميدة قليلة القسيمات البروتين مصفوفة (TSP5 / COMP)، وmatrilin-1 (الشكل 4B).
بدلا من ذلك، الاستعدادات على نطاق أصغر من ECM يمكن تقييمها من قبل immunoblots. على سبيل المثال، المشتقة من خلية ECM من الخلايا COS-7 معربا عن ectopically كان mRFPovTSP1C مفصولة SDS-PAGE، ونقل إلى غشاء PVDF، وبحث عن طلب تقديم العروض مع الأجسام المضادة لمكافحة طلب تقديم العروض (الشكل 4C). هذه التقنية حساسة بما يكفي للكشف عن الاختلافات في ترسب بين أرتب الأصلي من TSP1 (mRFPovTSP1C) وهندستها مخموس المنطقة TSP1 C-محطة (MRFP-TSP-5-1C) 17 (الشكل 4C). للتحقيق في ECM الذاتية من HDF، تم فحص وجود بروتينات معينة في الخلايا المحللة أو ECM المعزول immunoblotting. تم الكشف عن ومميزة البروتينات ECM فبرونيكتين وthrombospondin-1 في ECM، في حين أن وفرة البروتينات داخل الخلايا α تويولين وβ أكتين كانت غائبة عن ECM معزولة (الشكل 4D).
EP-together.within الصفحات = "1"> 
الشكل 1: مقارنة بين طرق إزالة الخلية. وقد نمت COS-7 الخلايا في كثافة عالية لمدة 96 ساعة coverslips على، ثابتة في 2٪ PFA، وpermeabilized في 0.5٪ تريتون X100، أو يعاملون كما هو مبين لإزالة الخلايا. ثم تم ملطخة Coverslips مع FITC-phalloidin لتصور F-الأكتين ودابي لتصور النوى. شريط النطاق = 25 ميكرون. تم تعديل هذا الرقم من المنشور الأصلي في مجلة علم الخلية 11. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تحديد ECM البروتينات في ECM معزولة. (أ) مرحلة التباين ومضان صورCOS-7 الخلايا معربا عن mRFPovTSP1C ونمت على طبق 35 ملم مع قاعدة القاع الزجاجي الشبكية لمدة 2 ساعة. وتظهر الصور قبل وبعد إزالة الخلايا عن طريق هيدروكسيد الأمونيوم. يشار إلى حافة إلكتروني الشبكة في الصور على النقيض من المرحلة مع خط منقط. وتشير السهام البيضاء أمثلة على نقاط والفلورسنت التي كانت موجودة قبل وبعد إزالة الخلايا. (ب) كشف الكولاجين أنا في HDF ECM المناعي غير المباشر. كانت تزرع HDF لمدة 96 ساعة وإزالتها مع هيدروكسيد الأمونيوم، وكانت ملطخة إدارة المحتوى في المؤسسة لI. ييفي الكولاجين البشري وملطخة ECM أيضا مع FITC مترافق المضادة للأرنب الضد الثانوية وحدها. (C) توطين الفيبرونكتين حول الخلايا RCS أو داخل معزولة RCS ECM، والكشف المناعي غير المباشر. ما نمت الخلايا RCS لمدة 48 ساعة، ثابتة في 2٪ PFA، وملطخة للفبرونيكتين ومع دابي. في أطباق موازية، وإزالة الخلايا مع هيدروكسيد الأمونيوم 20 ملم وكانت ملطخة ECM لfibronectin ومع دابي. تم صبغ الخلايا أيضا مع FITC مترافق الأضداد المضادة للماوس مفتش وحدها. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3: استخدام معقم ECM للدراسات وظيفية. وقد نمت RCS "مصفوفة منتج" الخلايا لمدة 48 ساعة على coverslips الزجاج وبعد ذلك تعامل مع هيدروكسيد الأمونيوم 20 ملم تحت ظروف معقمة لإزالة الخلايا. كانت مطلية COS-7 خلايا "اختبار" coverslips على مع أو بدون معزولة RCS ECM لمدة 2 ساعة، ثابتة في 2٪ PFA، permeabilized في 0.5٪ تريتون X100، وملطخة FITC-phalloidin لتصور F-الأكتين ودابي لتصور النوى . انتشرت COS-7 خلايا مطلي على RCS ECM أكثر على نطاق واسع وشكلت حزم خييط كبيرة (arrowed سبيل المثال) وحافة رافليه. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تحديد البروتينات من ECM المعزولة بواسطة SDS-PAGE، الطيف الكتلي، أو Immunoblotting. كانت تزرع (أ) الخلايا RCS لمدة 7 أيام وإزالتها مع هيدروكسيد الأمونيوم 20 ملم. تم كشط ECM تصل إلى عينة العازلة الساخنة SDS-PAGE تحتوي على 100 ملي DTT. تم فصل إعداد ECM التي كتبها SDS-PAGE على هلام بولي أكريلاميد 7٪ تحت الحد الظروف. وقد تم تحديد أربعة فرق كبيرة (الأسهم 1-4) من خلال تلطيخ البروتين. وقد تم تحديد (ب) البروتينات من RCS العصابات ECM 1-4 قبل MALDI مطياف الكتلة. (C) COS-7 الخلايا معربا إما mRFPovTSP1C (أرتب) أو MRFP-TSP-5-1C (مخموس) كانت تربيتها لمدة 48عزلت ساعة وإزالتها مع 20 ملي هيدروكسيد الأمونيوم، وكان ECM إلى عينة العازلة الساخنة SDS-PAGE تحتوي على 100 ملي DTT. تم فصل إعداد ECM التي كتبها SDS-PAGE على هلام بولي أكريلاميد 7٪ في ظل ظروف الحد، ونقل إلى غشاء PVDF، وسبرت مع الأجسام المضادة لمكافحة طلب تقديم العروض. تم تعديل هذا الفريق من المنشور الأصلي في تقارير العلوم البيولوجية 17. كانت تزرع (D) HDF لمدة 96 ساعة وبعد ذلك تعامل سواء مع حمض deoxycholic 2٪ في برنامج تلفزيوني (خلية المحللة) أو مع هيدروكسيد الأمونيوم 20 ملم لإزالة الخلايا. تم كشط ECM إلى عينة العازلة SDS-PAGE الساخن. تم فصل أجزاء اثنين من SDS-PAGE على هلام بولي أكريلاميد 10٪ في ظل ظروف الحد، ونقل إلى غشاء PVDF، وبحث مع الأجسام المضادة، كما هو محدد. في كل لوحة، يشار إلى مواقف علامات الوزن الجزيئي في كيلو دالتون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذه فايجوري.
Discussion
خطوات حاسمة في إطار بروتوكول
طريقة لديه بعض الخطوات الحاسمة التي يجب اتباعها لضمان العزلة الناجحة وتحليل ECM. على سبيل المثال، يتم استخدام هيدروكسيد الأمونيوم لإزالة الخلايا وعزل ECM للتحليل. على الرغم من هيدروكسيد الأمونيوم مستقرة في المحاليل المائية في الظلام ويمكن تخزين في درجة حرارة الغرفة، زجاجات يجب بإحكام إعادة مختومة بين كل استعمال. لأن الغاز قد تتبخر من الحل، مما يقلل من تركيز، ونحن نوصي بشدة البدء في زجاجة جديدة كل 6-8 أسابيع. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي أن يكون الحل العمل حديثا لكل تجربة. ومن الضروري أيضا أن الخلايا تتم إزالة بشكل كامل مع يغسل وفيرة في دي المتأينة المياه. إذا لم يتم تنفيذ هذه الخطوات على نحو كاف، قد تبقى المواد الخلوية على طبق وتلوث التحليلات المصب. إذا تم نمت الخلايا لمدة 10 يوما أو أكثر، قد تكون هناك حاجة إلى الماء يغسل إضافية. من المهم أن نالمؤسسة التجارية العمانية أن طبقة ECM معزولة عادة رقيقة جدا بالمقارنة مع الخلايا 11، لذلك هناك حاجة إلى الحذر عند تحديد ECM أثناء التصوير. لاستخراج الفعال للECM معزولة في عينة العازلة SDS-PAGE، فمن الضروري أن المخزن المؤقت عينة يحتوي على عامل مختزل. لإزالة الأكثر فعالية لإدارة المحتوى في المؤسسة، يجب استخدام المغلي الساخنة عينة العازلة. لالتجارب التي ستحل عينات ECM من قبل الكهربائي SDS-PAGE لتلطيخ البروتين أو البروتينات، فمن الأهمية بمكان لتحقيق عينة مركزة عن طريق كشط عدة لوحات قيمتها من ECM في نفس قسامة من عينة العازلة.
التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها
إنتاج وإفراز البروتينات ECM يمكن أن تختلف بشكل كبير بين أنواع الخلايا، لذلك الفترات الزمنية لإفراز وترسب ECM وينبغي أن تحدد من جديد لكل نوع من الخلايا. ومن المهم أيضا أن ندرك أن تكوين ECM ستتغير حيوي بالنسبة رس كثافة الخلايا والوقت في الثقافة 18. ينبغي أن تؤخذ هذه العوامل في الاعتبار عند تصميم التجارب. ومن الواضح أن اختيار نوع من الخلايا لهذا الأسلوب هو المهم، وخاصة عند استخراج ECM لتحليلها من قبل مطياف الكتلة، والتي قد تتطلب كمية كبيرة من البروتين الكلي ECM.
القيود المفروضة على تقنية
والخلايا التي تفرز مستويات منخفضة جدا من البروتينات ECM أن يكون أكثر تحديا للاستخدام مع هذا الأسلوب. الخلايا غير ملتصقة والثقافات خلية 3D، أو المقايسات غزو الخلايا غير مناسبة في الوقت الحاضر لعزل ECM بواسطة هذه الطريقة. هذه الطريقة الأنسب للاستخدام مع معيار "2-الأبعاد" مزارع الخلايا. لأن استخراج هيدروكسيد الأمونيوم يزيل الخلايا تماما، ECM ترتبط مع الجانبين العلوي من الخلايا وإفراز، ولكن غير عبر ربط، وأيضا إزالة البروتينات ECM، وترك على طبق طبقة رقيقة من ECM تجميعها من تحت وحول الأسس من الخلايا 11،17
أهمية تقنية مع الاحترام لالحالية / الطرق البديلة
القدرة على إجراء مجموعة واسعة من التجارب مع ECM معزولة مهمة في سياق بيولوجيا الخلية وعلم وظائف الأعضاء الأنسجة، ولها أيضا انعكاسات على مجالات ترميم الأنسجة وهندسة الأنسجة. طريقة مزاياه على المواد الهلامية التي تشكلت من الكولاجين المنقاة أو غيرها من البروتينات ECM النقي في أن الخلايا تجميع الهياكل ECM المعقدة في حجمها الأصلي، مع آليات عبر ربط الأم ومع بروتينات ECM الفردية موجودة في النسب المناسبة لنوع الخلية الأصلية. على سبيل المثال، أظهرت دراسة البروتين من RCS ECM matrilins وفيرة وCOMP / TSP5، كما هو متوقع لوECM الغضروفية 19،20 (الشكل 4). بشكل عام، ويعوق تحليل ECM المستمدة من الخلايا بحكم طبيعته باعتباره، شبكة متعددة البروتين واسعة النطاق التي ينتج في يشابك التساهمية والذوبان من العديد من البروتينات ECM، وأيضا من خلال التلوث المحتمل للECM مقتطفات مع البروتينات داخل الخلايا. إجراء متعدد خطوة تهدف إلى عزل جزء ECM من الأنسجة لتحليل البروتين أسفرت عن 8٪ من البروتينات ECM في مجموعة مجموع من البروتينات التي تم تحديدها 21. ومع ذلك، كانت الببتيدات من البروتينات ECM 73٪ من إجمالي الببتيدات التي تم تحديدها. هذه طريقة لعزل وتحليل ECM المستمدة من الخلايا بسرعة وبشكل موثوق يزيل المواد الخلوية مع الإبقاء على البروتينات ECM. هذه الطريقة يمكن استخدامها لمجموعة من أنواع الخلايا والتطبيقات المصب ويسهل تحليل البيولوجيا ECM وخلية ECM التفاعلات في زراعة الخلايا. لدينا بروتوكولات بالتفصيل كيف يمكن تطبيق الطريقة على مختلف المستويات لمعالجة مجموعة واسعة من إكسبالأسئلة erimental فيما يتعلق منظمة ECM، وديناميات، أو تكوينها، والآثار الفنية من ECM معزولة عن الخلايا.
التطبيقات المستقبلية أو الاتجاهات بعد اتقان هذه التقنية
وبالنظر إلى المستقبل، يمكن تكييفها طريقة للاستخدام مع الثقافات خلية 3D. هذا من شأنه توسيع أهميتها الفسيولوجية. الأنسجة الأم Decellularized لديها امكانات كبيرة كما سقالة لتجديد الأنسجة المفقودة أو التالفة وكبديل لزراعة الأعضاء، مثل القلب بعد فشل 22. لديه القدرة على التغلب على مشاكل توافر المانحة وimmunorejection. التطبيقات المستقبلية للطريقة المبينة في هذا التقرير أن التحقيق في الاستخدام مع الثقافات خلية 3D أو decellularization الأنسجة، والتي من شأنها زيادة نطاق هذا النهج.
Acknowledgments
ونحن في غاية الامتنان للدكتور بليندا ويلارد، البروتيوميات ومختبر الايض، معهد بحوث ليرنر، كليفلاند كلينك، لإجراء تحليل البروتينات من RCS ECM. ونحن نعترف بدعم مالي من مجلس البحوث theMedical المملكة المتحدة، منح عدد K018043، لJCA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody to COL1A1 | Novus | NB600-408 | Rabbit polyclonal. Reacts with other fibrillar collagens as well as collagen I. IF: 1/200 |
| Antibody to fibronectin | Sigma | F3648 | Rabbit polyclonal. WB: 1/600 for 1.5 h. IF: 1/200 |
| Antibody to thrombospondin 1 | ThermoFisher | MA5-13398 | Mouse monoclonal clone A6.1. WB: 1/150 for 1.5 h |
| Antibody to RFP | Abcam | ab62341 | Rabbit polyclonal. WB: 1/2,000 for 2 h |
| Antibody to β-actin | Sigma | A1978 | Mouse monoclonal clone AC-15. WB: 1/10,000 for 1.5 h |
| Antibody to α-tubulin | Sigma | T9026 | Mouse monoclonal clone DM1A. WB: 1/5,000 for 1.5 h |
| Cell Tracker Green | ThermoFisher | C2925 | Fluorescent cell marker. Use at 1 µM for 30 min |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC)-Phalloidin | Sigma | P-5282 | Stock = 50 mg/mL in DMSO. 1/50 for 45 min |
| FITC-conjugated goat anti-mouse IgG | Sigma | F8771 | IF: 1/50 for 1 h |
| FITC-conjugated sheep anti-rabbit IgG | SIgma | F7512 | IF: 1/50 for 1 h |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse IgG | LI-COR | 926-80010 | WB: 1/50,000 for 1 h |
| HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG | LI-COR | 926-80011 | WB: 1/100,000 for 1 h |
| Vectorshield mounting medium with DAPI | Vector | H-1200 | Store at 4 °C in the dark |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma | D6429 | Warm before use |
| Fibroblast growth medium | PromoCell | C-23010 | Warm before use, supplement with 50 µg/mL ascorbic acid |
| Phenol red-free DMEM | ThermoFisher | 21063-029 | Warm before use |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | Warm before use |
| Gridded glass-bottomed dish | MatTek | P35G-2-14-C-GRID | |
| NH4OH, 28-30% solution | Sigma | 221228 | Dilute to 20 mM in de-ionised water. Once opened store in the dark, tightly capped. |
| Paraformaldehyde, 16% solution | Alfa Aesar | 43368 | Dilute to 2% (v/v) in PBS |
| Deoxycholic acid | Sigma | D2510 | Use at 2% (v/v) final concentration |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Dilute to 0.5% (v/v) final concentration |
| GelCode Blue stain reagent | ThermoFisher | 24590 | Protein stain for SDS-PAGE gels |
| Precision Plus protein standards | Biorad | 161-0374 | Protein standards for SDS-PAGE gels |
| Trans-Blot SD Semi Dry transfer cell | Biorad | 1703940 | Efficient transfer of high molecular weight proteins |
| PVDF transfer membrane | Millipore | ISEQ00010 | Immobilon-PSQ |
| Ponceau S stain | Sigma | P7170 | Reversible protein stain for PVDF membrane |
| WesternSure Enhanced chemiluminescence (ECL) substrate | LI-COR | 926-80200 | |
| High performance chemiluminescence film | GE Healthcare | 28906837 | |
| Sterile filtration unit, MILLEX-GV | Millipore | ML481051 | |
| SP8 AOBS confocal laser scanning microscope | Leica | Environmental chamber needed for temperature and CO2 control (Life Imaging Services) | |
| Key: IF, Immunofluorescence; WB, Western Blot | |||
References
- Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 786-801 (2014).
- Hynes, R. O., Naba, A. Overview of the matrisome--an inventory of extracellular matrix constituents and functions. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4, a004903 (2012).
- Gross, J., Highberger, J. H., Schmitt, F. O. Extraction of Collagen from Connective Tissue by Neutral Salt Solutions. Proc Natl Acad Sci U S A. 41, 1-7 (1955).
- Hellewell, A. L., Adams, J. C. Insider trading: Extracellular matrix proteins and their non-canonical intracellular roles. Bioessays. 38, 77-88 (2016).
- Li, D., Yang, W., Li, G. Y. Extraction of native collagen from limed bovine split wastes through improved pretreatment methods. Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 83, 1041-1048 (2008).
- Strawich, E., Nimni, M. E. Properties of a collagen molecule containing three identical components extracted from bovine articular cartilage. Biochemistry. 10, 3905-3911 (1971).
- Kim, B. S., et al. Human collagen isolated from adipose tissue. Biotechnol Prog. 28, 973-980 (2012).
- Barallobre-Barreiro, J., Didangelos, A., Yin, X., Domenech, N., Mayr, M. A sequential extraction methodology for cardiac extracellular matrix prior to proteomics analysis. Methods Mol Biol. 1005, 215-223 (2013).
- Carter, W. G. Transformation-dependent alterations is glycoproteins of extracellular matrix of human fibroblasts. Characterization of GP250 and the collagen-like GP140. J Biol Chem. 257, 13805-13815 (1982).
- Sechler, J. L., Takada, Y., Schwarzbauer, J. E. Altered rate of fibronectin matrix assembly by deletion of the first type III repeats. J Cell Biol. 134, 573-583 (1996).
- Adams, J. C., Bentley, A. A., Kvansakul, M., Hatherley, D., Hohenester, E. Extracellular matrix retention of thrombospondin 1 is controlled by its conserved C-terminal region. J Cell Sci. 121, 784-795 (2008).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Hillenkamp, F., Karas, M. Mass spectrometry of peptides and proteins by matrix-assisted ultraviolet laser desorption/ionization. Methods Enzymol. 193, 280-295 (1990).
- Davis, M. T., et al. Automated LC-LC-MS-MS platform using binary ion-exchange and gradient reversed-phase chromatography for improved proteomic analyses. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 752, 281-291 (2001).
- Burnette, W. N. "Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal Biochem. 112, 195-203 (1981).
- Soucy, P. A., Werbin, J., Heinz, W., Hoh, J. H., Romer, L. H. Microelastic properties of lung cell-derived extracellular matrix. Acta Biomater. 7, 96-105 (2011).
- Hellewell, A. L., Gong, X., Scharich, K., Christofidou, E. D., Adams, J. C. Modulation of the extracellular matrix patterning of thrombospondins by actin dynamics and thrombospondin oligomer state. Biosci Rep. 35, (2015).
- Mumby, S. M., Abbott-Brown, D., Raugi, G. J., Bornstein, P. Regulation of thrombospondin secretion by cells in culture. J Cell Physiol. 120, 280-288 (1984).
- Myllyharju, J. Extracellular matrix and developing growth plate. Curr Osteoporos Rep. 12, 439-445 (2014).
- Roughley, P. J. Articular cartilage and changes in arthritis: noncollagenous proteins and proteoglycans in the extracellular matrix of cartilage. Arthritis Res. 3, 342-347 (2001).
- Naba, A., et al. The matrisome: in silico definition and in vivo characterization by proteomics of normal and tumor extracellular matrices. Mol Cell Proteomics. 11, M111 014647 (2012).
- Sanchez, P. L., et al. Acellular human heart matrix: A critical step toward whole heart grafts. Biomaterials. 61, 279-289 (2015).
